鋅和N—乙酰半胱氨酸對鎘中毒肉雞肝、腎病理學(xué)損傷的拮抗作用

劉晶英　張鼎

摘要：為研究鎘對肉雞肝臟、腎臟的病理學(xué)損傷及鋅和N-乙酰半胱氨酸（NAC）分別對鎘中毒肉雞肝、腎病理學(xué)損傷的拮抗作用，對AA肉雞肌肉注射Cd2+（1 mg/kg BW和5 mg/kg BW）建立梯度鎘中毒模型，同時(shí)采用肌肉注射的方式向鎘中毒肉雞補(bǔ)充Zn2+（5 mg/kg BW）或NAC（50 mg/kg BW）。結(jié)果表明，鎘中毒10 d和20 d后，肉雞肝臟、腎臟呈現(xiàn)嚴(yán)重的病理學(xué)損傷，補(bǔ)充Zn2+或NAC后鎘中毒肉雞肝臟充血現(xiàn)象減輕，肝細(xì)胞壞死數(shù)減少，肝細(xì)胞空泡結(jié)構(gòu)、顆粒性變性現(xiàn)象減輕，肝臟內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤量顯著減少。腎臟出血減輕，腎小管管腔形態(tài)好轉(zhuǎn)，腎細(xì)胞空泡結(jié)構(gòu)、顆粒變性減輕，腎細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞間間隙減小，腎細(xì)胞核消失和腎臟炎性細(xì)胞量顯著減少。說明鎘中毒可以造成肉雞肝臟和腎臟嚴(yán)重的病理學(xué)損傷，Zn2+或NAC補(bǔ)充能有效抑制鎘中毒引起的肉雞肝、腎病理學(xué)損傷。

關(guān)鍵詞：鎘；鋅；NAC；肉雞；肝臟；腎臟；病理學(xué)損傷

中圖分類號：R994.6 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1007-273X（2018）09-0005-04

鎘是一種有毒的重金屬元素，因其良好的柔韌性和抗氧化性，被廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中。鎘可以引起人和動物肝、腎等多種器官的毒性損傷，同時(shí)造成呼吸、消化、神經(jīng)、生殖和免疫等各類系統(tǒng)的功能破壞[1，2]。我國是世界上最大的鎘開發(fā)和利用國，近年來隨著鎘在工業(yè)生產(chǎn)中的不斷利用，環(huán)境鎘污染變得越來越嚴(yán)重。小麥、大米和玉米等農(nóng)作物對土壤中的鎘離子具有很強(qiáng)的吸收能力，導(dǎo)致鎘離子在植物葉子、果實(shí)和根莖中的不斷積累[3]。動物通過長期采食被鎘污染的植物或飼料，造成鎘離子在機(jī)體內(nèi)的持續(xù)積累，最終引起鎘中毒。

鋅是一種機(jī)體必需的微量元素，參與機(jī)體120多種酶的生物合成和300多種酶的功能調(diào)控。缺鋅會造成胎兒發(fā)育異常、免疫力下降、神經(jīng)紊亂、機(jī)體疾病發(fā)生和死亡率提高等一系列后果。近年來，人們發(fā)現(xiàn)鋅可以對抗包括重金屬在內(nèi)多種刺激引起的細(xì)胞毒性，起到解毒作用[4]。本研究前期研究結(jié)果表明，適量濃度的鋅補(bǔ)充可以有效對抗鎘引起的細(xì)胞毒性，減少鎘誘導(dǎo)的細(xì)胞ROS產(chǎn)生，降低細(xì)胞氧化損傷程度[5]。N-乙酰半胱氨酸（NAC）是一種含硫氨基酸衍生物，含有豐富的巰基活性基團(tuán)。NAC能夠消除機(jī)體和細(xì)胞產(chǎn)生的自由基，提高機(jī)體的抗氧化能力。有文獻(xiàn)報(bào)道，NAC可以抑制鎘中毒造成的毒性損傷，緩解鎘中毒導(dǎo)致的氧化損傷，起到保護(hù)細(xì)胞的作用[6]。

我國是肉雞養(yǎng)殖大國，雞肉中鎘含量的超標(biāo)將直接給人的健康和生命帶來巨大的威脅。研究鎘對肉雞的毒性損傷，一方面有助于及時(shí)診斷肉雞鎘中毒，減少鎘在人食物鏈中的傳播；另一方面也能為人鎘中毒的診斷提供依據(jù)。本試驗(yàn)通過建立肉雞鎘中毒模型，研究鎘對肉雞肝、腎的病理學(xué)損傷，并通過補(bǔ)充Zn2+和NAC的方式研究Zn2+和NAC對鎘中毒病理學(xué)損傷的拮抗作用，為鎘中毒研究提供參考依據(jù)，同時(shí)也為鎘中毒的預(yù)防和治療提供思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物

