土大黃內(nèi)生真菌L10的培養(yǎng)條件優(yōu)化

盧甜甜，鄭雙芝，柴家樂(lè)，李曉菡，陳怡怡，吳丹丹，白雪蓮

（杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310016）

土大黃，別名紅筋大黃、金不換、血三七、化雪蓮、鮮大青，為蓼科酸模屬植物，主要分布在我國(guó)的浙江、四川、貴州、江蘇、福建、湖南等地。根和葉可以入藥，具有清熱解毒、止血、祛瘀、通便、殺蟲(chóng)等功效。秋季挖根，洗凈、切片，曬干或鮮用。10月份采葉，隨用隨采[1]。

內(nèi)生菌是指在其生活史的一段或全部階段，生活于健康植物的各種組織和器官的細(xì)胞間隙或細(xì)胞內(nèi)的微生物[2]。研究表明，內(nèi)生菌與病原菌在植物體內(nèi)相互競(jìng)爭(zhēng)空間、營(yíng)養(yǎng)，使病原菌得不到正常的營(yíng)養(yǎng)供給而消亡，從而增強(qiáng)宿主抵御病害的能力[3]。

項(xiàng)目組前期從土大黃植株中分離獲得86株內(nèi)生菌，經(jīng)抑菌活性篩選，發(fā)現(xiàn)內(nèi)生菌L10代謝產(chǎn)物抑菌活性強(qiáng)，具有極大的開(kāi)發(fā)應(yīng)用價(jià)值，因此對(duì)土大黃內(nèi)生真菌L10的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，以期為今后深入研究土大黃內(nèi)生真菌L10的代謝產(chǎn)物和大規(guī)模發(fā)酵奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株：土大黃內(nèi)生真菌L10，杭州師范大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供；馬鈴薯葡萄糖肉湯固體培養(yǎng)基（PDA）、馬鈴薯葡萄糖肉湯液體培養(yǎng)基（PDB）、鹽酸、氫氧化鈉，國(guó)藥集團(tuán)提供。

1.2 方法

1.2.1 菌體干質(zhì)量測(cè)量方法

以菌體干質(zhì)量為指標(biāo)，即取1 mL菌液加入離心管，以轉(zhuǎn)速8 000 r/min離心10 min，去掉上清液，菌體在105℃條件下烘至恒質(zhì)量即為菌體干質(zhì)量。

1.2.2 孢子懸浮液的制備

將內(nèi)生真菌L10接種到PDA固體培養(yǎng)基上，于28℃下培養(yǎng)7 d，每個(gè)培養(yǎng)皿中分別加入2 mL無(wú)菌水，用無(wú)菌接種環(huán)輕輕刮取菌落表面，用移液器吸取培養(yǎng)基表面孢子懸液加入錐形瓶中，各培養(yǎng)皿在一個(gè)錐形瓶中混勻，備用。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

（1）培養(yǎng)基初始pH值對(duì)菌體干質(zhì)量的影響。在250 mL錐形瓶中接入3 mL孢子菌懸液，再加入97 mL PDB液體培養(yǎng)基，用鹽酸溶液、氫氧化鈉溶液分別調(diào)節(jié) pH值至 5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，在 28℃，200 r/min搖床上培養(yǎng)7 d。

（2） 接種量對(duì)菌體干質(zhì)量的影響。在250 mL錐形瓶中分別接入2.5，5.0，10.0，15.0，20.0 mL孢子菌懸液；再依次加入97.5，95.0，90.0，85.0，80.0 mL PDB液體培養(yǎng)基，pH值自然，在28℃，200 r/min搖床上培養(yǎng)7 d。

（3） 培養(yǎng)溫度對(duì)菌體干質(zhì)量的影響。在250 mL錐形瓶中接入3 mL孢子菌懸液，再加入97 mL PDB液體培養(yǎng)基，pH值自然，分別設(shè)置溫度為15，20，25，30，35℃，在200 r/min搖床上培養(yǎng)7 d。

（4）裝液量對(duì)菌體干質(zhì)量的影響。在250 mL錐形瓶中分別接入1.5，3.0，4.5 mL孢子菌懸液，再依次加入48.5，97.0，145.5 mL PDB液體培養(yǎng)基，pH值自然，在28℃，200 r/min搖床上培養(yǎng)7 d。

1.2.4 Box-Behnken優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇培養(yǎng)溫度、接種量、裝液量3個(gè)因素為主因子，按照Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)安排試驗(yàn)，以菌體干質(zhì)量為評(píng)定指標(biāo)。試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)整理后，用Design Expert 10.0軟件進(jìn)行分析處理。

Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)條件對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響

