小尾寒羊FSHR基因在生殖軸的表達(dá)研究

寸靜宇 ，劉秋月 ，王翔宇 ，狄 冉 ，胡文萍 ，張效生 ，張金龍 ，趙永聚 ，儲明星

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，北京 100193；2.西南大學(xué)動物科技學(xué)院，重慶 400715；3.天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300381）

多羔性狀是影響綿羊養(yǎng)殖業(yè)的重要經(jīng)濟(jì)性狀之一，所以提高每胎的產(chǎn)羔數(shù)是提升羊生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)效益的重要措施［1］。而綿羊多羔性狀候選基因的研究對于提高綿羊產(chǎn)羔性狀具有重要意義［2］。隨著科技進(jìn)步及許多與綿羊多羔性狀相關(guān)的候選基因的陸續(xù)發(fā)現(xiàn)［3］，在生產(chǎn)中利用分子標(biāo)記對綿羊多羔性狀的基因型選擇取得了很大進(jìn)展。

促卵泡激素（Follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）屬于糖蛋白類促性腺激素，是控制哺乳動物生殖的核心激素，由垂體合成分泌并通過外周血液循環(huán)作用于其卵巢中的受體（FSHR）來調(diào)控個體繁殖過程［4］。FSHR主要表達(dá)于卵巢顆粒細(xì)胞中，其表達(dá)水平與顆粒細(xì)胞的分化、卵泡閉鎖及成熟密切相關(guān)［5］。朱吉等［6］研究發(fā)現(xiàn)，在貴州黑山羊中，F(xiàn)SHR基因的表達(dá)水平對產(chǎn)羔數(shù)的影響達(dá)到了顯著水平（P＜0.05），由此推斷，F(xiàn)SHR基因可能是影響山羊產(chǎn)羔數(shù)的候選基因。胡亮等［7］研究發(fā)現(xiàn)，在多羔的金堂黑山羊卵巢中，F(xiàn)SHR基因mRNA的表達(dá)水平高于單羔的藏山羊（P＞0.05），金堂黑山羊的卵泡對FSH的敏感性高，這可能也是影響山羊高排卵數(shù)的重要機(jī)制。

鑒于此，本試驗在小尾寒羊群體中，使用Taqman探針法對FecB基因進(jìn)行分型，經(jīng)過連續(xù)觀察并記錄產(chǎn)羔數(shù)和黃體數(shù)（產(chǎn)羔數(shù)和黃體數(shù)均大于或等于2，則定義為多羔），確定了小尾寒羊FecB基因突變++型中產(chǎn)單羔和產(chǎn)多羔的個體，并以此為研究對象，使用實時熒光定量PCR技術(shù)，檢測FSHR基因在生殖軸相關(guān)組織中的表達(dá)情況，以探討FSHR基因表達(dá)與小尾寒羊（STH）產(chǎn)羔數(shù)之間的關(guān)系，為小尾寒羊多羔性狀的機(jī)理研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品及主要試劑

隨機(jī)選取3周歲健康狀況良好的小尾寒羊母羊6只（FecB++型單羔和多羔各3只），飼養(yǎng)于天津市畜牧獸醫(yī)研究所試驗羊場。用孕酮陰道栓（CIDR）對6只小尾寒羊進(jìn)行處理，12 d后撤栓，在撤栓后45 h屠宰并立即采集大腦、小腦、下丘腦、卵巢、子宮、輸卵管、垂體7種組織，液氮中保存，轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

RNA提取試劑盒購于天根生化科技有限公司（北京），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptTMRTReagent Kit）和熒光定量染料（SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ）均購于TaKaRa公司（大連）。

1.2 RNA提取

用Trizol和RNAprep pure動物組織總RNA提取試劑盒（天根生化科技北京有限公司）提取上述組織總RNA。利用Nanodrop 2000檢測所提取的總RNA濃度和OD值，并用1.5%的瓊脂糖凝膠對RNA進(jìn)行電泳檢測，置于-80℃冷凍備用。

1.3 cDNA合成

利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄體系總體積為20 μL，具體見表1。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為：37℃15 min，85℃5 s，獲得cDNA第一鏈。全程在冰上操作。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行5倍稀釋，用持家基因β-actin進(jìn)行PCR檢測，可成功擴(kuò)增。將符合標(biāo)準(zhǔn)的cDNA置于-20℃保存，以用于檢測目的基因的表達(dá)。

表1 反轉(zhuǎn)錄體系

1.4 定量引物設(shè)計

根據(jù)GenBank提供的綿羊FSHR基因mRNA序列（登錄號為：NM_001009289.1），利用 Primer Premier 6.0軟件進(jìn)行跨外顯子引物設(shè)計，以β-actin（NM_001009784.2）作為內(nèi)參基因。引物由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。引物名稱和序列以及擴(kuò)增片段大小見表2。