1日齡AA肉雞90羽，購自山西大象農(nóng)牧集團(tuán)有限公司。

1.2 動物處理

1日齡AA肉雛雞預(yù)飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為9個(gè)組（表1），每組10羽。超純水分別溶解CdCl2、Zn（C6H11O7）2和N-乙酰半胱氨酸（NAC），制備儲存液。分別對肉雞每天腿部肌肉注射1、5 mg/kg體重 （BW）Cd2+建立濃度梯度性鎘中毒，通過向鎘中毒肉雞每天肌肉注射Zn2+（5 mg/kg BW）或NAC（50 mg/kg BW）的方式建立Zn2+和NAC補(bǔ)充模型。分別在試驗(yàn)第10天和20天每組撲殺5羽肉雞，將肝臟、腎臟于10%中性甲醛溶液中固定，進(jìn)行病理組織學(xué)觀察。

1.3 蘇木素-伊紅染色

將肝、腎組織梯度乙醇脫水、透明后進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋、切片，厚度為5 μm。二甲苯透明，梯度乙醇脫水后用蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒對切片進(jìn)行染色，其中蘇木素染液染色10 min，伊紅染液中染色30 s，自來水充分沖洗后封片，光學(xué)顯微鏡下鏡檢。

1.4 肝、腎病理學(xué)損傷計(jì)數(shù)分析

試驗(yàn)對中毒20 d后各組撲殺的5羽肉雞肝、腎HE染色結(jié)果進(jìn)行觀察。每羽肉雞的肝臟或腎臟切片采用雙盲法隨機(jī)選擇3幅視野（200×），對肝、腎切片中壞死細(xì)胞數(shù)、空泡細(xì)胞數(shù)、顆粒變性細(xì)胞數(shù)、核崩解/消失細(xì)胞數(shù)、炎性細(xì)胞數(shù)、出血點(diǎn)數(shù)等進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，以定量分析Zn2+或NAC對鎘中毒肉雞肝、腎病理學(xué)損傷的拮抗作用。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用軟件SPSS 20.0分析統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）的方式表示，采用單因素方差分析法（Duncans test）對組間差異性進(jìn)行分析，P<0.05表示差異性顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 鎘對肉雞肝、腎組織的病理學(xué)損傷

正常雞肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，核仁清晰，肝細(xì)胞排列緊密，肝細(xì)胞與肝血竇以中央靜脈為中心向周圍呈放射狀排列（見圖1A）；腎臟細(xì)胞排列緊密，大小均一，核仁清晰，腎臟無充血、出血現(xiàn)象（見圖2A）。1 mg/kg BW Cd2+中毒10 d后，肝臟出現(xiàn)充血現(xiàn)象，細(xì)胞輪廓模糊，肝細(xì)胞發(fā)生顆粒變性，胞漿內(nèi)出現(xiàn)空泡結(jié)構(gòu)，部分肝細(xì)胞核崩解、消失（見圖1A-1）。中毒20 d后，與對照組相比，肝臟的損傷加重，出血現(xiàn)象較明顯，肝細(xì)胞壞死數(shù)顯著增多（P<0.05），顆粒變性加?。≒<0.05），肝細(xì)胞空泡結(jié)構(gòu)明顯（P<0.05）、細(xì)胞核崩解嚴(yán)重（P<0.05），肝臟炎性細(xì)胞浸潤量增多（P<0.05）（圖1C-1；圖5A）。1 mg/kg BW Cd2+r中毒10 d后，腎臟有充血現(xiàn)象，腎小管管腔形態(tài)不完整，少量上皮細(xì)胞溶解、脫落，部分細(xì)胞空泡變性，可見少量炎性細(xì)胞（圖2A-1）。中毒20 d后，腎臟的損傷加重，與對照組相比，腎臟出血嚴(yán)重（P<0.05），腎小管管腔形態(tài)紊亂，上皮細(xì)胞溶解、脫落數(shù)增加，腎細(xì)胞空泡結(jié)構(gòu)、顆粒變性程度加?。≒<0.05），細(xì)胞核消失現(xiàn)象嚴(yán)重（P<0.05），腎臟伴有顯著的炎性細(xì)胞浸潤（P<0.05）（圖2C-1；圖5B）。相對于輕度鎘中毒，重度鎘（5 mg/kg BW Cd2+）中毒10 d和20 d后肉雞肝、腎病理學(xué)損傷進(jìn)一步加劇，表現(xiàn)為肝臟出血嚴(yán)重，肝細(xì)胞壞死增加、空泡變性嚴(yán)重，肝組織出現(xiàn)大量的炎性細(xì)胞浸潤，肝血竇的走向混亂，大量的細(xì)胞核崩解消失（圖1A-2，C-2）。腎臟結(jié)構(gòu)損傷加劇，腎間質(zhì)內(nèi)出血、充血現(xiàn)象嚴(yán)重，充滿大量紅細(xì)胞，細(xì)胞核崩解、消失，腎小管管腔形態(tài)不完整，腎小管上皮細(xì)胞脫落，可見炎性細(xì)胞浸潤，管腔滲出物增多（圖2A-2，C-2）。