2.1.1 培養(yǎng)基初始pH值對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響

菌種只有在適宜的pH值條件下才能良好生長(zhǎng)，pH值過(guò)高或者過(guò)低都不利于菌種的生長(zhǎng)。

培養(yǎng)基初始pH值對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響見(jiàn)圖1。

由圖1可知，菌體干質(zhì)量隨著初始pH值的升高呈先增大后減小的趨勢(shì)。當(dāng)pH值為7.0時(shí)，菌體干質(zhì)量最大，達(dá)到2.58 g/L；當(dāng)pH值達(dá)到7.5時(shí)，菌體的干質(zhì)量下降為2.42 g/L；培養(yǎng)基的自然pH值是6.8，接近于pH值的最適值。所以，無(wú)需對(duì)培養(yǎng)基的pH值進(jìn)行調(diào)整，即可達(dá)到較高的菌體生長(zhǎng)水平。2.1.2 接種量對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響

接種量與菌體總量成正比，接種量越大，菌體的調(diào)整期越短，而菌體總量越大；但是，受培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和反應(yīng)器體積的限制，分批培養(yǎng)能達(dá)到的菌體總量有限，接種量增大至一定程度時(shí)，不但對(duì)菌體生長(zhǎng)無(wú)益，而且容易造成菌體的老化和自溶。

接種量對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響見(jiàn)圖2。

由圖2可知，從2.5%～10.0%，隨著接種量的增加，菌體干質(zhì)量從1.78 g/L到4.83 g/L逐漸增大；當(dāng)接種量大于10.0%時(shí)，接種量繼續(xù)增大對(duì)菌體生長(zhǎng)無(wú)顯著影響。

2.1.3 培養(yǎng)溫度對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響

菌種生長(zhǎng)有各自適宜的溫度，超出這一范圍將不利于菌種生長(zhǎng)。

培養(yǎng)溫度對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響見(jiàn)圖3。

由圖3可知，在30℃條件下，菌體干質(zhì)量達(dá)到最大為2.17 g/L；在25℃條件下，菌體干質(zhì)量與最大菌體干質(zhì)量無(wú)顯著差異；而在其他溫度條件下，菌體干質(zhì)量顯著降低。因此25～30℃比較適宜菌種的生長(zhǎng)。

2.1.4 裝液量對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響裝液量越大，則菌體生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)越多。裝液量對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響見(jiàn)圖4。

由圖4可知，菌體干質(zhì)量在裝液量為100 mL時(shí)最大為2.1 g/L；在裝液量為150 mL時(shí)，菌體干質(zhì)量下降。

2.2 菌體生長(zhǎng)條件的優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用Box-Behnken模型選擇接種量X1、培養(yǎng)溫度X2、裝液量X3設(shè)計(jì)三因素三水平設(shè)計(jì)優(yōu)化試驗(yàn)。

試驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表2，回歸模型的方差分析見(jiàn)表3。

表2 試驗(yàn)方案及結(jié)果

利用Design Expert 10.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到菌體干質(zhì)量（Y）的多元回歸模型為：

模型復(fù)相關(guān)系數(shù)R=0.994，決定系數(shù)R2=0.986 2，顯著性檢驗(yàn)表明回歸模型極顯著，各因素對(duì)Y均有顯著影響（表3），模型有意義。模型中各因素的回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果（表3） 表明，接種量X1、培養(yǎng)溫度X2、裝液量X3對(duì)菌體干質(zhì)量影響均為極顯著，接種量與培養(yǎng)溫度、接種量與裝液量?jī)蓛芍g交互作用影響顯著。

表3 回歸模型的方差分析

利用復(fù)合函數(shù)極值法進(jìn)一步分析表明，當(dāng)X1=0.59，X2=0.08，X3=0.32，接種量為13%，培養(yǎng)溫度為28℃，裝液量為125 mL時(shí)，菌體干質(zhì)量有最大預(yù)測(cè)值，為5.162 g/L。為驗(yàn)證模型的有效性，用優(yōu)化得到的培養(yǎng)條件進(jìn)行試驗(yàn)（重復(fù)3次），測(cè)得實(shí)際菌體干質(zhì)量為5.126 g/L，與預(yù)測(cè)產(chǎn)量之間沒(méi)有顯著性差異，達(dá)到優(yōu)化前培養(yǎng)條件（250 mL錐形瓶裝液100 mL，接種量3%，培養(yǎng)溫度28℃） 菌體干質(zhì)量（約2.5 g/L） 的2.4倍。

3 結(jié)論

試驗(yàn)有效地優(yōu)化了土大黃內(nèi)生真菌L10的培養(yǎng)條件。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，用Box-Behnken模型對(duì)土大黃內(nèi)生真菌L10的液體培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，菌體干質(zhì)量從優(yōu)化前的2.5 g/L提高到優(yōu)化后的5.126 g/L，約為優(yōu)化前2.4倍。

所得內(nèi)生菌L10培養(yǎng)條件為其產(chǎn)生最佳代謝產(chǎn)物奠定了基礎(chǔ)，其代謝產(chǎn)物的相關(guān)研究需進(jìn)一步展開(kāi)。此外，培養(yǎng)基組成對(duì)菌體生長(zhǎng)影響很大，在此基礎(chǔ)上還可以進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)基配方，使菌體生長(zhǎng)代謝能力得到進(jìn)一步提高。