豬MMP20基因變異篩選及其與母豬繁殖性狀的關(guān)聯(lián)分析

吳俊靜，董斌科，喬 木，梅書棋，彭先文

（動物胚胎工程及分子育種湖北省重點實驗室/湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，武漢 430064）

豬的繁殖性狀是直接關(guān)系到養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng)濟收益的重要經(jīng)濟性狀，尤其是豬產(chǎn)仔數(shù)性狀，提高母豬產(chǎn)仔數(shù)對提高養(yǎng)豬業(yè)的總體經(jīng)濟效益意義重大。然而，母豬繁殖性狀多為低遺傳力的復(fù)合性狀，很難用常規(guī)育種技術(shù)進行遺傳改良，所以尋找控制母豬繁殖性狀的關(guān)鍵分子遺傳標(biāo)記，應(yīng)用于該性狀的分子輔助育種，對提高母豬繁殖性能具有重要意義。

基質(zhì)金屬蛋白酶-20（MMP20，Matrix Metallopeptidase 20）是基質(zhì)金屬蛋白酶家族中的一員，主要與牙齒發(fā)育密切相關(guān)，在降解釉原蛋白方面發(fā)揮重要作用。MMP20基因的突變可導(dǎo)致釉質(zhì)發(fā)育不良［1］，與齲齒有密切關(guān)系［2］。另有文獻報道，MMP20基因缺失與神經(jīng)母細胞瘤有關(guān)［3］。以上主要是在人和鼠中的研究結(jié)果，有關(guān)豬MMP20基因的研究甚少，有關(guān)MMP20基因?qū)ωi繁殖性能的影響還未見報道。湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院豬育種團隊通過全基因組關(guān)聯(lián)分析技術(shù)初步篩選發(fā)現(xiàn)MMP20與豬繁殖性狀相關(guān)，為此，本研究擴增了豬MMP20基因序列，利用該序列進行了多態(tài)性變異位點的篩選鑒定及與母豬繁殖性狀的關(guān)聯(lián)分析研究，以期獲得與母豬繁殖性狀相關(guān)的新分子標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品

采集了15頭梅山豬（英山縣綠源養(yǎng)豬專業(yè)合作社）、255頭大白豬（湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所原種豬場）母豬血樣，并收集大白豬群在2011—2017年期間的繁殖性狀記錄，主要包括總產(chǎn)仔數(shù)（TNB，total number born）、產(chǎn)活仔數(shù)（NBA，number born alive）、出生窩重（LW，litter weight）、出生個體重（BW，birth weight of piglet）、21日 齡 活 仔 數(shù)（NAd21，number alive in 21 days of born）、21日齡窩重（LWd21，litter weight in 21 days of born）。

基因組DNA采用北京百泰克生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的基因組DNA試劑盒（按該試劑盒說明書進行操作）提取。

1.2 豬MMP20基因多態(tài)性檢測

根據(jù)豬MMP20基因的基因組序列（GenBank登陸號：NC_010451）設(shè)計引物：上游引物：5′-TCTTACAGTAGACCTTGTGCCA-3′，下游引物：5′-TGGCTTGGGACGTTGAACCT-3′。在梅山豬和大白豬中，分別取15頭豬的DNA樣本混合，進行PCR擴增，PCR反應(yīng)體系50μL，體系中各組分的濃度為100 ng模板DNA、10×buffer（含Mg2+）4μL、上述上下游引物各0.5μmol/L、2.5μmol/L dNTPs、1UTaqDNA聚合酶。PCR的運行程序為：95℃預(yù)熱2 min；94℃變性20 s，62～57℃退火40 s（每個循環(huán)降低0.5℃），72℃延伸60 s，共11個循環(huán)；94℃變性20 s，56℃退火30 s，72℃延伸60 s，共30個循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗后，采用Gel Extraction Kit試劑盒進行純化。純化產(chǎn)物直接送到北京奧科公司進行DNA測序，對比篩選基因變異位點。

1.3 基因分型

利用上述引物，采用上述PCR產(chǎn)物直接測序法在大白豬群中進行基因分型。

1.4 統(tǒng)計分析

采用SAS 9.0軟件的GLM模型進行標(biāo)記的關(guān)聯(lián)分析。所采用模型為：Yij k=μ+Pi+S j+Gk+ei jk，其中Yijk為性狀表型值，μ為總體均值，Pi為胎次效應(yīng)，S j為季節(jié)效應(yīng)，Gk為基因型效應(yīng)，eijk為隨機誤差。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬MMP20基因多態(tài)性檢測結(jié)果

