BLM解旋酶基因的克隆、表達(dá)載體構(gòu)建及表達(dá)研究

趙佳福 許厚強(qiáng) 宋書(shū)弦 段志強(qiáng) 陳祥

（1. 貴州大學(xué)高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴陽(yáng) 550025；2. 貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴陽(yáng)550025；3. 貴州省大方縣農(nóng)牧局，大方 551600）

BLM解旋酶是人類(lèi)RecQ解旋酶家族中的一員，具有RecQ解旋酶家族典型的結(jié)構(gòu)特征，在DNA的復(fù)制、重組、轉(zhuǎn)錄、修復(fù)、端粒的維持等細(xì)胞代謝過(guò)程中具有重要的作用［1］。研究表明，BLM基因的突變會(huì)導(dǎo)致Bloom綜合癥的發(fā)生［2］，患者遺傳不穩(wěn)定，并易患乳腺癌、肺癌、前列腺癌和惡性腫瘤等各種癌癥［3-8］，屬于高風(fēng)險(xiǎn)人群。目前，BLM基因已被定位于15q26.1區(qū)帶上，轉(zhuǎn)錄生成4.5 kb的mRNA，編碼一個(gè)由1 417個(gè)氨基酸殘基組成的分子量約為159 kD的蛋白［9］。已報(bào)道的資料顯示，BLM解旋酶主要包含鏈退火結(jié)構(gòu)域（Strand annealing domain，SA）、解旋酶結(jié)構(gòu)域（Helicase domain）、RecQ羧 基 端 結(jié) 構(gòu) 域（RecQ C-terminal domain，RQC）、解旋酶和RNA酶D羧基端結(jié)構(gòu)域（Helicase and RNaseD C-terminal domain，HRDC）和核定位信號(hào)結(jié)構(gòu)域（Nuclear localization signal domain，NLS），其中RecQ、RQC和HRDC位于BLM解旋酶氨基酸639-1 290位，見(jiàn)圖1。該區(qū)域具有類(lèi)似BLM全酶的活性，但缺乏羧基端的核定位功能和氨基端鏈退火結(jié)構(gòu)域的相關(guān)功能［10-11］。目前已發(fā)表的文章大多以BLM642-1290的核心區(qū)域?yàn)檠芯繉?duì)象，開(kāi)展BLM解旋酶結(jié)構(gòu)與功能的研究。本實(shí)驗(yàn)旨在克隆BLM解旋酶基因全長(zhǎng)4 251 bp的CDS區(qū)域，構(gòu)建BLM解旋酶全基因的重組真核表達(dá)載體和重組原核表達(dá)載體，并研究其原核細(xì)胞中的表達(dá)水平，在真核細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位情況，以及BLM基因超表達(dá)后，對(duì)細(xì)胞核定位相關(guān)基因Ran表達(dá)水平的影響，進(jìn)一步為BLM解旋酶結(jié)構(gòu)與功能研究提供材料和奠定基礎(chǔ)。

圖1 人BLM解旋酶全酶結(jié)構(gòu)域示意圖

1 材料與方法

1.1 材料

JM109、BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞、pMD19-T vector、DL10000、DL5000 DNA Marker、 限 制 性?xún)?nèi)切酶及T4 DNA ligase（寶生物），PC3細(xì)胞、pEGFP-N3載體、pET-32a（實(shí)驗(yàn)室儲(chǔ)存），DNA 凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒（Axygen），RNA 提取試劑盒（Omega），無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒（QIAGEN），2×Taq PCR Master Mix、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（康為），F(xiàn)uGENE? HD Transfection Reagent（Roche），10%胎牛血清、RPMI1640生長(zhǎng)培養(yǎng)基（gibco）?？笻is標(biāo)簽鼠單克隆抗體、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG抗體（康為），抗BLM蛋白鼠單克隆抗體（Santa Cruz Biotechnology），ECL超靈敏顯色試劑盒、TBSTw液封閉、彩虹Marker（碧云天）。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 由于BLM基因較長(zhǎng)，為提高擴(kuò)增效率，采用分段擴(kuò)增的方式，進(jìn)行BLM全基因的克隆。根據(jù)GenBank中登錄的BLM基因cDNA序列（NM_000057），采用 Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)BLM1-1950，BLM1319-2735，BLM1-42513對(duì)引物，根據(jù)表達(dá)載體pET-32a載體圖譜和BLM基因全長(zhǎng)序列的特點(diǎn)，分別在B1-F、B3-R中添加KpnI、XhoI酶切位點(diǎn)，3對(duì)引物擴(kuò)增獲得的3條序列彼此間均具有部分重復(fù)序列，便于后續(xù)擴(kuò)增BLM1-4251全長(zhǎng)。此外 根 據(jù) GenBank中 人BLM（NM_000057）、RAN（NM_006325.4）、GAPDH（NM_001289 746.1）基因的cDNA序列，設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物，見(jiàn)表1。

