CCL18介導(dǎo)腫瘤微環(huán)境趨化因子網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)致卵巢癌不良預(yù)后的研究

湯鈺琪 于紅靜 石麗君 鄒玉鵬 馮雁 王琪

血清CC趨化因子配體18（CC-chemokine ligand 18，CCL18）是屬于CC趨化因子家族的小細(xì)胞因子，主要由固有免疫系統(tǒng)產(chǎn)生，可影響機(jī)體適應(yīng)性免疫。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)由CCL18和CXC趨化因子1（CXC chemokine ligand 1，CXCL1）聯(lián)合建立的卵巢癌診斷模型的靈敏度和特異度均超過(guò)90%，明顯優(yōu)于CA125檢測(cè)，對(duì)篩查早期卵巢惡性腫瘤或監(jiān)測(cè)病程具有潛在的臨床價(jià)值［1］。后續(xù)的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，卵巢上皮癌細(xì)胞株（SKOV3）轉(zhuǎn)染 CCL18后可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞在活體內(nèi)外轉(zhuǎn)移和侵襲，但對(duì)細(xì)胞增殖能力影響不大［2］。

既往研究發(fā)現(xiàn)上皮來(lái)源的腫瘤細(xì)胞具有表達(dá)特定趨化因子受體功能［3］。腫瘤細(xì)胞及腫瘤相關(guān)間質(zhì)細(xì)胞可通過(guò)自分泌或旁分泌方式分泌多種趨化因子及受體，不同增殖、轉(zhuǎn)移潛能的腫瘤細(xì)胞可表達(dá)不同的趨化因子及受體譜［4］。腫瘤微環(huán)境中的趨化因子及受體網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)在卵巢癌細(xì)胞存活、轉(zhuǎn)移中有重要作用，因此我們推測(cè)CCL18可能通過(guò)調(diào)控不同的趨化因子及受體網(wǎng)絡(luò)，激活相關(guān)下游信號(hào)通路，從而參與卵巢癌的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移，影響患者預(yù)后。本研究擬分析CCL18過(guò)表達(dá)卵巢上皮癌細(xì)胞SKOV3中其他趨化因子及受體的網(wǎng)絡(luò)互作，探討CCL18對(duì)卵巢癌微環(huán)境及預(yù)后的影響。

1 材料與方法

1.1 主要設(shè)備和試劑

實(shí)時(shí)熒光定量PCR購(gòu)自美國(guó)ABI公司，Bio-plex 200儀器購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，DMEM高糖購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司，TRIzol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，SupermoⅢM-MLV Reverse Transcriptase逆轉(zhuǎn)錄酶RNA購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司，CCL18單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，微球包被試劑盒購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

卵巢上皮癌細(xì)胞（SKOV3）、空載對(duì)照細(xì)胞（SKOV3-GFP）、穩(wěn)定過(guò)表達(dá)CCL18卵巢上皮癌細(xì)胞（SKOV3-GFP-CCL18）均為本課題組前期建立［5］。細(xì)胞在含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2潮濕培養(yǎng)箱中維持。

1.3 裸鼠皮下移植瘤模型建立

本實(shí)驗(yàn)所用裸鼠為SPF級(jí)BALB/c雌性裸鼠，體重18～22 g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。用0.25%胰蛋白酶消化SKOV3-GFP-CCL18細(xì)胞、SKOV3-GFP細(xì)胞和SKOV3細(xì)胞，計(jì)數(shù)1×107個(gè)細(xì)胞，用培養(yǎng)液調(diào)整體積至200 μL。2 mL注射器于裸鼠腹股溝淋巴結(jié)區(qū)皮下注射。30 d后待腫瘤長(zhǎng)至1 cm左右，采用脊髓離斷法拉頸處死裸鼠，無(wú)菌操作臺(tái)下分離剝?nèi)∧[瘤組織，PBS沖洗，無(wú)菌紗布吸干液體，液氮浸泡，-80℃冰箱保存。

1.4 總RNA提取

按美國(guó)Invitrogen公司TRIzol操作說(shuō)明提取組織總RNA，紫外分光光度儀檢測(cè)RNA OD值，若A260/A280在1.8～2.0，0.1%變性瓊脂糖凝膠電泳可見(jiàn)清晰的18S、28S兩條帶，則說(shuō)明所提取的總RNA質(zhì)量較高。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)

采用SupermoⅢ M-MLVReverseTranscriptase逆轉(zhuǎn)錄酶RNA生成cDNA。各樣本cDNA參照TaKaRa公司SYGR Mix說(shuō)明書(shū)設(shè)定PCR體系，采用兩步法進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件：94℃5 min；94℃30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s重復(fù)30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)重復(fù)。趨化因子的引物序列如表1所示，GAPDH為內(nèi)參對(duì)照。相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt計(jì)算。