2.2 Zn2+對鎘中毒雞肝臟、腎臟的保護(hù)作用

向肉雞單獨(dú)補(bǔ)充Zn2+未對肉雞肝臟（圖1B，圖1D）、腎臟（圖2B，圖2D）結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。分別對輕度鎘中毒（1 mg/kg BW Cd2+）和重度鎘中毒（5 mg/kg BW Cd2+）肉雞補(bǔ)充5 mg/kg BW Zn2+，結(jié)果顯示，相對于鎘中毒組，補(bǔ)充Zn2+能有效緩解鎘中毒引起的雞肝臟、腎臟病理學(xué)損傷。具體表現(xiàn)在添加Zn2+后鎘中毒肉雞肝臟充血癥狀改善，肝細(xì)胞壞死數(shù)減少（P<0.05），細(xì)胞核仁完整，界限清晰，肝細(xì)胞核崩解量降低（P<0.05），細(xì)胞空泡變性、顆粒變性減輕（P<0.05），肝血竇的走向相對清晰，炎性細(xì)胞浸潤減少（P<0.05）（圖1B-1，B-2，D-1，D-2，圖5A）。腎臟出血現(xiàn)象減輕（P<0.05），腎細(xì)胞界限清晰，細(xì)胞核完整，核消失現(xiàn)象減少（P<0.05），腎小管管腔形態(tài)完整，腎上皮細(xì)胞脫落減少，細(xì)胞顆粒變性、空泡現(xiàn)象減輕（P<0.05），炎性細(xì)胞量減少（P<0.05）（圖2B-1，B-2，D-1，D-2；圖5B）。

2.3 NAC對鎘中毒肉雞肝臟、腎臟的保護(hù)作用

向肉雞單獨(dú)補(bǔ)充NAC后肉雞肝臟（圖3B，圖3D）、腎臟（圖4B；圖4D）結(jié)構(gòu)正常，未引起病理性損傷。對鎘中毒（1 mg/kg BW 或5 mg/kg BW Cd2+）肉雞補(bǔ)充NAC后，病雞肝臟充血現(xiàn)象減輕，肝組織空泡樣結(jié)構(gòu)減少（P<0.05），肝細(xì)胞顆粒性變性程度降低（P<0.05）、肝細(xì)胞核核崩解量減少（P<0.05），炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象得到改善（P<0.05），肝血竇結(jié)構(gòu)較清晰（圖3B-1，B-2，D-1；D-2；圖5A）。腎臟充血、出血現(xiàn)象減輕（P<0.05），腎小管管腔形態(tài)好轉(zhuǎn)，內(nèi)有少量浸出物，腎小管上皮細(xì)胞輕微脫落、溶解，腎細(xì)胞顆粒變性現(xiàn)象減少（P<0.05），細(xì)胞間間隙減小，核消失細(xì)胞數(shù)減少（P<0.05），炎性細(xì)胞浸潤減輕（P<0.05）（圖4B-1，B-2，D-1，D-2；圖5B）。

