丹參酮IIA對新生大鼠缺氧缺血性腦損傷時低氧誘導(dǎo)因子1α基因表達的影響

陳晨，王利玲

浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院兒科，浙江 杭州 310000

新生兒缺氧缺血性腦損傷(Hypoxia ischemic brain damage，HIBD)是導(dǎo)致新生兒死亡及小兒致殘的主要疾病之一?，F(xiàn)代醫(yī)學對HIBD的治療無特效治療方案，多采用亞低溫[1]及對癥支持治療。目前已有研究表明丹參酮IIA(Tanshinone IIA，TSA)對改善HIBD有顯著療效[2]，而細胞缺氧時，低氧誘導(dǎo)因子-1α(Hypoxia-Inducible Factor-1α，HIF-1α)基因的表達會增加，對恢復(fù)細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)起著重要的作用。本文將通過研究驗證新生大鼠HIBD時，TSA在改善腦代謝作用上與HIF-1α基因表達存在的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 實驗所用新生大鼠為親代大鼠交配生產(chǎn)所得的7日齡健康SD大鼠(親代SD大鼠購于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司)，共60只，體質(zhì)量為(14±2)g，雌雄不限，動物合格證號：SYXK(浙)2008-0015。飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心清潔級玻璃艙內(nèi)，飼養(yǎng)溫度18～22℃，濕度為45%～65%。

1.2 實驗藥物 丹參酮IIA磺酸鈉(商品名：諾新康)，購自上海第一生化藥業(yè)有限公司，批號為120116，規(guī)格為2mL/10mg。

1.3 主要試劑 RT-PCR主要試劑：總RNA提取試劑(D9108B)、定量反轉(zhuǎn)錄試劑盒(DRR 037A)、熒光定量PCR試劑盒(DRR 420A)均由杭州皓豐生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；HIF-1α及甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)上下游引物由TAKARA公司設(shè)計、合成及生產(chǎn)。免疫組化主要試劑：SD大鼠HIF-1α抗體由浙江俊豪生物有限公司生產(chǎn)；兔二抗試劑由浙江俊豪生物有限公司生產(chǎn)。

1.4 動物分組及模型制備 按照隨機數(shù)字表法將60只SD大鼠隨機分5組：假手術(shù)組、模型組、低劑量治療組、中劑量治療組、高劑量治療組，每組各12只。圍產(chǎn)期HIBD大鼠模型制備依據(jù)Rice JE等[3]的方法造模。先經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛麻醉(3 mL/kg)；用滅菌絲線結(jié)扎左頸總動脈，復(fù)位皮下組織，縫合切口；術(shù)后送回母鼠身邊休息2 h。其中假手術(shù)組麻醉后游離左頸總動脈而不結(jié)扎，復(fù)位皮下組織，縫合切口。治療組造模后，以丹參酮IIA磺酸鈉腹腔注射。

1.5 給藥方法 假手術(shù)組、模型組分別予3.2 mL/100 g 5%葡萄糖(TSA注射液溶劑)腹腔注射；高、中、低劑量治療組TSA給藥劑量依次為3.2 mL/100 g(160 mg/kg)、1.6 mL/100 g(80 mg/kg)、0.8 mL/100 g(40 mg/kg)，另外分別予 0 mL/100 g、1.6 mL/100 g及2.4 mL/100 g 5%葡萄糖平衡液體總量。術(shù)后休息3 h后開始注射，早晚各1次，連續(xù)3天。

1.6 各組大鼠行為觀察 觀察各組大鼠造模前后及治療后神經(jīng)系統(tǒng)(煩躁、嗜睡或精神抑制)、呼吸系統(tǒng)(呼吸快慢)、運動系統(tǒng)(刻板運動，不自主顫動，抽搐等)的行為改變。

1.7 各組大鼠各指標檢測方法 取出各組大鼠左側(cè)腦組織，分2份，1份放入凍存管內(nèi)，置于液氮冷藏，移至-80℃冰箱內(nèi)備用；另1份置于10%福爾馬林溶液內(nèi)，室溫固定24 h。用熒光定量PCR方法檢測各組HIF-1α的表達，采用HE染色方法觀察腦組織病理變化，HIF-1α原位免疫組織化學標記染色，顯微鏡下進行陽性表達對比。

