代謝組學研究技術(shù)及其應用概述

劉 偉 寇國棟

(河北師范大學生命科學學院 石家莊 050024)

1 代謝組學的概念

代謝組學是繼基因組學、轉(zhuǎn)錄組學和蛋白質(zhì)組學之后迅速發(fā)展起來的一門新興學科，它以生物系統(tǒng)中的代謝產(chǎn)物(由于實際分析手段的局限性，目前主要針對相對分子質(zhì)量1000以下的小分子)分子為對象，以高通量、高靈敏度、高分辨率的現(xiàn)代儀器分析方法為手段，結(jié)合模式識別等化學計量學方法，分析生物體系受刺激或擾動后代謝產(chǎn)物的變化規(guī)律或其隨時間的變化規(guī)律。在英文文獻中，早期的代謝組學研究著作使用了兩個不同的術(shù)語，即metabolomics和metabonomics。前者主要以單個細胞作為研究對象，F(xiàn)iehn[1]將其定義為定性和定量分析單個細胞或單一類型細胞的代謝調(diào)控和代謝流中所有低分子量的代謝產(chǎn)物；后者一般以動物的體液和組織為研究對象，Nicholson等[2]將其定義為生物體對病理生理或基因修飾等刺激產(chǎn)生代謝物質(zhì)動態(tài)應答的定量測定。目前，國內(nèi)的代謝組學研究小組達成共識，以metabonomics來表示“代謝組學”。

代謝組學是一門研究生物體內(nèi)源性代謝物質(zhì)的種類、數(shù)量及其在內(nèi)外因素作用下變化規(guī)律的學科，它是系統(tǒng)生物學的重要組成部分。相對于其他組學更能反映生物體的整體信息，因為代謝物處于生物系統(tǒng)生化活動調(diào)控的末端，反映的是已經(jīng)發(fā)生的生物學事件，基因表達和蛋白質(zhì)的變化對系統(tǒng)產(chǎn)生的影響都可在代謝物水平上得到體現(xiàn)。

2 代謝組學的研究內(nèi)容

在代謝組學的研究過程中，代謝組學的一些相關(guān)概念也不斷被提出來，目前已經(jīng)獲得廣泛認同的研究層次分為4個。

2.1 代謝物靶標分析 代謝物靶標分析針對某一或某幾種代謝物。例如，為了研究某基因改造后產(chǎn)生的主要影響，可以將研究限制在該基因編碼的蛋白所作用的特定底物或者作用產(chǎn)生的直接產(chǎn)物上。

2.2 代謝輪廓分析 為了解釋整個代謝途徑或感興趣的代謝途徑的作用，不用看基因的改變對植物代謝所有途徑的影響，只關(guān)注一定數(shù)量的預先確定的代謝產(chǎn)物。這些預先確定的代謝產(chǎn)物可能屬于某一類化合物或只是某一類代謝途徑所獨有。

2.3 代謝指紋分析 代謝指紋分析不分離鑒定某一具體的單一組分，只要求得到某一生物體的代謝物圖譜。在基因組學植物育種中，為了研究大量的品系，或者工業(yè)和臨床上診斷的需要，須確定生物的每一種代謝物及其含量。這種方法的高通量的比較可以區(qū)分出不同的樣品，用于分類等的研究。

2.4 代謝組學 在基因工程操作中一個基因的改變不止影響一條代謝途徑，即由于某一基因變化引起的多效反應，可以使看起來并不相關(guān)的途徑的代謝物水平發(fā)生變化。為了解這些效應，生物體中所有的代謝產(chǎn)物都要進行定性和定量研究，以全面反應所研究的生物系統(tǒng)的代謝組情況。