3 小結(jié)與討論

本試驗(yàn)研究結(jié)果表明鎘可以造成肉雞肝臟和腎臟濃度-時(shí)間依賴性病理學(xué)損傷，這與課題組前期在小鼠體內(nèi)鎘中毒試驗(yàn)結(jié)果相一致[7]。鎘對機(jī)體的毒性損傷機(jī)理涉及多個(gè)方面，首先，鎘可以引起細(xì)胞嚴(yán)重的氧化損傷?；钚匝躅悾≧OS）是引起細(xì)胞氧化損傷的重要源頭，Cd2+可以造成ROS在細(xì)胞內(nèi)短暫或持續(xù)性地增加。線粒體是ROS產(chǎn)生最主要的場所，Cd2+通過破壞線粒體電子呼吸傳遞鏈的正常進(jìn)行，抑制細(xì)胞呼吸，造成ROS在細(xì)胞內(nèi)的大量聚集[8]。鎘還可以通過間接途徑誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生，將Fe2+、Cu2+等Fenton金屬元素從與它們結(jié)合的胞質(zhì)或胞膜蛋白上置換下來，造成胞質(zhì)內(nèi)Fe2+和Cu2+含量上升，進(jìn)而引起細(xì)胞ROS產(chǎn)生增加，發(fā)生氧化損傷[9]。除了誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生，Cd2+還通過消耗細(xì)胞內(nèi)抗氧化蛋白引起細(xì)胞氧化損傷。金屬硫蛋白（MT）是細(xì)胞內(nèi)重要的抗氧化蛋白，在鎘中毒解毒過程中起到關(guān)鍵的作用。MT通過與Cd2+結(jié)合，能將有毒的游離態(tài)Cd2+轉(zhuǎn)化為沒有毒性的MT-Cd。結(jié)合Cd2+后的MT喪失還原性，失去對ROS的清除能力，最終造成ROS在細(xì)胞內(nèi)的過量聚集[10，11]。

研究表明Zn2+可以有效拮抗鎘產(chǎn)生的組織或細(xì)胞毒性。Zn2+通過促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)還原性蛋白和抗氧化酶的表達(dá)，提高細(xì)胞的抗氧化能力，加速細(xì)胞對ROS的清除速率，對抗刺激源引起的細(xì)胞脂質(zhì)過氧化物反應(yīng)和氧化性損傷。研究表明適量濃度的鋅補(bǔ)充可以有效對抗鎘引起的細(xì)胞毒性，減少鎘誘導(dǎo)的細(xì)胞ROS產(chǎn)生，降低細(xì)胞氧化損傷程度[12]。Zn2+是MT生理狀態(tài)下結(jié)合的主要金屬離子，同時(shí)也是MT細(xì)胞表達(dá)的重要誘導(dǎo)物。鎘中毒能引起細(xì)胞中MT基因、蛋白表達(dá)水平一定程度的上升，向鎘中毒細(xì)胞中添加Zn2+，MT基因、蛋白表達(dá)量進(jìn)一步顯著上升，表明Zn2+能通過增強(qiáng)MT的表達(dá)水平，增強(qiáng)細(xì)胞對ROS的清除能力，進(jìn)而抑制鎘毒性。MT基因的轉(zhuǎn)錄依賴于具有活性功能的金屬反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子（MTF-1）的調(diào)控。MTF-1是分子質(zhì)量為53 kD的核轉(zhuǎn)錄蛋白，在各種哺乳動物和昆蟲中普遍表達(dá)且具有高度的保守性。Zn2+是MTF-1蛋白發(fā)揮功能的必需輔基，Zn2+通過與MTF-1結(jié)合，使MTF-1蛋白從非DNA結(jié)合型的無活性狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)镈NA結(jié)合型的活性狀態(tài)。DNA結(jié)合型MTF-1蛋白作為正調(diào)控因子向細(xì)胞核移動，與位于MT基因啟動子上游的金屬效應(yīng)元件（MRE）結(jié)合并激活其活性，開啟MT基因的轉(zhuǎn)錄程序[13]。

NAC是一種重要的抗氧化物質(zhì)，可以對內(nèi)源性或外源性氧化損傷起到抑制作用。近年來有研究表明NAC可以有效緩解鎘中毒產(chǎn)生的氧化損傷。NAC的抗氧化作用主要通過兩種機(jī)制實(shí)現(xiàn)。一是NAC進(jìn)入細(xì)胞后可以脫去乙?；D(zhuǎn)變?yōu)榘腚装彼幔腚装彼崾沁€原性谷胱甘肽（GSH）合成的前體。NAC通過促進(jìn)GSH合成，間接提高細(xì)胞的抗氧化能力，對抗鎘中毒[14]。同時(shí)NAC能增加過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶、超氧化物歧化酶等抗氧化酶的活性，阻止丙二醛（MDA）的生成量增加，抑制ROS生成。二是NAC自身含有豐富的巰基基團(tuán)，可以與Cd2+結(jié)合，降低細(xì)胞有毒Cd2+含量[15]。另外NAC自身的巰基基團(tuán)可以直接消除羥自由基、H2O2及ROS等氧化性物質(zhì)，阻止超氧陰離子產(chǎn)生，達(dá)到維持細(xì)胞氧化還原平衡狀態(tài)的目的[16]。