表1 qRT-PCR檢測(cè)的趨化因子引物序列

（續(xù)表）

1.6 流式熒光微球法檢測(cè)血清樣本CCL18的含量

收集2012年2月至2018年1月于廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院住院并經(jīng)術(shù)后病理確診的320例卵巢癌和150例盆腔良性腫塊患者的血清樣本，同時(shí)收集2008年于本院進(jìn)行體檢且體檢報(bào)告正常的100名正常女性的血清樣本。根據(jù)微球包被試劑盒的操作手冊(cè)，用CCL18單克隆抗體包被微球，采用Bio-plex 200儀器進(jìn)行液態(tài)懸浮芯片技術(shù)檢測(cè)［6］。

1.7 多中心分析CCL18與卵巢癌預(yù)后的關(guān)系

通過(guò)網(wǎng)站http：//kmplot.com分析來(lái)自基因表達(dá)譜（Gene Expression Omnibus，GEO） 及癌癥基因圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)中卵巢癌患者的表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)，選取經(jīng)鉑類(lèi)藥物治療及臨床分期（依據(jù)2012年FIGO分期）為Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ 期的卵巢癌患者，分析CCL18表達(dá)對(duì)患者5年無(wú)疾病進(jìn)展生存期（PFS）及10年總生存期（OS）的影響，繪制生存曲線圖。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。3組血清CCL18含量比較采用單因素方差分析，若整體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步的多重比較采用Bonferroni檢驗(yàn)；生存率采用Kaplan-Meier法計(jì)算，組間比較行Log-rank檢驗(yàn)。采用Cox回歸分析CCL18表達(dá)水平與PFS和OS的關(guān)系，并計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)比（HR）及其相對(duì)應(yīng)的95%可信區(qū)間（CI）。趨化因子相對(duì)表達(dá)量數(shù)據(jù)用R語(yǔ)言pheatmap包進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后繪制熱圖。以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 流式熒光微球法檢測(cè)樣本血清中CCL18的表達(dá)

卵巢癌患者血清中CCL18的表達(dá)量為（238.04±93.59）ng/mL，盆腔良性腫塊患者血清中CCL18的表達(dá)量為（94.36±59.17）ng/mL，正常對(duì)照女性血清中CCL18的表達(dá)量為（31.68±26.10）ng/mL。卵巢癌和盆腔良性包塊患者血清中CCL18的含量顯著高于正常對(duì)照女性（P＜0.001），而盆腔良性腫塊患者血清中CCL18的含量低于卵巢癌患者（P＜0.001）。見(jiàn)圖1。

圖1 各組血清中CCL18的含量

2.2 CCL18基因表達(dá)水平與卵巢癌患者預(yù)后的關(guān)系

GEO和TCGA分析結(jié)果顯示，CCL18高表達(dá)患者中位PFS低于低表達(dá)者（15.0個(gè)月vs 18.2個(gè)月)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（HR=1.25，95%CI:1.08～1.44，P=0.003），見(jiàn)圖2A；CCL18高表達(dá)患者中位OS低于低表達(dá)組（44.5個(gè)月vs 45.0個(gè)月），但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（HR=0.92，95%CI:0.79～1.07，P=0.29），見(jiàn)圖 2B。

圖2 CCL18表達(dá)與卵巢癌患者PFS及OS的關(guān)系

2.3 CCL18調(diào)控的差異表達(dá)趨化因子及受體

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，SKOV3-GFP-CCL18組與SKOV3-GFP組、SKOV3組比較，共有23個(gè)趨化因子及受體表達(dá)異常（P＜0.05），其中表達(dá)上調(diào)20個(gè)，包括 CXC 家族 6個(gè)（CXCL2、CXCL4、CXCL7、CXCR1、CXCR3、CXCR4），CC 家 族 11 個(gè)（CCL2、CCL8、CCL11、CCL13、CCL17、CCL19、CCL24、CCL27、CCR2、CCR3、CCR4），XC 家族 3 個(gè)（XCR1、XCL1、XCL2）；表達(dá)下調(diào)20個(gè)，包括CXC家族11個(gè)（CXCL1、CXCL6、CXCL8、CXCL9、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL16、CXCR2、CXC R7），CC 家 族 9 個(gè)（CCL5、CCL7、CCL20、CCL23、CCL28、CCR1、CCR5、CCR7、CCR10），見(jiàn)圖 3。

圖3 qRT-PCR檢測(cè)祼鼠移植瘤中趨化因子及受體的表達(dá)