1.2.2BLM基因的克隆 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的前列腺癌PC3細(xì)胞，約5×106個(gè)，采用Omega公司 RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，分別擴(kuò)增B1、B2、B3序列，EcoR I和NcoI分別單酶切B1和B3、雙酶切B2，膠回收目的片段后，T4DNA連接酶連接回收后，以回收產(chǎn)物為模板，采用B1-F、B3-R擴(kuò)增BLM1-4251全長(zhǎng)序列（圖2）；電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，膠回收目的片段，并與pMD-19-T 載體連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞。由于目的片段較大，菌液PCR同樣分為B1、B2、B3三段進(jìn)行檢測(cè)，最后將檢測(cè)正確的重組質(zhì)粒pMD-19-BLM送上海英駿生物技術(shù)公司測(cè)序鑒定。

表1 實(shí)驗(yàn)所使用的引物

1.2.3 重組原核和重組真核表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)pET-32a（+）和pMD19-BLM載體酶切位點(diǎn)圖譜，分別采用KpnI和XhoI限制性?xún)?nèi)切酶切割兩個(gè)質(zhì)粒，回收5 900 bp的pET-32a（+）載體和4 251 bp的BLM基因兩條目的條帶，16℃過(guò)夜連接，轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，氨芐青霉素抗性平板篩選單克隆，挑取單克隆，搖菌并進(jìn)行菌液PCR分段檢測(cè)和雙酶切檢測(cè)，最后將PCR和雙酶切鑒定均正確的pET-32a-BLM陽(yáng)性菌株，以終濃度為25%的甘油進(jìn)行-80℃保藏。同上，選擇Hind Ⅲ和BamHⅠ兩個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，膠回收4 700 bp的pEGFP-N3載體片段和4 251 bp的BLM基因目的片段，連接轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞，采用含卡那霉素的抗性平板進(jìn)行篩選，構(gòu)建重組真核表達(dá)載體pEGFP-N3-BLM。

圖2 BLM CDS區(qū)擴(kuò)增方案示意圖

1.2.4 BLM解旋酶的在大腸桿菌中的表達(dá)分析 為摸索出BLM蛋白表達(dá)的最佳培養(yǎng)條件，按照培養(yǎng)溫度設(shè)為25℃和37℃兩組，每組設(shè)4個(gè)IPTG 濃度梯度，終濃度分別為0.3 mmol/L、0.5 mmol/L、0.7 mmol/L和1.0 mmol/L，180 rpm條件下?lián)u菌5 h。5 h后，按照細(xì)菌蛋白抽提試劑盒說(shuō)明裂解細(xì)胞，提取總蛋白，并分離上清和沉淀，同時(shí)設(shè)含空質(zhì)粒pET-32a（+）的菌株為對(duì)照組。6%分離膠進(jìn)行SDS-PAGE分析，按彩虹Marker5 mL/孔、蛋白樣品30 mL/孔進(jìn)行上樣，電壓：80 V 30 min，120 V 60 min，電泳結(jié)束后120 V 2.5 h轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，TBSTw液封閉10 min，抗His標(biāo)簽鼠一抗4℃孵育過(guò)夜，HRP山羊抗小鼠二抗孵育1 h，DAB顯色，熒光化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司）對(duì)Western-blot進(jìn)行結(jié)果分析。