綜合全文，本研究證明了鎘中毒可以引起肉雞肝臟、腎臟嚴(yán)重的病理學(xué)損傷。對肉雞補(bǔ)充Zn2+或NAC均能有效緩解鎘中毒引起的肉雞肝臟、腎臟病理學(xué)損傷。Zn2+和NAC對鎘中毒肉雞肝、腎的保護(hù)作用可能是通過不同機(jī)制實(shí)現(xiàn)的，這為下一步研究Zn2+和NAC聯(lián)合使用對鎘中毒的拮抗作用提供了有效依據(jù)，同時(shí)也為人重金屬中毒的防治提供了參考。

參考文獻(xiàn)：

[1] 刁書永，張立志，袁 慧.鎘中毒機(jī)理研究進(jìn)展[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2005，26（5）：49-51.

[2] NZENGUE Y，STEIMAN R，GARREL C，et al. Oxidative stress and DNA damage induced by cadmium in the human keratinocyte HaCaT cell line：role of glutathione in the resistance to cadmium[J].Toxicology，2008，243：193-206.

[3] BENAVIDES M P，GALLEGO S M，Tomaro M L. Cadmium toxicity in plants[J].Braz.j.plant Physiol，2005，17（1）：21-34.

[4] JIHEN E H，F(xiàn)ATIMA H，NOUHA A，et al. Cadmium retention increase：A probable key mechanism of the protective effect of zinc on cadmium-induced toxicity in the kidney[J].Toxicology Letters，2010，196：104-109.

[5] ZHANG D，LIU J，GAO J，et al. Zinc supplementation protects against cadmium accumulation and cytotoxicity in Madin-Darby bovine kidney cells[J].PloS One，2014，9（8）：e103427.

[6] 袁 燕，張 英，卞建春，等.鎘致大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的機(jī)理及N-乙酰半胱氨酸的保護(hù)作用[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2010，

30（8）：1107-1110.

[7] 張 鼎.鎘中毒及鋅對鎘中毒的作用機(jī)理研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015.

[8] HU K H，LI W X，SUN M Y，et al. Cadmium induced apoptosis in MG63 cells by increasing ROS，activation of p38 MAPK and inhibition of ERK 1/2 pathways[J].Cellular Physiology and Biochemistry，2015，36（2）：642-654.

[9] CUYPERS A，PLUSQUIN M，REMANS T，et al. Cadmium stress：an oxidative challenge[J].Biometals，2010，23：927-940.

[10] KLAASSEN C D，LIU J，DIWAN B A. Metallothionein protection of cadmium toxicity[J].Toxicology and Applied Pharmacology，2009，238（3）：215-220.

[11] 胡曦尹，馮 揚(yáng)，李 巖.鎘中毒與金屬硫蛋白表達(dá)的研究進(jìn)展[J].職業(yè)與健康，2017，33（21）：3022-3025.

[12] SZUSTER-CIESIELSKA A， PLEWKA K， DANILUK J，et al. Zinc supplementation attenuates ethanol-and acetaldehyde-induced liver stellate cell activation by inhibiting reactive oxygen species （ROS） production and by influencing intracellular signaling[J].Biochemical Pharmacology，2009.78（3）：301-314.

[13] GRZYWACZ A，GDULA-ARGASI■SKA J，MUSZY■SKA B，et al. Metal responsive transcription factor 1（MTF-1） regulates zinc dependent cellular processes at the molecular level[J].Acta Biochimica Polonica，2015，62：491-498.

[14] CHEN H M，PENG X U，ZHONG-QIANG W U，et al. Alleviation of cadmium-induced oxidative stress in Sinopotamon henanense ovarian tissue by N-acetylcysteine[J].Journal of Agro-Environment Science，2017，36（6）：1087-1092.

[15] GUO M Y，WANG H，CHEN Y H，et al. N-acetylcysteine alleviates cadmium-induced placental endoplasmic reticulum stress and fetal growth restriction in mice[J].Plos One，2018，13（1）：e0191667.

[16] LIU X，ZHANG Y，WANG Y，et al. Investigation of cadmium-induced apoptosis and the protective effect of N-acetylcysteine in BRL 3A cells[J].Molecular Medicine Reports，2016，14（1）：373.