表2 熒光定量引物信息

1.5 實時熒光定量PCR

熒光定量檢測采用Roche Light Cycler?480Ⅱ型熒光定量PCR儀，以β-actin基因為內(nèi)參基因，每個樣品重復(fù)檢測3次。反應(yīng)體系總體積為20 μL，具體見表3。PCR 程序為：95℃預(yù)變性 5 s，95℃變性 10 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)；反應(yīng)結(jié)束后對熔解曲線進(jìn)行分析。

表3 實時熒光定量PCR體系

1.6 統(tǒng)計分析

熒光定量結(jié)果采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達(dá)量，數(shù)據(jù)差異顯著性用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，組間比較用單因素方差分析（One-way ANOVA），用最小顯著差異法（Least significant difference，LSD）進(jìn)行多重比較，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA提取與cDNA合成

使用動物組織總RNA提取試劑盒提取小尾寒羊各組織的RNA，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果表明，電泳條帶明亮清晰、整齊、無拖尾；以反轉(zhuǎn)錄之后的cDNA為模板對β-actin進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，設(shè)計的β-actin引物擴(kuò)增效果良好（圖1），目的片段與預(yù)期的97 bp一致，且條帶單一，可以用于后續(xù)的熒光定量試驗。

圖1 cDNA電泳檢測

2.2 綿羊FSHR基因在小尾寒羊（多羔和單羔）繁殖相關(guān)組織中的表達(dá)

利用熒光定量PCR技術(shù)對FSHR基因在大腦、小腦、下丘腦、卵巢、子宮、輸卵管和垂體組織中的表達(dá)水平進(jìn)行了研究，結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示：FSHR基因主要集中在卵巢、大腦、垂體組織中表達(dá)。FSHR基因在小尾寒羊多羔群體卵巢和垂體組織中的表達(dá)量均極顯著高于小尾寒羊單羔群體（P＜0.01）。

圖2 FSHR基因在小尾寒羊繁殖相關(guān)組織中的表達(dá)

3 討論

在人類和動物的生殖活動中，F(xiàn)SHR是重要的媒介［8］。FSHR主要表達(dá)于卵巢顆粒細(xì)胞中，其表達(dá)水平與顆粒細(xì)胞的分化、卵泡閉鎖及成熟密切相關(guān)。近年來，國內(nèi)外學(xué)者圍繞綿羊［4］、母馬［9］和貓［10］等動物的卵巢中FSHRmRNA表達(dá)方面做了大量研究。然而，F(xiàn)SHR除了在卵巢中表達(dá)外，研究者也發(fā)現(xiàn)在非性腺組織中表達(dá)。本研究對小尾寒羊下丘腦-垂體-卵巢軸相關(guān)組織FSHR表達(dá)進(jìn)行了定量檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SHR在小尾寒羊中主要集中在卵巢、大腦、垂體組織中表達(dá)，其中在卵巢高表達(dá)，這與前人的研究結(jié)果相一致。龍威海等［11］研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SHR在黔北麻羊、貴州白山羊和貴州黑山羊下丘腦、垂體、子宮、輸卵管和卵巢5種組織中均有表達(dá)；Huo等［12］的研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)情期的牦牛，F(xiàn)SHR主要在垂體和卵巢中表達(dá)。而本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SHR只在小尾寒羊的卵巢、大腦和垂體3種組織中表達(dá)，推測可能是因為物種差異。另外，Chen等［13］通過蛋白檢測發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SHR在牦牛的子宮環(huán)肌層、上皮細(xì)胞和固有層中表達(dá)，在輸卵管的粘膜皺襞中表達(dá)，在卵巢的顆粒層表達(dá)，所以本研究與前人研究的差異也可能是因為在試驗前期的采樣過程中，并未采集到基因在組織中高表達(dá)的部位。本研究中，產(chǎn)多羔的小尾寒羊FSHR在卵巢和垂體的表達(dá)量極顯著高于產(chǎn)單羔的小尾寒羊（P＜0.01），這與Goyal等［14］和龍威海等［11］的研究結(jié)果相一致，推測小尾寒羊的繁殖性能受到FSHR的調(diào)控，F(xiàn)SHR在繁殖相關(guān)組織的基因表達(dá)量可能與綿羊產(chǎn)多羔性狀有關(guān)。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SHR基因的表達(dá)與小尾寒羊產(chǎn)羔性狀存在一定程度的正相關(guān)，暗示其可能參與了小尾寒羊多羔性狀調(diào)控。深入研究該基因功能對綿羊產(chǎn)羔數(shù)性狀的選育具有一定的參考意義。