2.4 CCL18調(diào)控的趨化因子及受體網(wǎng)絡(luò)分析

將CCL18調(diào)控的趨化因子及受體繪制成網(wǎng)絡(luò)圖，可見(jiàn)CCL18主要激活了XCL1-XCR1、XCL2-XCR1、CCL2-CCR2、CCL11-CCR3、CCL17-CCR4、CXCL9-CXCR3、CXCL11-CXCR3、CXCL12-CXCR4趨化因子-受體軸表達(dá)，且抑制了CXCL1-CXCR2、CXCL6-CXCR2、CXCL8-CXCR2、CCL5-CCR1、CCL5-CCR5、CCL27-CCR10、CCL28-CCR10趨化因子-受體軸表達(dá)，見(jiàn)圖4。

圖4 CCL18調(diào)控卵巢癌趨化因子的網(wǎng)絡(luò)示意圖

3 討論

CCL18為本課題組前期篩選的卵巢癌早期血清標(biāo)志物之一，與CXCL1聯(lián)合檢測(cè)可用于卵巢癌早期診斷［1］。與非卵巢癌患者相比，卵巢癌患者血清中CCL18的表達(dá)水平顯著升高［7］，在腫瘤組織中也可檢測(cè)到CCL18高表達(dá)，且其表達(dá)量與腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移相關(guān)［5］。前期的細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)表明，CCL18過(guò)表達(dá)可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，但細(xì)胞的增殖能力與親本細(xì)胞差異不明顯［2］。本研究血清CCL18含量的檢測(cè)結(jié)果與之一致，多中心分析CCL18表達(dá)量與卵巢癌患者的預(yù)后也進(jìn)一步證實(shí)了以上觀點(diǎn)。CXCR2是趨化因子 CXCL1、CXCL2、CXCL6 和 CXCL8（IL-8）的受體。癌癥干細(xì)胞（cancer stem cell，CSC）具有自我更新和分化的特性，可啟動(dòng)和維持癌癥生長(zhǎng)和進(jìn)展。siRNA干擾CXCR2表達(dá)可以抑制人多能干細(xì)胞（human pluripotent stem cells，hPSCs）形成［8］，而 CXCR2 被激活可導(dǎo)致乳腺癌CSC自我更新增加［9］。CXCR2也在急性髓性白血病和骨髓增生異常綜合征的干細(xì)胞群中高表達(dá)，且在腫瘤進(jìn)展中起關(guān)鍵作用［10］，CXCL8-CXCR2軸被認(rèn)為是癌癥的重要治療靶點(diǎn)之一［11］。本研究結(jié)果顯示CXCL1、CXCL6、CXCL8及其相應(yīng)受體CXCR2表達(dá)下調(diào)，認(rèn)為CCL18抑制腫瘤細(xì)胞增殖可能與其影響CXCR2促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)。研究顯示，CXCR3過(guò)表達(dá)與結(jié)腸癌、卵巢癌和肝癌等多種腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)［12-14］。乳腺癌組織中CXCR3表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，且與淋巴結(jié)累及數(shù)目、腫瘤大小和pTNM分期均呈顯著正相關(guān)，提示CXCR3是參與乳腺癌轉(zhuǎn)移的重要分子［15］。本研究亦檢測(cè)到CXCR3表達(dá)上調(diào)，認(rèn)為CCL18可能促使CXCR3通路而促使卵巢癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，可見(jiàn)趨化因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)錯(cuò)綜復(fù)雜。

CXCL12［基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（SDF-1）］主要結(jié)合CXCR4，趨化因子受體CXCR4屬于G蛋白偶聯(lián)型受體家族，能有效促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移［16］。CXCR4可在轉(zhuǎn)移的多個(gè)關(guān)鍵步驟中促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移，本研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)CCL18后，CXCL12表達(dá)明顯受抑制，但CXCR4表達(dá)顯著升高，推測(cè)可能是CXCL12下調(diào)后的代償性升高，也可能是未知的交叉激活機(jī)制起作用，有關(guān)方面需進(jìn)一步研究。

