擬南芥RPT2與RIP1互作調(diào)節(jié)下胚軸向光彎曲的功能鑒定

趙 翔 朱自億 王瀟楠 慕世超 張 驍

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擬南芥RPT2與RIP1互作調(diào)節(jié)下胚軸向光彎曲的功能鑒定

趙 翔 朱自億 王瀟楠 慕世超 張 驍*

河南大學生命科學學院/棉花生物學國家重點實驗室/植物逆境生物學重點實驗室, 河南開封 475004

擬南芥突變體表型類似于藍光受體雙突變體, 缺失強藍光誘導的下胚軸向光彎曲, 不同于雙突變體下胚軸向光性正常, 表明在RPT2上游存在受PHOT1抑制的旁路調(diào)節(jié)途徑。本文以RPT2為誘餌蛋白進行酵母文庫篩選, 成功篩選到包括JAC1 和PHOT1在內(nèi)的6個與RPT2互作的蛋白(RIPs,PT2nteractingrotein)。酵母互作驗證顯示, 其中有4個蛋白可以與RPT2相互作用。表型分析顯示基因?qū)?個突變體和, 發(fā)現(xiàn)和單突變體下胚軸向光彎曲正常, 而和雙突變體表型類似于雙突變體, 恢復擬南芥下胚軸向光彎曲反應, 暗示RIP1蛋白可能調(diào)節(jié)PHOT1介導強藍光抑制反應, 分析鑒定蛋白RIP1的生物學功能將有助于揭示PHOT1介導強藍光抑制反應的機制。

擬南芥; 藍光; 向光素; RPT2

光作為一個調(diào)控植物生長發(fā)育的重要環(huán)境因子, 主要體現(xiàn)在作為能源參與植物光合作用和作為信號被植物所感受以調(diào)控植物的生長周期和優(yōu)化光捕獲等[1-2]。藍光對植物來說很重要, 因為它可以通過調(diào)節(jié)植物的光形態(tài)建成、植物的運動以及生物鐘等諸多生理反應, 來增加植物的光捕獲或降低光傷害, 優(yōu)化植物在極弱或極強光逆境下生長[3-9]。擬南芥藍光受體向光素(PHOT1和PHOT2)的C末端含有Ser/Thr蛋白激酶區(qū)域[3], N端含有與FMN (flavin mononucleotide)結(jié)合對光照、氧氣及電壓差敏感的2個LOV (light, oxygen, voltage)區(qū), 可調(diào)節(jié)其C末端激酶活性[4]。藍光激發(fā)引起一個可逆的光循環(huán)反應, FMN和LOV區(qū)內(nèi)保守的半胱氨酸之間形成共價結(jié)合, 誘導蛋白構象變化, 激活C端激酶區(qū), 引起受體自磷酸化[5], 從而引起相應生理反應, 如植物向光性[6-7]、氣孔運動[8]、葉綠體運動[6]、葉片伸展[2,9]等。

藍光受體PHOT1和PHOT2在介導強藍光誘導的下胚軸向光彎曲方面表現(xiàn)為功能冗余, 而單突變體向光彎曲增強,單突變體表型與野生型類似[10], 表明PHOT1有介導和抑制下胚軸向光彎曲的雙重作用。目前, 關于PHOT1和PHOT2介導的下胚軸向光彎曲信號傳遞方面的研究已取得一定進展[11-16], 然而PHOT1介導的強光抑制反應機制并不清楚[10]。RPT2 (ROOT PHOTOTROPISM2)是一個與NPH3 (NONPHOTOTROPIC HYPOCOTYL3)具有高度同源性的蛋白, 與NPH3屬于同一植物蛋白家族, 該家族含有32個成員, N端有一個BTB/POZ區(qū)(broad complex, tramtrack, Bric-à-brac/poxvirus and zinc finger), 而C端有一個卷曲螺旋域。已有研究證實NPH3可與PHOT1、PHOT2以及RPT2互作[17,2], 調(diào)節(jié)植物向光性和葉片伸展與定位等[9,18-19]。