1.2.5 BLM解旋酶在PC3細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位分析 首先采用PSORT II Prediction在線分析軟件對(duì)BLM解旋酶氨基酸序列進(jìn)行分析，對(duì)其在細(xì)胞中可能的表達(dá)部位進(jìn)行預(yù)測(cè)。然后將PC3細(xì)胞按照3×105/孔接種于6孔板中，37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%時(shí)，按照FuGENE?HD Transfection Reagent的操作說(shuō)明，將純化后的pEGFP-N3和pEGFP-N3-BLM兩個(gè)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染PC3細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)合熒光共定位的方法對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。具體操作步驟：（1）首先棄去6孔板中培養(yǎng)基，用PBS清洗培養(yǎng)孔兩次，每孔加入2 mL的含血清不含抗生素的DMEM/F-12培養(yǎng)基，置于37℃、5% 的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；（2）取6支無(wú)菌PCR管，每管先加入2 μg轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，再加入10 μL轉(zhuǎn)染試劑，移液器輕輕混勻，再加入100 μL Opti-MEM?輕輕混勻，室溫孵育30 min；（3）將轉(zhuǎn)染混合物對(duì)號(hào)加入6孔板中，十字交叉法輕輕振蕩混勻，繼續(xù)置于5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

轉(zhuǎn)染細(xì)胞36 h后開(kāi)始染核，具體操作步驟如下：（1）用PBS浸洗細(xì)胞3次，加入事先預(yù)冷的4%多聚甲醛固定細(xì)胞20 min；（2）PBS浸洗細(xì)胞3次，加入0.25%Triton X-100（PBS配制）室溫通透5 min；以下步驟需在暗處進(jìn)行：（3）PBS浸洗細(xì)胞3次，吸干，滴加DAPI 37℃避光孵育5 min進(jìn)行細(xì)胞核染色；（4）PBS 清洗3次，吸干多余液體，自然干燥后，熒光顯微鏡下觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果；（5）采用PhotoshopCS3軟件將融合蛋白熒光圖譜與對(duì)應(yīng)的細(xì)胞核熒光圖譜進(jìn)行Merge，通過(guò)觀察分析兩者的熒光共定位情況，判斷融合蛋白的亞細(xì)胞定位。

1.2.6 qRT-PCR檢測(cè)BLM基因超表達(dá)后對(duì)Ran的影響 轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h后，提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄后采用SYBR Green熒光染料法檢測(cè)BLM和Ran基因的表達(dá)情況。熒光定量PCR反應(yīng)體系：2×QuantiFast SYBR Green PCR Master Mix 5 μL、Sense Primer 0.5 μL、Anti-sense Primer 0.5 μL、cDNA 模 板 1 μL、ddH2O 3 μL、Total 10 μL，每個(gè)樣品做 3 個(gè)重復(fù) ；反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min、95℃變性30 s、60℃退火30 s，反應(yīng)進(jìn)行40個(gè)循環(huán)后分析溶解曲線。隨后，采用2-△△Ct方法對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，2-△△Ct表示目的基因的相對(duì)表達(dá)量。最后采用SPSS Statistics 19.0 數(shù)據(jù)分析軟件和GraphPad Prism 5 圖形分析軟件分別進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析和圖表處理。

1.2.7 BLM蛋白在PC3細(xì)胞中表達(dá)量的檢測(cè) 提取轉(zhuǎn)染pEGFP-N3-BLM載體36 h后的PC3細(xì)胞總蛋白，以轉(zhuǎn)染pEGFP-N3空載體的PC3細(xì)胞為對(duì)照，采用1.2.4中目標(biāo)蛋白分離鑒定方法分離BLM蛋白，同樣方法轉(zhuǎn)膜封閉，隨后以抗BLM蛋白小鼠單克隆抗體為一抗4℃孵育過(guò)夜，HRP山羊抗小鼠二抗孵育1 h，ECL顯色，熒光化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)分析BLM蛋白在PC3細(xì)胞中的表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 pMD-19-BLM克隆載體的鑒定

