人類腸道微生物研究進(jìn)展

李蔚然 陳 珉

(華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 上海 200241)

1 技術(shù)背景

人類腸道微生物數(shù)量龐大、種類繁多，被稱為“第二基因組”[1]，與機(jī)體健康有著極為密切的聯(lián)系。近年來(lái)，腸道菌群研究已成為生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。微生物組研究技術(shù)的迅猛發(fā)展，使得進(jìn)一步了解腸道微生物與人類機(jī)體的系統(tǒng)發(fā)育以及健康的關(guān)系成為可能。

腸道菌群的研究主要集中于對(duì)腸道中微生物多樣性(包括數(shù)量、種類和組成)的認(rèn)識(shí)。早期主要采用微生物鑒定和分類的方法，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步了解其功能活性，研究方法如革蘭氏染色法、糖發(fā)酵試驗(yàn)、IMViC試驗(yàn)等： 是通過(guò)微生物的分解糖類的能力、是否產(chǎn)酸、產(chǎn)氣等理化性質(zhì)進(jìn)行物種的鑒定與分類。腸道微生物的研究也正是基于這些技術(shù)手段而逐步發(fā)展起來(lái)的。

微生物普查大約始于25年前。最初使用的方法是16S rRNA基因測(cè)序[1]，先利用PCR技術(shù)克隆16S rRNA基因，再通過(guò)兩到三次Sanger法測(cè)序(一代測(cè)序)完成整個(gè)基因的測(cè)序。對(duì)不同個(gè)體進(jìn)行比較時(shí)，只需確定序列的光譜是否相似并判斷差異程度。但Sanger法測(cè)序的讀取長(zhǎng)度僅為幾百個(gè)堿基，每次只能獲得部分取樣基因的序列，靈敏度低，且成本昂貴，限制了取樣深度，對(duì)低豐度微生物的分析十分有限。目前已開發(fā)出了下一代測(cè)序技術(shù)，又稱二代測(cè)序技術(shù)或高通量測(cè)序技術(shù)，一次可對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條核酸分子進(jìn)行序列測(cè)定。這種方法快速、經(jīng)濟(jì)、通量高，每個(gè)樣品可產(chǎn)生高達(dá)數(shù)百萬(wàn)的讀數(shù)，但缺點(diǎn)是讀取長(zhǎng)度通常非常短[2]。隨后又發(fā)展出了三代測(cè)序技術(shù)，這是單分子測(cè)序技術(shù)，測(cè)序時(shí)無(wú)需經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)了對(duì)每一條DNA分子的單獨(dú)測(cè)序。二代測(cè)序和三代測(cè)序技術(shù)對(duì)宏基因組學(xué)研究在廣度上和深度上都產(chǎn)生了巨大的影響，帶來(lái)了研究方法的變革。

宏基因組研究，即對(duì)整個(gè)群落的DNA進(jìn)行測(cè)序，同時(shí)為編目群落中的生物體、基因和基因組提供更廣泛、復(fù)雜的微生物群落信息。高通量測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)使得對(duì)于一個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行全面深入的分析成為可能，并允許進(jìn)行更大規(guī)模的宏基因組研究。

人類腸道微生物的第一次群體規(guī)模的宏基因組研究由MetaHIT實(shí)施，測(cè)定了腸道中的1150種常見(jiàn)菌種、330萬(wàn)個(gè)基因[2]。人類微生物組計(jì)劃是迄今最大的人類微生物組研究，在Roche-454平臺(tái)上靶向16S rRNA基因的V3-V5區(qū)域、對(duì)健康志愿者樣本進(jìn)行測(cè)序，確定無(wú)疾病個(gè)體微生物多樣性，通過(guò)16S擴(kuò)增子測(cè)序分析和宏基因組測(cè)序確定群落組成和功能，鑒定了超過(guò)1000萬(wàn)個(gè)基因，將MetaHIT腸基因編目擴(kuò)展了近180萬(wàn)個(gè)，還檢測(cè)了各個(gè)身體部位之間的微生物關(guān)聯(lián)[2]。人類微生物組含有3500至35000個(gè)物種水平的運(yùn)算分類單位(OTU)[3]。胃腸道(包括口腔和糞便)是采樣部位中微生物最多樣化的，2012年的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)中包含了數(shù)千個(gè)OTU，共計(jì)約150個(gè)屬[4]。

