基于SRAP和SSR標(biāo)記構(gòu)建的杏扁遺傳連鎖圖譜

王曉燚 孔德晶 艾鵬飛

（河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，石家莊 050018）

杏扁（Armeniaca vulgaris×A. sibirica）是我國特有的杏屬栽培品種，屬于苦杏仁甙含量低仁用杏類型。杏仁食用價值大，不僅含有大量的糖類、蛋白質(zhì)、脂類等營養(yǎng)成分，而且有豐富的銅、鋅、鉀、磷、鐵等無機微量元素及10多種維生素，是滋養(yǎng)補身的上佳果品。據(jù)2015年統(tǒng)計，全國杏扁種植面積超過約333 hm2，年產(chǎn)甜杏仁約合5.13萬t，出口甜杏仁1.0-1.5萬t，創(chuàng)匯居出口土特產(chǎn)首位［1］。杏扁種植在北方，屬于早花植物，早春開花時易受到低溫倒寒流的凍害，造成杏果的大量減產(chǎn)，嚴(yán)重時甚至顆粒無收，故凍害一直是杏扁的種植和生產(chǎn)的最大威脅［2-4］。自20世紀(jì)70年代開始，我國的研究者對杏扁的抗寒性生理機制進行了大量的研究，期望選育出抗凍害的優(yōu)良樹種。可是杏扁的抗寒性受到內(nèi)在生長發(fā)育時營養(yǎng)物質(zhì)含量和外在栽培條件等因素的影響，僅僅通過生理指標(biāo)的評判易造成誤差，導(dǎo)致抗寒育種進程緩慢。因此，要從根本上解決杏扁的抗寒性，需要從DNA水平上分析杏扁的遺傳背景，構(gòu)建連鎖圖譜和抗寒性QTL研究。

自Weeden等［5］提出了“雙假測交”（Double pseudo test cross）的理論后，國內(nèi)外的研究者對鮮食杏遺傳圖譜構(gòu)建的研究取得了一定的進展。Hurtado等［6］利用AFLP、RAPD、RFLP和SSR標(biāo)記，以‘Goldrich’בValenciano’雜交的F1代為作圖群體，構(gòu)建了父母本的遺傳連鎖圖譜。Vilanova等［7］以‘Stark Early Orange’בTyrinthos’的F1代自交獲得的76株F2群體為材料，采用AFLP和SSR標(biāo)記構(gòu)建了杏的遺傳連鎖圖譜。國內(nèi)，章秋平等［8］利用杏‘串枝紅’ב金太陽’的F1為作圖群體，采用SSR和SRAP標(biāo)記構(gòu)建了雙親的連鎖圖譜。然而，在杏扁遺傳連鎖圖譜構(gòu)建方面的研究還未見報道。

本研究選用抗寒性差的‘龍王帽’授粉抗寒性強的‘優(yōu)一’獲得的F1代為作圖群體，利用SRAP和SSR標(biāo)記構(gòu)建杏扁的遺傳連鎖圖譜，以期為杏扁的抗寒性QTL定位及分子標(biāo)記輔助育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

以抗寒性強的品種‘優(yōu)一’為母本，抗寒性差的品種‘龍王帽’為父本雜交產(chǎn)生的F1代為作圖群體。2015年春季去雄雜交，當(dāng)年秋季采收獲種子，2016年早春催芽后進行種植。材料種植在張家口市農(nóng)業(yè)科學(xué)院的仁用杏資源圃。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取和F1雜種的鑒定 2017年春，采摘父母本和2年生F1代植株的嫩葉，采用本實驗室改良的CTAB［9］法提取DNA，稀釋到50 ng/μL后，貯存于-20℃冰箱備用。為保證作圖群體材料的真實性，選用5對具有父本特異性條帶的SRAP引物，對F1單株進行鑒定。