以B1、B2、B3三段序列的連接產(chǎn)物為模板，擴(kuò)增BLM基因 CDS序列，膠回收后連接pMD19載體，轉(zhuǎn)化JM109細(xì)胞。PCR檢測(cè)和雙酶切檢測(cè)結(jié)果分別見(jiàn)圖3。由圖3-A可見(jiàn)，6個(gè)質(zhì)粒在4 251 bp處均出現(xiàn)預(yù)期條帶；由圖3-B可見(jiàn)，KpnⅠ與XhoⅠ進(jìn)行雙酶切后，結(jié)果1-4泳道均在4 251 bp和2 692 bp左右出現(xiàn)兩條亮帶。經(jīng)上海英駿生物技術(shù)公司對(duì)4個(gè)質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定，測(cè)序結(jié)果經(jīng)MegAlign分析表明，3、4號(hào)質(zhì)粒BLM基因序列發(fā)生了移碼突變，2號(hào)質(zhì)粒盡在aa192位處發(fā)生有義突變，由天冬酰胺（N）突變?yōu)樘於彼幔―），其它均為無(wú)義突變，與GenBank中公布的BLM氨基酸序列（NM_000057）同源性最高。由于天冬酰胺屬于極性中性氨基酸，天冬氨酸屬于酸性氨基酸，兩者所帶R基團(tuán)均具有一定的親水性，因此該氨基酸的突變對(duì)BLM解旋酶蛋白功能的影響不大，所以保藏2號(hào)質(zhì)粒對(duì)應(yīng)菌株，作為后期構(gòu)建原核和真核表達(dá)載體的中間載體。

2.2 重組原核和重組真核表達(dá)載體的鑒定

將連接好的重組原核和重組真核表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化BL21和JM109細(xì)胞后，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行培養(yǎng)，并提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4-A可見(jiàn)，僅6號(hào)泳道質(zhì)粒在5 900 bp和4 251 bp出現(xiàn)目的條帶，大小符合pET-32a-BLM酶切圖譜，說(shuō)明6號(hào)質(zhì)粒酶切成功。由圖4-B可見(jiàn)，1-5號(hào)泳道，均在4 700 bp和4251 bp出現(xiàn)兩條目的條帶，大小符合pEGFP-N3-BLM酶切圖譜。對(duì)酶切成功的原核和真核表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定，并經(jīng)MegAlign序列比對(duì)軟件進(jìn)行分析，結(jié)果顯示重組原核和重組真核表達(dá)載體與前期構(gòu)建成功的pMD19-BLM亞克隆載體序列同源性達(dá)100%，均可用于后期蛋白質(zhì)的表達(dá)實(shí)驗(yàn)。

圖3 轉(zhuǎn)染JM109感受態(tài)細(xì)胞后PCR和雙酶切檢測(cè)pMD19-BLM

圖4 pET32-BLM和pEGFP-BLM表達(dá)載體的雙酶切檢測(cè)

圖5 BLM解旋酶在BL21中的表達(dá)

2.3 BLM解旋酶的在大腸桿菌中的表達(dá)結(jié)果

為研究BLM解旋酶在大腸桿菌中的最優(yōu)表達(dá)條件，實(shí)驗(yàn)設(shè)置了5個(gè)IPTG濃度，兩個(gè)培養(yǎng)溫度，結(jié)果（圖5）發(fā)現(xiàn)IPTG終濃度對(duì)BLM解旋酶的表達(dá)影響不大，而溫度對(duì)BLM解旋酶的表達(dá)影響較大，且在25℃時(shí)表達(dá)量較高。Western-blot檢測(cè)結(jié)果（圖5-C）表明，構(gòu)建的pET-32a-BLM原核表達(dá)載體能夠在大腸桿菌中正確表達(dá)，且在25℃時(shí)表達(dá)量較高。

2.4 BLM基因的亞細(xì)胞定位

PSORT II Prediction分析軟件對(duì)BLM解旋酶氨基酸分析（表 2）表明，BLM蛋白87.0%集中在細(xì)胞核中表達(dá)，4.3%在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，4.3%在細(xì)胞骨架中表達(dá)，4.3%在質(zhì)膜中表達(dá)。經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)染，DAPI染核處理，BLM解旋酶的熒光共定位結(jié)果（圖6）可見(jiàn)，GFP蛋白在整個(gè)中均有表達(dá)，而GFP-BLM融合蛋白主要集中在細(xì)胞核中表達(dá)，說(shuō)明BLM主要在細(xì)胞核中表達(dá)，這與軟件預(yù)測(cè)結(jié)果相同。

