花椰菜小孢子胚狀體增殖及植株再生

文正華 劉莉莉 張小麗 江漢民 姚星偉 牛國保 單曉政 周志杰

摘 要： 為建立穩(wěn)定的胚狀體增殖成苗技術(shù)體系，以期穩(wěn)定獲得足夠的再生植株，以花椰菜小孢子胚狀體為試材，研究了植物生長激素6-BA、NAA對胚狀體增殖及再生苗生根培養(yǎng)的影響。結(jié)果表明，胚狀體在附加1.25 mg·L-1 6-BA+0.025 mg·L-1 NAA的改良MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，增殖系數(shù)最高，可達(dá)10.3；再生苗在附加濃度為1.0 mg·L-1NAA生根培養(yǎng)基上的生根效果最佳，平均每芽上生根數(shù)達(dá)到8.1個。因此，6-BA和NAA配合使用，可顯著提高胚狀體增殖系數(shù)；生根培養(yǎng)基中，添加適量的NAA可增加再生苗的生根數(shù)。

關(guān)鍵詞： 花椰菜； 胚狀體； 增殖； 植株再生

Abstract： To establish a stable system of embryoid proliferation for obtaining enough regenerative plants， the effects of plant hormone 6-BA and NAA on the embryoid proliferation and regenerative seedling rooting were studied in this study， the microspore embryoid of cauliflower was used as the test materials. The results showed that the embryoids exhibited the highest proliferation coefficient， up to 10.3， when cultured in an improved MS medium with an additional 1.25 mg·L-1 6-BA +0.025 mg·L-1 NAA. The regenerative seedlings rooted best in medium with the added concentration of 1.0 mg·L-1 NAA， and the average number of roots per bud reached 8.1. Therefore， the combination utilization of 6-BA and NAA could significantly increase the reproduce of embryoid， medium adding moderate NAA could increase root number of regenerated seedlings.

Key words： Cauliflower； Embryoid； Proliferation； Plant regeneration

花椰菜（Brassica oleracea L. var. botrytis）又名菜花、花菜，椰菜花、芥藍(lán)花、花甘藍(lán)、球花甘藍(lán)；清代稱為番芥藍(lán)，是十字花科蕓薹屬甘藍(lán)類的蔬菜?；ㄒ耸秤闷鞴贋榛ㄇ颍錉I養(yǎng)豐富、風(fēng)味鮮美、外形美觀，深受廣大消費(fèi)者的喜愛，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有一定地位，世界各地均有種植，我國各地已普遍栽培。目前我國已成為世界上花椰菜第一生產(chǎn)大國，花椰菜在蔬菜周年供應(yīng)中占有越來越重要的地位。

目前市場上推廣的花椰菜品種絕大多數(shù)是F1，采用常規(guī)方法從分離純化親本，再到測配組合一般需6～8 a（年），育種時間較長。而游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)可以快速獲得純合體，縮短育種年限，既提高育種效率，同時由小孢子培養(yǎng)獲得的胚狀體和再生苗還可以廣泛應(yīng)用于遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位、轉(zhuǎn)基因育種以及染色體工程等。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的飛速發(fā)展，人們采用基因轉(zhuǎn)化技術(shù)使其獲得新型重要的園藝性狀成為了可能[1-6]，而基因轉(zhuǎn)化工作的前提就是建立高效的離體再生體系，小孢子胚狀體增殖成苗的數(shù)量和質(zhì)量成為此技術(shù)應(yīng)用上最重要的環(huán)節(jié)，筆者旨在建立穩(wěn)定的胚狀體增殖成苗技術(shù)體系，以期穩(wěn)定獲得足夠的再生植株，對花椰菜的遺傳育種和轉(zhuǎn)基因應(yīng)用研究具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為天津科潤蔬菜研究所實(shí)驗(yàn)室花椰菜雙單倍體材料D1小孢子游離后再分化生長發(fā)育形成的胚狀體。試驗(yàn)于2017年4—11月在天津科潤蔬菜研究所實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 方法