基因突變擬南芥缺失任何強度藍光反應[18,20-21], 而基因突變, 擬南芥僅缺失強藍光誘導的下胚軸向光彎曲反應, 表現(xiàn)為單突變體存在光強依賴的下胚軸向光彎曲反應現(xiàn)象, 即隨著藍光強度增加下胚軸彎曲度減小, 高強光不彎曲[11,16,18]。RPT2的表達依賴于光敏色素和隱花色素調(diào)控[11,16,22], 但是RPT2調(diào)節(jié)強光誘導的下胚軸彎曲主要通過與NPH3以及PHOT1形成的復合物來發(fā)揮功能的[11,16,18,20]。其中, PHOT1感受藍光調(diào)節(jié)NPH3從膜上的解離, RPT2介導NPH3的回膜過程[16,23]。有趣的是, 強藍光處理時,單突變表型同和雙突變體一樣, 缺失下胚軸向光彎曲, 然而雙突變體恢復向光彎曲[18], 暗示在RPT2上游存在受PHOT1抑制的旁路調(diào)節(jié)途徑。即在背景下突變基因(PHOT1調(diào)節(jié)的強藍光抑制被解除),雙突變體恢復向光彎曲。

為此, 我們以RPT2蛋白作為誘餌基因, 通過酵母文庫篩選, 尋找RPT2相互作用的蛋白, 以期獲得介導PHOT1藍光抑制反應的下游信號分子。目前, 已成功篩選到與RPT2相互作用的蛋白, 對該蛋白的研究將為揭示藍光受體PHOT1介導和抑制植物向光性的信號轉(zhuǎn)導交叉調(diào)控模式提供重要理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

擬南芥(L.)Columbia-0生態(tài)型用作野生型對照, 擬南芥突變體種子()、(),()和由Ken-ichiro Shimazaki (日本九州大學)惠贈。大腸桿菌()菌株DH5α、酵母()菌株Y2H、酵母雙雜交載體pGADT-7和pGBKT-7, 陽性和陰性對照載體pGADT-7、pGBKT-Lam和pGBKT-53均為本實驗室保存; X-α-Gal和Aureobasidin A (AbA)及酵母庫購自Clontech公司; 酵母質(zhì)粒提取試劑盒和各種氨基試劑購自索萊寶公司; KOD-Plus DNA聚合酶試劑盒購自Promega公司; 限制性內(nèi)切酶I、R I、H I、I和I等購自TaKaRa公司。

1.2 酵母庫篩選

參照He等[24]的方法進行酵母庫篩選。提取擬南芥Col-0的兩周幼苗的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA作為模板, 用RPT2引物RPT2-pGBKT7-LP: 5'-TGCCATG GAGATGGCAACAGAAGGAAAAAAC-3'和RPT2- pGBKT7-RP: 5'-GGCTGCAGTTAAGAGATTGAGA ATCTTCGTCTC-3', 擴增并回收PCR產(chǎn)物, 用I和I酶切后, 與載體pGBKT7-DNA-BD連接, 構建pGBKT7-RPT2載體。分別用pGBKT7-RPT2和空載體pGBKT7轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細胞, 取酵母混懸液涂布于SD/–Leu或SD/–Trp固體平板上, 30℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3~4 d觀察酵母菌的生長, 判斷誘餌蛋白對酵母菌株的毒性。以pGBKT7-53/pGADT7-T為陽性對照、pGBKT7-Lam/pGADT7-T為陰性對照, 將pGBKT7-RPT2與pGADT7空載共同轉(zhuǎn)化到酵母菌株Y2H中, 并將菌液涂布在DDO和QDO缺陷型培養(yǎng)基上, 30℃恒溫箱中培養(yǎng)3~4 d, 觀察兩種培養(yǎng)基上菌落生長判斷是否有自激活。