嚴格地講，只有第4層次才是真正意義上的代謝組學研究，但是目前還沒有發(fā)展出一種可以涵蓋所有代謝物而不管分子大小和性質(zhì)的代謝組學技術(shù)。

3 代謝組學研究技術(shù)的發(fā)展

3.1 樣品制備和預處理 樣品制備和預處理是代謝組學研究的初始步驟，也是最重要的步驟之一。在收集樣品時需考慮收集的時間、部位、種類、樣品群體等因素；在研究活體樣本時，還需考慮飲食、性別、年齡和地域等諸多因素的影響。樣品預處理對于代謝組學的分析具有至關(guān)重要的意義，不少研究工作聚焦在代謝組學的樣品預處理上。例如，Alzweiri等[3]比較了不同有機試劑處理血液和尿液樣品的效果，結(jié)果顯示乙腈和丙酮去除血樣中蛋白效果要高于甲醇和乙醇。Kind等[4]在尿液預處理上，考慮到生物酶的降解作用，采用尿素酶分解尿中含量很高的尿素，使一些被掩蓋的信息表現(xiàn)出來。

3.2 代謝組學數(shù)據(jù)處理方法 代謝組學研究中通常運用統(tǒng)計分析方法，對采集的多維海量信息進行壓縮降解和分析，得到有用信息。常用的統(tǒng)計模式識別方法有監(jiān)督法和非監(jiān)督法，其中主成分分析法和偏最小二乘法是最簡單也是比較有效的模式識別方法。數(shù)據(jù)處理中一些新的方法開發(fā)和應用有力地推動了代謝組學的發(fā)展。

3.3 代謝組學儀器分析技術(shù) 代謝組學儀器分析技術(shù)主要有核磁共振(NMR)、質(zhì)譜(MS)、色譜—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，以及多種分析平臺的聯(lián)合應用。

3.3.1 NMR技術(shù) NMR是當前代謝組學研究中的主要分析技術(shù)，能完成代謝產(chǎn)物中大多數(shù)化合物的檢測，可以滿足代謝組學對盡可能多的化合物檢測的目標，它所產(chǎn)生的波譜可檢測血漿、尿液、膽汁等生物基質(zhì)中具有特殊意義的微量物質(zhì)的異常變化。活體磁共振波譜和磁成像等技術(shù)，能夠無創(chuàng)、整體、快速地獲得機體某一指定活體部位的NMR譜，直接鑒別和解析其中的化學成分。其中，液相色譜——核磁共振(LC-NMR)技術(shù)已經(jīng)在代謝組學的研究中得到應用，Daykin等[5]利用該聯(lián)用技術(shù)分析了血中脂蛋白的代謝產(chǎn)物，為心血管疾病的研究提供了依據(jù)。

3.3.2 MS技術(shù) 相對于NMR靈敏度低、檢測動態(tài)范圍窄等弱點，MS具有較高的靈敏度和專屬性，可以實現(xiàn)對多個化合物的同時快速分析與鑒定。

3.3.3 色譜—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù) 色譜—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)兼?zhèn)渖V的高分離度、高通量及質(zhì)譜的普適性、高靈敏度和特異性，越來越多的研究工作將色譜—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)用于代謝組學研究。

3.3.4 多種分析平臺的聯(lián)合應用 每種分析平臺都存在自身的局限性，如定性過程復雜、難以實現(xiàn)全部代謝物的定量分析及準確性不足等許多關(guān)鍵問題仍然有待解決。將多種分析技術(shù)的代謝組學數(shù)據(jù)進行整合，既可提供更全面的代謝物輪廓信息，使結(jié)果更完善，也使不同分析技術(shù)的結(jié)果得到互相驗證，達到分析平臺優(yōu)勢互補[6]。Naz等[7]采用多平臺分析技術(shù)對大鼠血清樣本進行了代謝組學的研究，找到了相關(guān)標志物。應用多個分析技術(shù)互補的代謝組學研究思路，還成功地應用于大鼠肺癌樣本的分析，取得了顯著的成效。

4 代謝組學的應用研究

4.1 生物學領(lǐng)域 目前研究得比較多的是微生物代謝組和植物代謝組。

4.1.1 微生物代謝組學 微生物代謝組學研究可應用于微生物表型分類、突變體篩選和微生物代謝途徑研究等。在工業(yè)生產(chǎn)中，可以通過對微生物細胞內(nèi)代謝物質(zhì)的分析來實現(xiàn)對發(fā)酵過程的動態(tài)監(jiān)測，以優(yōu)化發(fā)酵條件。還可以通過微生物代謝工程的方法，得到更適合于規(guī)?；a(chǎn)的菌株。