隨著研究方法效率和精度的不斷提高，研究人員能快速地測(cè)得腸道微生物的DNA序列，通過(guò)生物信息學(xué)對(duì)這些數(shù)據(jù)進(jìn)行分析以確定腸道微生物的種類和群落組成，并結(jié)合非基因組(蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué))的分析將微生物組的遺傳信息和群落結(jié)構(gòu)與個(gè)體表型聯(lián)系起來(lái)。比對(duì)健康個(gè)體與疾病個(gè)體的腸道微生物，還能進(jìn)一步探究微生物對(duì)人類健康的影響。近年來(lái)，相關(guān)研究取得了顯著的成果。

2 人類腸道微生物與健康的關(guān)系研究進(jìn)展

2.1 腸道微生物與消化代謝 腸道是消化吸收的重要場(chǎng)所，腸道微生物對(duì)這一過(guò)程起著重要的調(diào)節(jié)作用。在盲腸和上行結(jié)腸中，碳水化合物發(fā)酵，微生物快速增長(zhǎng)；而在橫結(jié)腸和下行結(jié)腸中氨基酸發(fā)酵，微生物增長(zhǎng)速度變緩[5]。腸道菌群的基因組中存在許多編碼碳水化合物活性酶的基因，包括糖苷水解酶及糖基轉(zhuǎn)移酶等，可幫助宿主消化糖類[5]。

作為機(jī)體代謝的重要參與者，腸道微生物不僅能合成多種人體生長(zhǎng)發(fā)育所必需的維生素(如雙歧桿菌、乳酸桿菌可以合成維生素B1、B2、B6和B12，以及維生素K和葉酸等)，還能促進(jìn)礦物元素的吸收，幫助消化代謝[6]。研究表明，炎癥性腸病患者的糞便微生物群與健康受試者不同。例如，厚壁菌門在炎癥性腸病和感染性結(jié)腸炎患者中明顯不足[7]，而這些細(xì)菌可能是腸內(nèi)穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵，其數(shù)量的減少與腸黏膜的保護(hù)力降低表現(xiàn)出一定的相關(guān)性。有研究發(fā)現(xiàn)，腸道微生物群落的改變可能與患結(jié)腸或直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。Ahn等[8]擴(kuò)增了結(jié)腸直腸癌患者和對(duì)照受試者糞便細(xì)菌的16SrRNA基因，以Roche 454(GS FLX titanium system)超高通量測(cè)序技術(shù)，用QIIME (quantitative insights into microbial ecology)管道對(duì)基因組進(jìn)行分類，通過(guò)定量聚合酶鏈反應(yīng)確認(rèn)分類學(xué)差異。結(jié)果顯示患者整體微生物群落多樣性降低，厚壁菌門的相對(duì)豐度較低，其中梭菌屬的數(shù)量消減最為突出。革蘭氏陽(yáng)性梭菌特別是糞球菌屬可以有效地將膳食纖維和其他復(fù)合碳水化合物發(fā)酵為丁酸鹽，而丁酸鹽可能是具有抑制結(jié)腸炎和抑癌作用的主要結(jié)腸代謝物。

2.2 腸道微生物與疾病 腸道微生物除了具有調(diào)節(jié)消化代謝的作用，還與糖尿病[9]、肥胖癥[10]、腎結(jié)石[11]等多種疾病緊密關(guān)聯(lián)。