1.3 酵母雙雜交驗證

參照Wang等[25]的方法對篩選到的蛋白與RPT2進行酵母雙雜交驗證。

1.4 下胚軸向光彎曲度測量

參照Zhao等[10]的方法測量下胚軸向光彎曲度, 將黃化3 d生長約5~8 mm的擬南芥幼苗用鑷子小心移至0.8% MS培養(yǎng)基上, 使下胚軸與根部都緊貼培養(yǎng)基表面, 垂直放于23℃暗室, 水平單側(cè)藍光照射12 h。用數(shù)碼相機照相, 在電腦上用電子軟件E-尺測量彎曲度數(shù)。試驗重復3~5次, 統(tǒng)計其平均值。用檢驗進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 RPT2上游存在受PHOT1抑制的旁路調(diào)節(jié)下胚軸向光彎曲的途徑

單突變體表型同雙突變體和雙突變體一樣, 缺失弱藍光誘導的下胚軸向光彎曲(圖1-B, D)[11], 暗示PHOT1介導弱藍光誘導的下胚軸彎曲。同時發(fā)現(xiàn)基因突變擬南芥極弱藍光誘導的下胚軸彎曲反應正常(圖1-B, D)。有趣的是,單突變體完全缺失強藍光誘導的下胚軸彎曲反應, 在背景下突變構建雙突變體則恢復向光彎曲, 然而背景下突變基因并不能恢復向光彎曲(圖1-A, C)[18], 暗示在RPT2上游存在受PHOT1抑制的旁路調(diào)節(jié)途徑, 且不受PHOT2調(diào)節(jié)。為此, 以RPT2為誘餌蛋白, 通過酵母庫構建篩選與RPT2互作蛋白, 鑒定互作蛋白功能, 有望解析PHOT1調(diào)節(jié)強光抑制機制。

2.2 RPT2誘餌蛋白表達載體的構建及誘餌蛋白載體的毒性和自激活活性檢測

將pGBKT7-RPT2連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌后, 采用載體兩端的引物進行菌落PCR分析, 得到大小為1000~2000 bp的PCR產(chǎn)物(圖2-A), 由于RPT2的cDNA全長為1782 bp, 表明得到的克隆為潛在的陽性克隆。將該潛在陽性克隆進行搖菌培養(yǎng), 提取質(zhì)粒后進行雙酶切檢測。表明, 用I和I雙酶切得到的片段約為1800 bp, 符合預期的片段大小(圖2-A)。重組酵母雙雜交載體pGBKT7-RPT2轉(zhuǎn)化Y2H酵母菌株生長狀況與陽性對照載體pGBKT7轉(zhuǎn)化后的酵母菌生長狀況基本一致, 形成的菌落直徑約為1.5~2.0 mm, 表明融合蛋白對Y2H酵母菌沒有毒性作用(圖2-B)。

誘餌蛋白自激活檢驗表明, 陽性對照在DDO和QDO缺陷型培養(yǎng)基上均有單菌落長出, 而陰性對照與pGBKT7-RPT2/pGADT7具有相同的現(xiàn)象, 只有DDO培養(yǎng)基上有單菌落長出, QDO培養(yǎng)基中沒有(圖2-C)。上述結(jié)果說明, 在兩種質(zhì)粒已經(jīng)確定共轉(zhuǎn)到酵母菌株Y2H的情況下, 誘餌蛋白RPT2沒有自激活現(xiàn)象, 可用于酵母庫篩選。

圖1 單側(cè)強弱藍光差異誘導擬南芥野生型和突變體下胚軸向光彎曲

A和B: 擬南芥野生型和突變體和響應單側(cè)藍光(A: 100 μmol m–2s–1; B: 0.01 μmol m–2s–1)的下胚軸向光彎曲表型。C和D: 藍光(C: 100 μmol m–2s–1; D: 0.01 μmol m–2s–1)誘導下胚軸向光彎曲度測量統(tǒng)計結(jié)果。圖中每個數(shù)據(jù)分別來自3次獨立重復試驗, 大約15~20顆苗的平均值±標準誤。

A and B: phototropic phenotype of WT,,,,,andto 100 μmol m–2s–1(A) or 0.01 μmol m–2s–1(B) unilateral blue light for 12 h. C and D: bar graph of the phototropic curvature of seedlings from A (C) or B (D). Each column represents an average of three experiments (15–20 measurements each) ±SD.