研究發(fā)現(xiàn)XC趨化因子家族X(qián)CL1、XCL2及其相應(yīng)受體XCR1表達(dá)明顯上調(diào)。XCR1是C族趨化因子受體的唯一成員，在卵巢癌轉(zhuǎn)移中起重要作用。Muralidhar等［17］研究發(fā)現(xiàn)XCR1在正常卵巢組織中不表達(dá)，而在原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性人上皮卵巢癌中高表達(dá)，XCL1和XCL2可分別結(jié)合并激活XCR1，導(dǎo)致表達(dá)XCR1的卵巢癌細(xì)胞增殖和遷移增加。該研究還發(fā)現(xiàn)卵巢癌細(xì)胞自身可表達(dá)XCL1，卵巢癌患者腹水中亦可檢測(cè)到XCL2，提示XCL/XCR1驅(qū)動(dòng)的細(xì)胞增殖和遷移可能促進(jìn)盆、腹腔轉(zhuǎn)移，此外給予異位移植的小鼠模型腹腔注射卵巢癌細(xì)胞，可觀察到卵巢癌向腹膜壁和膈肌的轉(zhuǎn)移能力與卵巢癌細(xì)胞表達(dá)XCR1高度相關(guān)。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)XCR1的人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231不僅體外生長(zhǎng)受到抑制，體內(nèi)腫瘤發(fā)生能力也減弱［18］。本研究發(fā)現(xiàn)在CCL18高表達(dá)的情況下，XCL1、XCL2、XCR1表達(dá)量明顯上調(diào)，提示CCL18可能通過(guò)XCL1、XCL2、XCR1調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移信號(hào)通路。

CCL2-CCR2趨化因子-受體軸對(duì)腫瘤細(xì)胞成功轉(zhuǎn)移尤為重要。腫瘤微環(huán)境中的癌細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞都能產(chǎn)生CCL2，通過(guò)癌細(xì)胞表面的CCR2對(duì)其產(chǎn)生直接影響，包括在原發(fā)部位誘導(dǎo)其增殖、刺激腫瘤細(xì)胞向周?chē)|(zhì)浸潤(rùn)等。隨著腫瘤細(xì)胞侵入循環(huán)系統(tǒng)，CCL2又可以募集宿主骨髓細(xì)胞來(lái)加速這一過(guò)程［19］，因此認(rèn)為CCL18還能通過(guò)CCL2-CCR2趨化因子-受體軸調(diào)節(jié)惡性腫瘤轉(zhuǎn)移。

趨化因子受體CCR3及其配體CCL11通過(guò)自分泌調(diào)節(jié)的方式參與腫瘤的發(fā)展過(guò)程。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，CCL11可促進(jìn)EL-4和Ki-JK細(xì)胞生長(zhǎng)［20］，即CCL18過(guò)表達(dá)啟動(dòng)了細(xì)胞表面的CCL11/CCR3信號(hào)通路，通過(guò)促進(jìn)ERK1/2磷酸化以及誘導(dǎo)抗凋亡蛋白表達(dá)，延長(zhǎng)腫瘤細(xì)胞的生存周期。趨化因子受體CCR4在腫瘤細(xì)胞親表皮性和淋巴結(jié)腫大中發(fā)揮重要作用［21］。本研究中亦見(jiàn)CCL17/CCR4高表達(dá)，提示CCL18可能啟動(dòng)了與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、表皮浸潤(rùn)相關(guān)的通路。CCL5對(duì)T細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞具有趨化性，且能將白細(xì)胞募集到炎癥部位。CCL5還可誘導(dǎo)某些天然殺傷（NK）細(xì)胞增殖和活化，形成CC-趨化因子激活的殺傷細(xì)胞。而NK細(xì)胞通過(guò)CCL5和XCL1，將樹(shù)突狀細(xì)胞募集到腫瘤微環(huán)境中，促進(jìn)腫瘤的免疫調(diào)控，且與患者預(yù)后相關(guān)［22］。有研究報(bào)道CCR5+樹(shù)突狀細(xì)胞通過(guò)CCL5募集到腫瘤微環(huán)境中并引發(fā)持續(xù)的內(nèi)源性抗腫瘤反應(yīng)［17］。本研究發(fā)現(xiàn)CCL18過(guò)表達(dá)可降低CCL5-CCR5趨化因子-受體軸表達(dá)，認(rèn)為CCL18可能抑制CCR5軸的抗腫瘤免疫，從而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。CCR10是趨化因子配體CCL28的特異性受體，與皮膚過(guò)敏和炎癥性疾病有關(guān)，CCR10是皮膚免疫穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子［23］。本研究發(fā)現(xiàn)CCL28-CCR10趨化因子-受體軸表達(dá)明顯下調(diào)，說(shuō)明CCL18過(guò)表達(dá)可能通過(guò)抑制CCL28-CCR10軸打破免疫平衡狀態(tài)。

綜上所述，CCL18可能調(diào)控 XCL1-XCR1、XCL2-XCR1、CCL2-CCR2、CCL11-CCR3、CCL17-CCR4的相互作用而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移，下調(diào)CCL5-CCR5、CCL27-CCR10和CCL28-CCR10表達(dá)可能使體內(nèi)抗腫瘤免疫受到抑制，致使腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸，造成卵巢癌患者不良預(yù)后，但CCL18調(diào)控的趨化因子網(wǎng)絡(luò)功能較復(fù)雜，有關(guān)方面仍需進(jìn)一步探索。