1.8 統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析，所得到的計量資料以(±s)來表示。若各組間方差齊，則采用單因素方差分析，兩兩比較用Tukey HSD檢驗；若各組間方差不齊，則采用非參數(shù)檢驗Tamhane's T2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠行為學指標觀察結(jié)果 假手術(shù)組術(shù)后無明顯行為改變。模型組及治療組在造模后7～18 min，表現(xiàn)出躁動不安、呼吸深快、肢體顫抖等；造模后19～60 min，表現(xiàn)出對刺激反應(yīng)減弱、呼吸淺快、四肢活動減少、肌張力下降等；造模后1～3天，上述行為改變開始逐漸恢復(fù)。腹腔注射后觀察3天，治療組比模型組的行為表現(xiàn)恢復(fù)快，且TSA劑量越高，恢復(fù)越好。

2.2 各組大鼠腦組織HE染色結(jié)果比較 見圖1。假手術(shù)組大鼠海馬區(qū)及皮層神經(jīng)細胞胞核大，胞漿少，無水腫，細胞排列有序，細胞間隙緊密，未見細胞缺失；模型組則神經(jīng)細胞出現(xiàn)水腫，呈氣球樣變，胞核固縮，呈圓形，部分細胞核碎裂、溶解、消失，細胞碎片較多，并伴有炎癥細胞浸潤，細胞排列紊亂，細胞間隙明顯增大，缺失明顯，失去正常組織結(jié)構(gòu)。與模型組比較，低劑量治療組神經(jīng)細胞腫脹稍減輕，細胞變形不明顯，部分細胞核碎裂、溶解、消失，細胞碎片散在分布于細胞間質(zhì)，有膠質(zhì)細胞浸潤，細胞排列紊亂，稍規(guī)則，細胞間隙增大，正常組織結(jié)構(gòu)被破壞；中劑量治療組神經(jīng)細胞水腫減輕，核小而圓，胞漿大而空，部分細胞呈多邊形，細胞死亡數(shù)目較少，部分核溶解、消失，細胞間隙的細胞碎片較少，細胞排列紊亂，較規(guī)則，細胞間隙大，可見細胞缺失；高劑量治療組神經(jīng)細胞水腫以輕度為主，細胞氣球樣變不明顯，細胞排列明顯較規(guī)則，間隙輕度增大，細胞缺失不明顯。

圖1 各組大鼠腦組織HE染色結(jié)果比較 (×200)

2.3 各組大鼠腦組織HIF-1α表達結(jié)果比較 見圖2。假手術(shù)組大鼠腦組織中HIF-1α僅少量表達，偶可見棕黃色HIF-1α陽性細胞。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織中HIF-1α陽性細胞明顯減少，散在分布于視野中。與模型組比較，低劑量治療組大鼠腦組織中HIF-1α陽性細胞較密集，分布較均勻；與低劑量組比較，中劑量治療組大鼠腦組織中HIF-1α陽性細胞分布更密集，更均勻；高劑量治療組HIF-1α表達明顯增多，HIF-1α陽性細胞大量密集均勻分布于腦組織中，海馬、皮質(zhì)均可見陽性細胞。

圖2 各組大鼠腦組織HIF-1α表達結(jié)果比較 (×200)

2.4 各組大鼠腦組織HIF-1α基因表達結(jié)果比較 見表1。假手術(shù)組HIF-1α基因僅少數(shù)表達，與假手術(shù)組比較，模型組表達明顯增加(P＜0.05)；與模型組比較，低、中、高劑量治療組基因表達增加，且呈一定的劑量依賴性(P＜0.05)。

表1 各組大鼠腦組織HIF-1α基因相對表達結(jié)果比較(±s)

表1 各組大鼠腦組織HIF-1α基因相對表達結(jié)果比較(±s)

與假手術(shù)組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05；與低劑量組比較，③P＜0.05；與中劑量組比較，④P＜0.05

組 別假手術(shù)組模型組低劑量治療組中劑量治療組高劑量治療組n 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 H I F-1 α基因相對表達量(R Q值)0.1 2 1±0.0 4 0 0.7 0 0±0.2 2 5①1.0 0 6±0.1 3 7②④1.3 7 8±0.2 3 5②③1.6 8 0±0.1 6 3②③④