2.3 酵母庫篩選

按照1.2的實驗方法對誘餌蛋白進行了酵母庫篩選。將篩選到的酵母菌落在QDO/X-α-Gal/AbA培養(yǎng)基上進行顯色分析(圖 2-D), 挑取與陽性對照顯色相似的單菌落(圖中箭頭所示)搖菌, 用酵母質(zhì)粒提取試劑盒提取酵母質(zhì)粒, 用通用引物(T7和3'AD)進行PCR鑒定, 確定提取的質(zhì)粒中除了誘餌基因是否還含有捕獲基因。測序結(jié)果顯示, 以RPT2為誘餌蛋白進行酵母庫篩選, 得到的潛在互作蛋白, 通過擬南芥網(wǎng)站進行了初步功能分析(表 1)。

2.4 酵母互作驗證

為了驗證PHOT1、JAC1、RIP1和RIP6蛋白與RPT2相互作用, 構建了相應的酵母載體, 并與RPT2進行酵母雙雜交驗證。通過多次實驗重復, 發(fā)現(xiàn)PHOT1與RPT2結(jié)合后酵母菌在QDO/AbA/X-α-Gal缺陷型培養(yǎng)基上可顯藍色(圖3-A), 驗證了PHOT1與RPT2具有相互作用, 這與之前文獻報道的一致[16,18]。同樣的方法驗證RPT2與JAC1、RIP1和RIP6蛋白的相互作用(圖3-B, C, D)。

表1 RPT2互作蛋白篩選目標蛋白列表

圖2 擬南芥RPT2互作蛋白酵母庫篩選體系建立

A: 重組酵母雙雜交載體的構建; B: 表達蛋白的毒性檢測; C: 酵母庫篩選誘餌蛋白自激活驗證; D: 酵母庫篩選結(jié)果顯色分析。

A: construction of recombinant yeast two hybrid vector; B: analysis of toxicity of recombinant yeast two-hybrid vector; C: validation of autonomously activate of bait gene; D: the color analysis of vectors of Yeast library screening.

圖3 RPT2與PHOT1、JAC1、RIP1和RIP6蛋白相互作用

A: RPT2與PHOT1相互作用; B: RPT2與RIP1相互作用; C: RPT2與JAC1相互作用; D: RPT2與RIP6相互作用。

A: RPT2 interacted with PHOT1; B: RPT2 interacted with RIP1; C: RPT2 interacted with JAC1; D: RPT2 interacted with RIP6.

2.5 酵母庫篩選基因表型驗證

根據(jù)酵母庫篩選結(jié)果, 定購了部分基因相關的突變體。經(jīng)純合體鑒定后, 本研究對突變體在強藍光(100 μmol m–2s–1)及弱藍光(0.01 μmol m–2s–1)下的下胚軸向光彎曲表型進行分析。由圖4可知, 弱藍光(0.01 μmol m–2s–1)單側(cè)處理, 明顯誘導野生型WT、突變體以及篩選到的基因?qū)耐蛔凅w和下胚軸向光彎曲(圖4-B, C)。強藍光(100 μmol m–2s–1)單側(cè)處理, 與野生型WT相比,單突變體表現(xiàn)缺失向光彎曲(圖4-A, C), 與單突變體表型不同, 突變體和表現(xiàn)下胚軸向光彎曲類似于野生型, 暗示并沒有明顯單突變表型(圖4-A, C)。為證明突變體和對應蛋白參與調(diào)節(jié)藍光受體PHOT1調(diào)節(jié)的強藍光抑制表型, 把突變體和分別與突變體雜交, 獲得和雙突變體。檢測強藍光下向光彎曲表型, 發(fā)現(xiàn)在突變體背景下突變基因, 部分地恢復了向光彎曲(圖5-A, B), 暗示RIP1蛋白可能參與PHOT1介導強藍光抑制彎曲調(diào)控。