1.2.2 SRAP與SSR反應(yīng)體系及擴增程序 實驗所用的SRAP引物采用Li和Quiros［10］公布的序列，SSR引物采用方閃閃［11］開發(fā)的杏扁SSR引物系列。引物由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司合成。

SRAP-PCR反應(yīng)體系：Taq酶1.5 U，Mg2+2.5mmol/L，DNA模板30 ng，dNTPs 0.2 mmol/L，引物0.9 μmol/L，1×Buffer。PCR 反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性 5 min；94℃變性1 min，35℃復(fù)性1 min，72℃延伸1.5 min，5個循環(huán)；94℃變性 1 min，52℃復(fù)性 1 min，72℃延伸1.5 min，28個循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。擴增產(chǎn)物采用2.0%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄。

SSR-PCR反應(yīng)中各組分濃度為：Mg2+1.5 mmol/L，dNTPs 0.3 mmol/L，Taq酶 1.5 U， 引 物濃 度 0.25 μmol/L，DNA 模 板 30 ng，1×Buffer。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性45 s，Tm±2℃復(fù)性45 s，72℃延伸90 s，30個循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。擴增產(chǎn)物采用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）電泳，銀染后拍照分析。

1.2.3 分子連鎖圖譜的構(gòu)建 根據(jù)“雙假測交”理論，參照梁小玉等［12］進行SRAP條帶的統(tǒng)計，每個位點用“引物組合+條帶大小”命名，將凝膠圖上擴增出的條帶記作“1”，沒有條帶記作 “0”，模糊不清或者缺失的記作“-”，然后按照J(rèn)oinMap 4.0軟件CP模式將初始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為數(shù)據(jù)矩陣。SSR標(biāo)記按照J(rèn)oin Map 4.0軟件中CP模式的要求對原始數(shù)據(jù)的進行記錄并整理，不清晰或無條帶的標(biāo)記記為“-”。按照孟德爾分離規(guī)律，對F1群體所有條帶進行卡方（χ2）檢驗，顯著水平為0.01，將偏分離顯著的標(biāo)記剔除。利用Join Map 4.0軟件對余下的標(biāo)記進行遺傳連鎖分析，將LOD值設(shè)置為3.0-8.0運算，設(shè)置遺傳分析的參數(shù)最大重組率為r=0.4，通過Kosambi函數(shù)［13］將重組率轉(zhuǎn)換為圖距（cM），分別構(gòu)建出父本和母本的分子遺傳圖譜。

2 結(jié)果

2.1 多態(tài)性引物篩選

以父母本的DNA為模板對374對SRAP引物及21對SSR引物進行擴增多態(tài)性篩選，SRAP標(biāo)記選出65對能在父母本之間擴增出位點多樣、條帶清晰，并能夠重復(fù)試驗的引物，引物入選率為17.38%。SSR標(biāo)記選出17對引物在父母本間表現(xiàn)出豐富的多態(tài)性，引物入選率為81%。

2.2 雜種鑒定

自篩出的SRAP引物中選取的5對能擴增出父本特異性條帶的引物組合。對122株雜種后代進行鑒定，以出現(xiàn)父本特異性條帶為標(biāo)準(zhǔn)，從122株子代中鑒定出98株為雙親雜交的真實子代，在田間對這98株子代個體的表觀特征進行復(fù)查，從而更加確定了這98株子代就是‘優(yōu)一’ב龍王帽’真實的雜交子代。