通過對梅山豬和大白豬兩個DNA混合樣本池進行MMP20基因片段擴增測序，在兩個品種豬中均檢測到豬MMP20基因第3內(nèi)含子中2個堿基突變位點，即位于該基因序列第14334 bp處的C＞G堿基突變（g.14334 C＞G）和第14369 bp的T堿基突變（g.14369 C＞T），如圖1所示。

圖1 豬MMP20基因第3內(nèi)含子2個堿基突變位點的測序圖譜

2.2 關(guān)聯(lián)分析

在255頭大白豬群及其共計868條胎次繁殖性狀記錄中分析了豬MMP20基因2個突變位點（g.14334bpC＞G和g.14369bpC＞T）基因型與母豬產(chǎn)仔數(shù)性狀的相關(guān)關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在大白豬群體中g(shù).14334bpC＞G和g.14369bpC＞T兩個位點完全連鎖，群體中只存在GG/CC、GC/CT、CC/TT 3種基因型。將3種基因型與母豬繁殖性狀進行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同基因型的母豬產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)、出生個體均重及21日齡窩重性狀均差異極顯著（P＜0.01）或顯著（P＜0.05）（表1）。GG/CC基因型個體產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)與21日齡活仔數(shù)均顯著低于GC/CT和CC/TT基因型個體（P＜0.05），產(chǎn)仔數(shù)存在GG/CC＜GC/CT＜CC/TT的關(guān)系。雖然，GG/CC基因型個體的出生個體重顯著高于GC/CT和CC/TT基因型個體（P＜0.05），但出生窩重顯著低于GC/CT和CC/TT基因型個體（P＜0.05）。

表1 豬MMP20基因突變與母豬繁殖性狀的關(guān)聯(lián)分析統(tǒng)計結(jié)果

3 小結(jié)與討論

本研究鑒定獲得了豬MMP20基因第3內(nèi)含子中的2個單堿基突變位點g.14334bpC＞G和g.14369bpC＞T。這兩個突變位點在基因組上間距35 bp，在本試驗檢測的大白豬群中完全連鎖，僅存在GG/CC、GC/CT、CC/TT 3種基因型。經(jīng)與母豬繁殖性狀的關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，這兩個突變位點顯著影響母豬總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)、21日齡活仔數(shù)、出生個體重和出生窩重等繁殖性狀（P＜0.05），并且產(chǎn)仔數(shù)性狀存在GG/CC＜GC/CT＜CC/TT的關(guān)系。因此，MMP20基因第14334 bp處的C等位基因以及第14369 bp處的T等位基因是產(chǎn)仔數(shù)的優(yōu)勢等位基因，在育種中應(yīng)予以保留攜帶這些優(yōu)勢等位基因的個體，有利于提高群體的產(chǎn)仔數(shù)性狀。

MMP20是新發(fā)現(xiàn)的一種基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs），具有鈣離子結(jié)合、金屬內(nèi)肽酶活化等功能，參與新陳代謝、蛋白水解等過程。目前該基因的研究多集中于口腔疾病方面，與牙釉質(zhì)疾病、食管癌、喉癌、舌癌相關(guān)［4］。近年來也有研究表明MMP20蛋白與子宮內(nèi)膜癌及預(yù)后不良有關(guān)［5］；該基因的突變與卵巢癌發(fā)病風(fēng)險顯著相關(guān)［6］。但未見報道此基因與繁殖性能相關(guān)，但是MMPs在月經(jīng)周期、排卵、胎盤形成、產(chǎn)后子宮恢復(fù)等過程中起重要作用［7］。郭敏等［8］發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜異位癥患者腹腔液中MMPs水平升高，可能與盆腔粘連的發(fā)生及嚴(yán)重程度相關(guān)；高揚等［9］也發(fā)現(xiàn)MMPs與子宮內(nèi)膜異位癥合并不孕癥有關(guān)；王卉菲等［10］報道MMPs蛋白參與影響胎盤淺著床過程；MMPs與雙胎早產(chǎn)也有密切的關(guān)系［11］。有關(guān)豬MMP20的研究極少，本研究發(fā)現(xiàn)了豬MMP20基因的2個遺傳突變位點顯著影響母豬繁殖性狀，然而其具體作用機制還需要做更深入的基因功能分析與研究。