圖4 擬南芥rip1突變體下胚軸彎曲反應

A和B: 擬南芥野生型和突變體和響應單側(cè)藍光(A: 100 μmol m–2s–1; B: 0.01 μmol m–2s–1)的下胚軸向光彎曲表型; C: 彎曲度的測量統(tǒng)計結(jié)果。圖中每個數(shù)據(jù)分別來自3次獨立重復試驗, 大約15~20顆苗的平均值±標準誤。

A and B: phototropic phenotype of WT,,, andin response to blue light (100 μmol m–2s–1for A and 0.01 μmol m–2s–1for B); C: measurement of phototropic curvature for A and B. The values are the average of three independent experiments (15–20 measurements each) ±SD.

3 討論

目前, 研究向光素PHOT1和PHOT2在調(diào)控植物運動反應, 如植物向光性、氣孔運動、葉綠體運動和葉片的伸展及定位等方面已取得一定的進展[26-28]。在植物生長發(fā)育過程中, PHOT1和PHOT2既可通過不同的信號通路調(diào)節(jié)藍光誘導的不同生理反應, 又可以共同的信號分子調(diào)節(jié)強藍光誘導下胚軸向光彎曲實現(xiàn)功能互補[10,26,29]。早期報道稱基因突變導致擬南芥缺失較強藍光(光照強度大于0.1 μmol m–2s–1)誘導的下胚軸彎曲反應, 極弱藍光(0.01 μmol m–2s–1以下光強)誘導的下胚軸彎曲反應正常[11,18], 暗示RPT2調(diào)節(jié)較強藍光誘導的反應。我們知道PHOT1可以介導較寬范圍藍光反應, 而PHOT2僅介導強藍光(光照強度大于1 μmol m–2s–1)誘導的反應[10,24,27], 表現(xiàn)出PHOT1和PHOT2調(diào)節(jié)藍光誘導的下胚軸彎曲既存在功能冗余又存在差異調(diào)節(jié)機制。Inada等[18]發(fā)現(xiàn)基因突變導致擬南芥缺失較強藍光反應, 然而在突變體背景下突變基因, 擬南芥恢復強藍光誘導的下胚軸彎曲反應, 然而背景下突變基因并不能恢復向光彎曲(圖1-A, C), 說明在RPT2上游存在受PHOT1抑制的旁路調(diào)節(jié)途徑, 該途徑并不受PHOT2調(diào)節(jié)。我們前期研究證實單基因突變擬南芥向光彎曲增強, 而基因突變部分抑制強藍光誘導的下胚軸彎曲反應[10], 表明PHOT1確實有介導和抑制下胚軸向光彎曲的雙重作用, 然而PHOT1抑制強藍光的機制并不清楚。

圖5 擬南芥雙突變體rpt2-2 rip1恢復下胚軸向光彎曲反應

A: 擬南芥野生型和突變體、和響應單側(cè)藍光(100 μmol m–2s–1)的下胚軸向光彎曲表型; B: 彎曲度的測量統(tǒng)計結(jié)果。圖中每個數(shù)據(jù)分別來自3次獨立重復試驗, 大約15~20顆苗的平均值±標準誤。

A: phototropic phenotype of WT,,, andin response to 100 μmol m–2s–1blue light; B: measurement of phototropic curvature for A. The values are the average of three independent experiments (15–20 measurements each) ±SD.