1.2.1 不同激素濃度配比對胚狀體增殖的影響 胚狀體接種于不同激素濃度配比的改良MS培養(yǎng)基（NH4NO3減半+0.4%瓊脂+3%蔗糖）中，培養(yǎng)基pH在高壓滅菌前調(diào)為5.8左右，培養(yǎng)溫度為25 ℃左右，光照強(qiáng)度為1 600～2 000 lx，每天光照時數(shù)為14 h。100 mL三角瓶中分裝25 mL培養(yǎng)基，每瓶接種5個外植體，在組培架上隨機(jī)區(qū)組排列。以不含激素的改良MS為對照（CK），培養(yǎng)25 d后觀察結(jié)果并記錄成苗數(shù)量和品質(zhì)，進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.2.2 叢生芽生根培養(yǎng) 將叢生芽切分成獨(dú)立的小苗接種在不同生長素（NAA）的MS培養(yǎng)基（0.4%瓊脂+3%蔗糖）中，培養(yǎng)誘導(dǎo)生根，并形成完整的再生植株，100 mL三角瓶中分裝25 mL培養(yǎng)基，每瓶接種5個外植體，在組培架上隨機(jī)區(qū)組排列。以不含激素的MS培養(yǎng)基為對照（CK），培養(yǎng)15 d后觀察結(jié)果并記錄生根情況，進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素配比對胚狀體增殖的影響

由表1可知，在不加激素的情況下，胚狀體繼續(xù)正常發(fā)育生長，但沒有再生芽誘導(dǎo)發(fā)生。6-BA和NAA共同使用可顯著提高胚狀體增殖系數(shù)，1.25 mg·L-1 6-BA+0.025 mg·L-1 NAA處理為本試驗(yàn)中的最佳激素配比，此時胚狀體增殖系數(shù)最高，可達(dá)10.3，叢生芽的數(shù)量多且品質(zhì)好（圖1）。當(dāng)6-BA濃度一定時，隨著NAA濃度的增加，胚狀體愈傷組織化程度增高，再生根數(shù)目增多，NAA的適宜質(zhì)量濃度為0.025 mg·L-1；當(dāng)NAA質(zhì)量濃度一定時，隨6-BA質(zhì)量濃度的增加，根的再生受到抑制，當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度超過1.25 mg·L-1時，芽再生頻率下降，且玻璃化加深，成苗數(shù)量和品質(zhì)下降。

2.2 叢生芽分離誘導(dǎo)生根

從表2看出，添加生長激素對生根率無影響，但對生根數(shù)有明顯促進(jìn)效果，當(dāng)NAA質(zhì)量濃度為1.0 mg·L-1時，生根效果最佳，根數(shù)最多且正常，平均每芽上生根數(shù)達(dá)到8.1個（圖2），激素質(zhì)量濃度提高后，根系加粗變短，不利于后續(xù)的移栽成活。

3 討論與結(jié)論

植物材料的不同品種、不同取材時間、培養(yǎng)基中激素組成及質(zhì)量濃度、不同取材部位等均能影響外植體的芽分化頻率[7-8]，其中確定適宜的外植體類型（即供體細(xì)胞及生理狀態(tài)）與培養(yǎng)基成分及其濃度最為關(guān)鍵，直接決定著器官分化的模式和程度[9]。筆者主要探討植物激素中的6-BA與NAA的質(zhì)量濃度配比對胚狀體芽增殖培養(yǎng)的高效再生影響。一般認(rèn)為細(xì)胞分裂素如6-BA，是有利于芽的分化，而生長素如NAA是有利于根的分化和愈傷組織的形成，細(xì)胞分裂素與生長素的比值高有利于芽的分化[10]。添加植物生長激素對生根率并無影響，但對生根數(shù)有較明顯促進(jìn)效果，激素超過適宜濃度后，再生苗根系加粗變短，不利于移栽成活。

試驗(yàn)的最終目的是穩(wěn)定獲得正常植株，但在誘導(dǎo)生根的過程中，再生苗玻璃化現(xiàn)象比較嚴(yán)重。造成玻璃化苗的原因有很多，如培養(yǎng)基的水分含量過高、外植體中乙烯含量過高等[11]。由試驗(yàn)結(jié)果可知，過高的6-BA濃度是導(dǎo)致再生苗玻璃化的原因之一。通常降低玻璃化頻率的方法是提高培養(yǎng)基的滲透壓如加入活性炭，以及降低激素的使用濃度。植物細(xì)胞在離體培養(yǎng)過程中會產(chǎn)生大量乙烯，尤其是在密閉的培養(yǎng)容器中，乙烯的大量累積會直接影響外植體生長和芽分化。AgNO3對許多植物的形態(tài)發(fā)生有促進(jìn)作用[12-13]。一般認(rèn)為，Ag+作為一種乙烯抑制劑并非抑制乙烯的合成，而是通過促進(jìn)多胺的合成來提高體細(xì)胞胚胎和芽的發(fā)生頻率[14]。據(jù)報道，在用外植體誘導(dǎo)不定芽的培養(yǎng)基中添加適量AgNO3，可顯著提高蕓薹屬植物離體培養(yǎng)條件下芽的再生頻率[15-16]。

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