4.1.2 植物代謝組學 植物代謝組學研究可以通過對不同基因型、生態(tài)型植物代謝組的比較，研究基因的改變和環(huán)境的改變對植物代謝的影響；另外，通過代謝物指紋圖譜的比較，可以進行代謝表型的分類。植物代謝組學研究中有代表性的是Taylor等利用GC/MS技術(shù)對不同基因型的擬南芥中433種代謝產(chǎn)物進行的分析，他們結(jié)合化學計量學的方法進行分類，確定了4種在分類中起較重要作用的物質(zhì)：蘋果酸、檸檬酸、葡萄糖及果糖[8]。

4.2 醫(yī)藥領(lǐng)域 主要涉及疾病診斷和藥物開發(fā)等方面的代謝組學應用研究。

4.2.1 疾病診斷代謝組學 由于機體的病理變化，使得機體的代謝產(chǎn)物也產(chǎn)生了某種相應的變化。對這些由疾病引起的代謝產(chǎn)物的響應進行分析，能夠幫助人們更好地理解病變過程及機體內(nèi)物質(zhì)的代謝途徑，有助于疾病的生物標記物的發(fā)現(xiàn)和輔助臨床診斷的目的。代謝組學在疾病研究中的應用主要包括病變標記物的發(fā)現(xiàn)，疾病的診斷、治療和預后的判斷。目前代謝組技術(shù)已應用于腦瘤、前列腺癌、乳腺癌和卵巢癌等引發(fā)的代謝物變化的體內(nèi)檢測，希望通過相應癌癥代謝標記物的檢測，對疾病的診斷和治療提供新的方法和思路。

4.2.2 藥物開發(fā)代謝組學 代謝組學在疾病動物模型的確證、藥物篩選、藥效及毒性評價和臨床評價等方面有著廣泛的應用。Nichol-son研究小組利用基于NMR的代謝組學技術(shù)，在藥物的毒性評價方面做了大量的卓有成效的工作。其工作涵蓋分析平臺的建立、方法的重現(xiàn)性、基因改變及相應代謝響應的特性研究、化學計量學方法等。他們用代謝組學的方法判斷藥物毒性影響的組織器官及其位點，推測藥物相關(guān)的作用機制，確定與毒性相關(guān)的潛在生物標記物，并在此基礎(chǔ)上建立供毒性預測的專家系統(tǒng)以及毒物影響動物內(nèi)源性代謝物隨時間變化的軌跡。

4.3 其他領(lǐng)域 在農(nóng)業(yè)方面，利用代謝組學技術(shù)能更快地尋找植物的功能基因，了解植物與環(huán)境的互作過程，加快農(nóng)作物品質(zhì)改良的進程；在食品方面，代謝組技術(shù)能用于食品的質(zhì)量和營養(yǎng)價值的評價，因為食品的質(zhì)量如外觀、風味、氣味、貨架期，以及營養(yǎng)價值如維生素含量、抗氧化性和營養(yǎng)成分等都是食品中由代謝產(chǎn)物共同決定的；在資源環(huán)境方面，通過對微生物代謝組的研究，可以更好地利用微生物降解環(huán)境污染物。

5 展望

隨著現(xiàn)代分析技術(shù)的快速發(fā)展以及數(shù)據(jù)處理軟件的不斷完善，代謝組學的發(fā)展將會更迅速，應用范圍更廣泛。臨床疾病診斷、植物學、藥物毒性評價和營養(yǎng)科學將從代謝指紋圖譜研究中大大受益。此外，代謝組學技術(shù)還可用于微生物和植物表型的快速鑒定，并可以指導開發(fā)具有重要應用價值的新型代謝物。與人群流行病學研究相結(jié)合，代謝組學研究疾病全過程也將從系統(tǒng)生物學角度進一步推動闡明疾病機制，造福于人類。