基于對在突變體背景下突變基因, 擬南芥恢復強藍光誘導的下胚軸彎曲反應, 我們推測PHOT1和RPT2信號通路應該有調(diào)節(jié)關系。為此, 本研究以RPT2蛋白作為誘餌基因, 篩選酵母文庫, 尋找RPT2互作蛋白, 以期獲得介導PHOT1藍光抑制反應的下游信號分子。目前, 已成功篩選到與RPT2相互作用的蛋白PHOT1、JAC1、RIP1和RIP6。酵母雙雜交試驗也證實, RPT2可與上述4種蛋白發(fā)生相互作用(圖3)。檢測RPT2互作蛋白對應突變體的下胚軸向光彎曲反應顯示, 強藍光(100 μmolm–2s–1)單側(cè)處理, 單突變體和表現(xiàn)下胚軸彎曲正常, 類似于野生型(圖4-A, B), 而和這兩種突變體表型類似于雙突變體, 恢復擬南芥下胚軸向光彎曲反應(圖5-A, B), 暗示突變體和對應蛋白可能位于藍光受體PHOT1下游介導強藍光誘導的下胚軸彎曲抑制反應。此外, 已經(jīng)證明與RPT2互作的蛋白JAC1參與藍光誘導的葉綠體聚光運動[27]?；蚓幋aKIX8蛋白, KIX8蛋白屬于KIX (KID interaction, KID作用區(qū))蛋白家族, 在擬南芥中該蛋白家族共有11個成員, 在其N端有一個KIX域[30]。KIX8可以與PPD2發(fā)生相互作用, 調(diào)節(jié)植物擬分生組織分裂, 調(diào)控植物葉片大小發(fā)育[31]。下一步鑒定獲得與RPT2互作蛋白的可能生物學功能, 明確其與PHOT1和RPT2調(diào)控關系, 將為解析PHOT1介導光抑制的作用機制提供重要的基礎。

4 結(jié)論

擬南芥突變體缺失強藍光誘導的下胚軸向光彎曲, 而雙突變體恢復下胚軸向光彎曲, 表明RPT2上游存在受PHOT1抑制的旁路調(diào)節(jié)途徑。篩選到包括JAC1和PHOT1在內(nèi)的6個與RPT2互作蛋白RIPs, 酵母互作驗證顯示其中有4個蛋白可以與RPT2相互作用。和單突變體下胚軸向光彎曲正常, 而和雙突變體表型類似于雙突變體, 恢復擬南芥下胚軸向光彎曲反應。初步推測RIP1可能調(diào)節(jié)PHOT1介導強藍光抑制反應。

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Functional Analysis of Hypocotyl Phototropism Modulated by RPT2-Interacting Protein RIP1 inL.

ZHAO Xiang, ZHU Zi-Yi, WANG Xiao-Nan, MU Shi-Chao, and ZHANG Xiao*

Key Laboratory of Plant Stress Biology / State Key Laboratory of Cotton Biology / College of Life Sciences, Henan University, Kaifeng 475004, Henan, China

Thesingle mutant lost phototropism, butdouble mutant shows phototropic response, indicating that PHOT1 has a function in inhibiting hypocotyl phototropism, and RPT2 maybe play vital role in these prosses. Here, we used RPT2 as bait protein to screen yeast library and successfully obtained six proteins interacted with RPT2 including JAC1 and PHOT1. Yeast hybridization verified that four of these proteins could interact with RPT2. Phenotypic analysis of two mutants of geneshowed that thesingle mutantandhad normal phototropism in response to high blue light, butanddouble mutant were defective in phototropism, similar with thedouble mutant. These results suggested that this protein may modulate PHOT1-mediated high blue light inhibitory response. Functional analysis of this protein will be helpful to promote the discovery of the mechanism of phot1-mediated inhibitory response.

; blue light; phototropins; RPT2

2018-03-21;

2018-08-20;

2018-09-26.

10.3724/SP.J.1006.2018.01802

通信作者(Corresponding author): 張驍, E-mail:xzhang@henu.edu.cn

E-mail: xzhao@henu.edu.cn

本研究由河南省高等學校青年骨干教師培養(yǎng)計劃項目(2015GGJS-020), 河南省高?？萍紕?chuàng)新人才支持計劃項目(17HASTIT035), 國家自然科學基金項目(31670289, 31570294)和河南省基礎與前沿技術研究計劃項目(142300413225)資助。

This study was supported by the Training Plan for Young Backbone Teachers in Colleges and Universities in Henan (2015GGJS-020), the Sponsored by Program for Science and Technology Innovation Talents in Universities of Henan Province (17HASTIT035), the National Natural Science Foundation of China (31670289, 31570294), and the Basic and Advanced Technology Research Project of Henan (142300413225).

URL:http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20180921.1134.004.html