3 討論

HIBD的發(fā)病與多種因素有關(guān)，妊娠和分娩都可以導(dǎo)致該病的發(fā)生[4]。從缺氧缺血開始到腦細胞損傷經(jīng)歷了2個階段[5]，第一個階段為代償階段，此時并不發(fā)生腦細胞的損傷，而是通過增加糖酵解、增加血紅蛋白含量和減少細胞氧消耗等途徑來增加腦細胞對氧的利用能力，增強腦細胞對缺氧的耐受能力。第二階段為損傷階段，如果缺氧缺血持續(xù)存在，則會超過腦細胞的代償范圍，而發(fā)生缺氧缺血性損傷。缺氧缺血主要對腦細胞的線粒體、膜結(jié)構(gòu)和溶酶體造成損傷，具體機制與氧自由基的大量產(chǎn)生、鈣鹽的沉積、細胞膜2側(cè)離子濃度的紊亂和磷脂酶的活化有關(guān)。通過以上機制，線粒體的功能受到影響、膜結(jié)構(gòu)被破壞、通透性改變、溶酶體內(nèi)的蛋白水解酶外溢，造成細胞的損傷，甚至死亡。因此，若能阻斷以上途徑，便可減少腦細胞損傷的發(fā)生，增強細胞對缺氧的耐受性。

HIBD在中醫(yī)兒科學無相應(yīng)的病名，根據(jù)癥狀表現(xiàn)不同，可以歸入嘔吐、驚風等范疇，可參考中風對其進行辨證。中醫(yī)辨證上總屬為本虛標實，急性期以血瘀為主，氣虛為次，緩解期以本虛氣虛為主，血瘀為其次。而在治療上，多采用具有活血化瘀、調(diào)經(jīng)通絡(luò)等功效的藥物，使用最多的藥物之一是丹參。《神農(nóng)本草經(jīng)》中記載：“丹參，味苦微寒無毒，主治心腹邪氣，腸鳴幽幽如走水，寒熱積聚，破癥除瘕，止煩滿，益氣”，由此可見，中藥丹參具有活血調(diào)經(jīng)，祛瘀止痛，涼血消癰，清心除煩及安神的功效。藥學研究表明丹參中最主要的脂溶性成分是TSA，含量約為0.1%～0.9%[6]，隨著對丹參及其有效成分的深入研究，國內(nèi)外學者發(fā)現(xiàn)中藥丹參在治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮著越來越大的作用，而TSA作為丹參中重要的脂溶成分，也發(fā)揮了重要的作用。研究表明，TSA可抑制鈣轉(zhuǎn)運和減少細胞內(nèi)游離鈣離子的濃度[7]，可抑制人腦微血管內(nèi)皮細胞的絲裂原活化蛋白激酶活化，保護丙酮醛誘導(dǎo)的細胞損傷[8]，還能減少血小板的聚集，阻斷再灌注過程中微血栓的形成，改善血液供應(yīng)，防止繼發(fā)性再灌注損傷的發(fā)生[9]。

低氧誘導(dǎo)因子-1(Hypoxia-Inducible Factor-1，HIF-1)是一種隨著細胞內(nèi)氧濃度變化而調(diào)控相關(guān)基因表達的核轉(zhuǎn)錄因子，為真核生物轉(zhuǎn)錄因子螺旋環(huán)螺旋-PAS蛋白家族成員，由2個亞基組成，α亞基和β亞基，α亞基為主要的活性單位，氧對HIF-1的活性調(diào)節(jié)主要通過該亞基完成。HIF-1是低氧耐受時相關(guān)基因表達的調(diào)節(jié)中心，在恢復(fù)細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面起到主要作用。正常情況下各組織HIF-1α表達很少，而低氧可以增加其穩(wěn)定性和活性，其表達呈時序性和低氧濃度依賴性[10～12]。

本研究以新生大鼠為模型，通過研究TSA干預(yù)HIBD，發(fā)現(xiàn)TSA能顯著改善腦細胞水腫、變性，減少細胞核碎裂，減少組織細胞缺失，減少炎癥細胞浸潤，明顯改善組織細胞的缺氧缺血性病變，并且其改善效果與TSA的劑量呈正相關(guān)。關(guān)于TSA與腦細胞中HIF-1表達量的關(guān)系目前研究較少，筆者通過實驗證實TSA能通過上調(diào)HIF-1α基因的表達、促進下游基因表達來改善HIBD，發(fā)揮對新生大鼠腦組織損傷保護的作用，證實了TSA治療HIBD的分子機制，為臨床上TSA防治HIBD提供了有力的理論依據(jù)。