表2 PSORT II Prediction軟件分析BLM蛋白的亞細(xì)胞定位

圖6 BLM解旋酶在PC3細(xì)胞中的熒光定位圖

2.5 Western bloting結(jié)果和熒光定量PCR結(jié)果

Western bloting結(jié)果（圖7-A）表明，轉(zhuǎn)染pEGFP-N3-BLM后，與對(duì)照組相比，BLM解旋酶在翻譯水平獲得了超表達(dá)。熒光定量PCR結(jié)果（圖7-B）也表明，BLM基因在轉(zhuǎn)錄水平與對(duì)照組相比實(shí)現(xiàn)了超標(biāo)達(dá)，且達(dá)到了極顯著性差異（P＜0.01）；實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，蛋白入核相關(guān)基因Ran表達(dá)量下降，與對(duì)照組相比也達(dá)到了極顯著性差異（P＜0.01）。

圖7 BLM超表達(dá)后相關(guān)基因在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平的表達(dá)情況

3 討論

在人類(lèi)5種RECQ解旋酶中，BLM、WRN、RECQ4基因的突變分別會(huì)導(dǎo)致布魯姆綜合征（Bloom syndrome，BS）、 沃 納 綜 合 征（Werner syndrome，WS）和先天性血管萎縮皮膚異色綜合征（Rothmund Thomson syndrome，RTS）3 種不同的疾病［2］，其中BS患者最典型的特點(diǎn)是細(xì)胞中姐妹染色單體交換率（Sister chromatid exchanges，SECs）比正常人高出10倍。BLM基因編碼區(qū)為4 251 bp，編碼1 417個(gè)氨基酸殘基，蛋白分子量約為159 kD，由于全蛋白分子量大，難以表達(dá)純化，因此關(guān)于BLM全酶活性的研究一直受到限制。BLM639-1290區(qū)段含有Helicase、RecQ-Ct和HRDC結(jié)構(gòu)域，Helicase的主要功能是負(fù)責(zé)DNA的結(jié)合、易位、解鏈和偶聯(lián)ATP水解過(guò)程；RecQ-Ct作為RecQ解旋酶家族所特有的結(jié)構(gòu)域，具有DNA結(jié)合和解鏈的活性，也與蛋白質(zhì)折疊有關(guān)，但并不結(jié)合ATP；HRDC結(jié)構(gòu)域能輔助性結(jié)合DNA進(jìn)而調(diào)節(jié)其解鏈功能，也可增強(qiáng)和穩(wěn)定BLM解旋酶與DNA的結(jié)合，但不具有催化活性［12］。因此，這3個(gè)結(jié)構(gòu)域共同組成了BLM解旋酶的核心區(qū)，并具有全酶類(lèi)似的活性，已成為研究者開(kāi)展BLM全酶功能研究的首選對(duì)象。然而本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在缺乏C端的BLM639-1290核心區(qū)，蛋白亞細(xì)胞定位主要集中在細(xì)胞質(zhì)中，對(duì)BLM蛋白行使其主要功能造成較大影響。同時(shí)，最新研究也表明，BLM解旋酶N端關(guān)鍵氨基酸殘基的磷酸化、泛素化和類(lèi)泛素化修飾在修復(fù)損傷的DNA［13-15］、增強(qiáng)蛋白間的相互作用維持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性［16-17］、維持基因組（包括端粒和染色體）穩(wěn)定性［18-19］、促進(jìn)細(xì)胞凋亡［4］等方面具有重要作用?？梢?jiàn)BLM639-1290核心區(qū)在開(kāi)展體內(nèi)功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)時(shí)，不能準(zhǔn)確反應(yīng)BLM全蛋白的相關(guān)功能。