2.3 SRAP及SSR標(biāo)記的多態(tài)性和偏分離分析

SRAP標(biāo)記擴增結(jié)果（圖1）：采用65對篩選出多態(tài)性良好的引物，對子代群體進行PCR擴增，總共檢測出標(biāo)記位點234個，將這些位點分為3種類型統(tǒng)計：（1）np×nn分離類型，即父本為雜合基因型np，母本為純合基因型nn，子代孟德爾分離比為1∶1，屬于該類型的標(biāo)記位點為41個，占多態(tài)性標(biāo)記總數(shù)的17.52%。（2）lm×ll分離類型，即母本為雜合基因型lm，父本為純合基因型ll，子代孟德爾分離比為1∶1，屬于該類型的標(biāo)記位點為96個，占多態(tài)性標(biāo)記總數(shù)的41.03%。（3）hk×hk分離類型，即雙親均為雜合基因型hk，子代可能的基因型為h-和kk或hh和k-，孟德爾分離比為3∶1或1∶3，屬于該類型的標(biāo)記位點為97個，占多態(tài)性標(biāo)記總數(shù)的41.45%。平均每對引物組合擴增出3.6條多態(tài)性條帶。通過卡方（χ2）檢驗（α=0.01）發(fā)現(xiàn)：偏離孟德爾分離比的父本位點有12個，在所有的父本特異標(biāo)記中占29.2%；偏離孟德爾分離比的母本位點有23個，在所有的母本特異標(biāo)記中占23.9%；偏離孟德爾分離比的父母本共有的位點28個，在父母本共有的標(biāo)記中占28.9%。

SSR標(biāo)記擴增結(jié)果（圖2）：利用17對選出的SSR引物對作圖群體進行擴增，由于SSR引物較少，所以擴增出的結(jié)果只有np×nn和lm×ll兩種類型。其中屬于np×nn分離類型的有7個，占多態(tài)性標(biāo)記總數(shù)的41.18%。屬于lm×ll分離類型的有10個，占多態(tài)性標(biāo)記總數(shù)的58.82%。這兩種分離類型的孟德爾分離比均為1∶1。通過卡方（χ2）檢驗（α=0.01），有1個父本雜合位點出現(xiàn)偏離分離現(xiàn)象，占父本特有標(biāo)記總數(shù)的14.3%；有1母本雜合位點出現(xiàn)偏離分離現(xiàn)象，占母本雜合位點總數(shù)的10%。

圖1 SRAP引物M4-E4擴增群體的電泳圖

2.4 分子遺傳圖譜的構(gòu)建

本實驗共擴增得到234個SRAP標(biāo)記和17個SSR標(biāo)記，利用Join Map 4.0軟件中的CP 作圖模型，先將48個np×nn分離類型及97個hk×hk分離類型的標(biāo)記位點進行連鎖分析，構(gòu)建父本‘龍王帽’的分子連鎖圖譜，命名為M1-M8（圖3，表1），父本圖譜擁有8個遺傳連鎖群，共定位了53個SRAP標(biāo)記位點以及9個SSR標(biāo)記位點，圖譜的圖距總長度為694.8 cM，平均圖距為11.21 cM，相鄰位點間最小距離為0.6 cM，平均每個連鎖群上有7.75個標(biāo)記位點，連鎖群平均長度為86.85 cM。

再利用106個lm×ll分離類型及97個hk×hk分離類型的標(biāo)記位點進行連鎖分析，構(gòu)建母本‘優(yōu)一’的分子連鎖圖譜，命名為Y1-Y8（圖4，表2），母本圖譜同樣擁有8個遺傳連鎖群，定位了79個SRAP標(biāo)記位點以及8個SSR標(biāo)記位點，圖譜的圖距總長度為924.8 cM，平均圖距為10.63 cM，相鄰位點間最小距離為0.4 cM，平均每個連鎖群上有10.87個標(biāo)記位點，連鎖群平均長度為115.6 cM。為了得到標(biāo)記密度較高的圖譜在其中加入部分偏分離標(biāo)記，此類位點在遺傳圖譜中用“*”標(biāo)出。