因此，本研究通過(guò)分段擴(kuò)增的方法，旨在克隆BLM解旋酶全蛋白。結(jié)果成功克隆了人BLM解旋酶全CDS區(qū)，構(gòu)建了人BLM基因的重組原核表達(dá)載體pET-32a-BLM和重組真核表達(dá)載體pEGFP-N3-BLM。原核表達(dá)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同IPTG濃度對(duì)BLM蛋白的表達(dá)影響不大，低溫有助于BLM蛋白表達(dá)量的提高，但在室溫環(huán)境25℃、搖床轉(zhuǎn)速180 r/min條件下，BLM蛋白主要以包涵體形式存在。研究表明，外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)與多重因素有關(guān)，例如蛋白分子量的大小、培養(yǎng)溫度、搖床轉(zhuǎn)速、IPTG濃度以及培養(yǎng)液營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的豐富程度等，低溫、低轉(zhuǎn)速及適當(dāng)降低培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分均有助于蛋白質(zhì)的可溶性表達(dá)，因?yàn)樵谶@些條件下，細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢，不易形成包涵體。因此，根據(jù)論文實(shí)驗(yàn)結(jié)果，后期應(yīng)在同一IPTG濃度下，開(kāi)展不同低溫條件、不同低搖床轉(zhuǎn)速、及不同營(yíng)養(yǎng)成分培養(yǎng)基條件下的蛋白表達(dá)條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

真核表達(dá)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PSORT II Prediction軟件和亞細(xì)胞定位結(jié)果均表明BLM全蛋白的亞細(xì)胞定位主要集中在細(xì)胞核中，部分在細(xì)胞質(zhì)中，其中細(xì)胞核中占87.0%，細(xì)胞質(zhì)中占4.3%，細(xì)胞骨架中占4.3%，質(zhì)膜中占4.3%；這與該蛋白在細(xì)胞質(zhì)核糖體中合成，隨后轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核中行使其主要生理功能相吻合。此外，為進(jìn)一步證明BLM蛋白主要在細(xì)胞核中表達(dá)，本研究通過(guò)熒光定量PCR試驗(yàn)，檢測(cè)入核關(guān)鍵蛋白R(shí)an的表達(dá)情況。Ran 蛋白是一種 G 蛋白，與單分子鳥(niǎo)嘌呤核苷酸形成結(jié)合體（Ran-GTP）調(diào)節(jié)被轉(zhuǎn)運(yùn)物復(fù)合體的組裝和解體，在細(xì)胞核中釋放出攜帶NLS 的靶蛋白［20］。結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染pEGFP-N3-BLM質(zhì)粒48 h后，BLM基因?qū)崿F(xiàn)了超表達(dá)，而Ran基因表達(dá)量卻有所下降。分析原因，可能主要與檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)的選擇有關(guān)。轉(zhuǎn)染后48 h雖然BLM仍處于高表達(dá)狀態(tài)，但細(xì)胞為維持自身正常生命代謝，可能會(huì)通過(guò)調(diào)節(jié)Ran蛋白的表達(dá)量來(lái)阻止BLM的持續(xù)入核，因此在48 h 檢測(cè)Ran基因，其表達(dá)量在轉(zhuǎn)錄水平會(huì)明顯降低。Western Blotting檢測(cè)證實(shí)構(gòu)建的真核表達(dá)載體和原核表達(dá)載體均能在PC3細(xì)胞和BL21細(xì)胞中表達(dá)出一個(gè)分子量約為179 kD 的蛋白質(zhì)，與預(yù)測(cè)分子量大小基本一致，說(shuō)明構(gòu)建的兩個(gè)表達(dá)載體正確無(wú)誤。

4 結(jié)論

成功克隆了BLM基因CDS區(qū)，構(gòu)建了pEGFPN3-BLM真核表達(dá)載體和pET-32a-BLM原核表達(dá)載體，并通過(guò)亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)證明了BLM蛋白主要在細(xì)胞核中表達(dá)，Western Blotting實(shí)驗(yàn)證實(shí)論文構(gòu)建的原核表達(dá)載體和真核表達(dá)載體均能在相應(yīng)的宿主細(xì)胞中正確表達(dá)。