圖2 SSR引物UDP96-008擴增群體的電泳圖

3 討論

親本的選擇和群體的創(chuàng)建是構(gòu)建遺傳連鎖圖譜的基礎(chǔ)。本研究選取的雜交親本‘龍王帽’和‘優(yōu)一’雖屬種內(nèi)雜交，但杏扁屬于遺傳變異豐富且高度雜合的樹種，導(dǎo)致種內(nèi)雜交所產(chǎn)生的F1代群體存在較高頻率的分離位點?！半p假測交”理論為高度雜合的木本植物遺傳圖譜的創(chuàng)建提供了理論依據(jù)，已被廣泛地應(yīng)用于異花授粉植物F1群體的作圖中。與其它作圖群體相比，F(xiàn)1群體作圖節(jié)省時間且操作簡單，同時也避免了自交不親和的障礙。故本研究基于“雙假側(cè)交”策略對F1群體進行作圖，可視為回交群體模型來進行圖譜構(gòu)建［14］。

前人研究表明，標(biāo)記的偏分離在作圖過程中普遍存在［15，25］，且在連鎖圖中的比例一般在6.8%-31.8%之間［16］。本實驗對標(biāo)記偏分離進行分析，獲得的234個多態(tài)性標(biāo)記位點中，有65個標(biāo)記屬于偏分離標(biāo)記，在所有的多態(tài)性標(biāo)記中占27.8%。依據(jù)大多數(shù)科研學(xué)者的共識，導(dǎo)致遺傳位點發(fā)生偏分離的主要因素如下：基因組在雜交時發(fā)生結(jié)構(gòu)上的重排、缺失、插入和突變［17］，偏分離可能與群體類型有聯(lián)系［18］，環(huán)境因素、非同源重組、基因轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)座子等因素［19］，葉綠體DNA、線粒體DNA等表現(xiàn)為母性遺傳的細(xì)胞質(zhì)DNA［20］。

如何處理偏分離標(biāo)記，絕大多數(shù)研究者認(rèn)為可以將偏分離標(biāo)記加入到圖譜構(gòu)建中［21］。Bradshaw等［22］通過實驗證明，偏分離標(biāo)記擁有與正常分離的標(biāo)記同等效果的作圖效率，如果去除偏分離標(biāo)記可能導(dǎo)致某些連鎖圖譜中連鎖群的基因失去連鎖關(guān)系。因此，較認(rèn)同的作法是將偏分離的標(biāo)記與正常分離的標(biāo)記同等分析，如果能定位到圖譜上用“*”標(biāo)出。本研究中，同樣也有16個偏分離標(biāo)記被應(yīng)用到遺傳連鎖圖圖譜的構(gòu)建中，占作圖標(biāo)記的11%。

一般認(rèn)為，遺傳圖譜中的連鎖群上的標(biāo)記間平均間隔不大于20 cM［23-24］。本研究構(gòu)建的杏扁雙親2張圖譜中，母本8個連鎖群，標(biāo)記間平均圖距為10.63 cM，父本也是8個連鎖群，標(biāo)記間平均圖距為11.21 cM，達到了連鎖圖譜的基本要求。但本研究中父母本的連鎖群上的標(biāo)記分布不均勻，這與分析時所采用的標(biāo)記類型和數(shù)量偏少有關(guān)。今后我們應(yīng)該擴大作圖群體，采用更多類型和數(shù)量的分子標(biāo)記加密杏扁的遺傳圖譜。

4 結(jié)論

本研究采用篩選出的65對SRAP引物和17對SSR引物對杏扁‘龍王帽’ב優(yōu)一’的F1代群體進行遺傳分析，在獲得了234個SRAP標(biāo)記和17個SSR標(biāo)記的基礎(chǔ)上成功構(gòu)建了兩親本“龍王帽”和“優(yōu)一”的遺傳連鎖圖譜。該結(jié)果為后續(xù)深入研究杏扁重要農(nóng)藝性狀QTL定位奠定基礎(chǔ)。

圖3 父本‘龍王帽’的分子連鎖圖譜

圖4 母本‘優(yōu)一’的分子連鎖圖譜

表1 父本‘龍王帽’遺傳圖譜連鎖群的主要參數(shù)

表2 母本‘優(yōu)一’遺傳圖譜連鎖群的主要參數(shù)