Qin等[12]基于鳥槍法測(cè)序進(jìn)行了宏基因組范圍關(guān)聯(lián)研究(MGWAS)，分析Ⅱ型糖尿病患者的腸道微生物，鑒定了60000種Ⅱ型糖尿病相關(guān)標(biāo)記物，建立了宏基因組連鎖群的概念，實(shí)現(xiàn)了分類種級(jí)分析。結(jié)果表明，Ⅱ型糖尿病的特點(diǎn)是中度的腸道菌群生態(tài)失調(diào)、某些產(chǎn)丁酸菌的減少(如腸道念珠菌和糞腸球菌濃度在患者體內(nèi)水平較低[9])和各種機(jī)會(huì)性病原體的增加。

科學(xué)家發(fā)現(xiàn)腸道微生物的群落結(jié)構(gòu)與肥胖癥相關(guān)，肥胖癥會(huì)導(dǎo)致微生物多樣性降低[13]。如果肥胖者的腸道菌群恢復(fù)到健康狀態(tài)可以改善與肥胖相關(guān)的病癥并幫助維持健康的體重[2]。具有相同遺傳背景的、喂食低脂肪食物的無(wú)菌小鼠中移植了肥胖者腸道菌群的小鼠出現(xiàn)了肥胖癥，移植了瘦人腸道菌群的小鼠變瘦[14]；如果把肥胖小鼠的腸道菌群移植給瘦小鼠，原先的瘦小鼠也會(huì)出現(xiàn)肥胖[13]，同時(shí)攜帶肥胖者與瘦人菌群的小鼠，體重的增加以及和肥胖相關(guān)代謝表型的形成受到了抑制[14]?？梢?jiàn)腸道微生物在肥胖癥中具有重要作用。

研究發(fā)現(xiàn)，草酸桿菌的定植與草酸鈣形成結(jié)石的風(fēng)險(xiǎn)降低表現(xiàn)出70%的關(guān)聯(lián)度[11]。草酸桿菌可在腸道中代謝草酸鹽，缺乏草酸桿菌可能會(huì)導(dǎo)致結(jié)腸吸收草酸鹽增加，造成尿中草酸鹽積累，有利于結(jié)石的形成[11]。

2.3 腸道微生物與免疫 早期B細(xì)胞發(fā)育可發(fā)生在腸固有層，受到共生微生物和腸免疫球蛋白庫(kù)細(xì)胞外信號(hào)的調(diào)節(jié)。實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)無(wú)菌小鼠接觸了微生物菌群，微生物在體內(nèi)定植，腸固有層中特異性表達(dá)Igλ和Igκ的B細(xì)胞的比例將會(huì)增加[15]，從而影響B(tài)細(xì)胞的發(fā)育。

表達(dá)Foxp3轉(zhuǎn)錄因子的CD4+T調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)對(duì)維持免疫內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定具有關(guān)鍵作用。腸道微生物群的孢子形成組分，特別是梭菌屬的IV和XIVa簇可提供富含轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β的環(huán)境，影響結(jié)腸中Foxp3+Tregs的數(shù)量及其功能[16]。常規(guī)飼養(yǎng)的小鼠早期以口服方式接種梭菌，成年后會(huì)表現(xiàn)出對(duì)大腸炎和全身性免疫球蛋白E反應(yīng)的抗性，這有可能成為治療自身免疫病和過(guò)敏反應(yīng)的新方法。

人在衰老的過(guò)程中，腸道微生物的多樣性逐漸降低，先前罕見(jiàn)的致病菌株逐漸占據(jù)主導(dǎo)地位。Smith等[17]將青年非洲青鳉魚的糞便喂食給中年青鳉魚(自身腸道菌群經(jīng)抗生素處理殺死)，吞食了青年小魚糞便的魚與對(duì)照組相比壽命顯著延長(zhǎng)，運(yùn)動(dòng)能力也與青年小魚類似。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果讓我們看到了腸道菌群移植對(duì)人類壽命延長(zhǎng)潛在的積極效果，但目前的證據(jù)十分有限，未來(lái)進(jìn)一步的研究或許能為延年益壽帶來(lái)更大的可能性。

2.4 腸道微生物與精神狀態(tài) 腸道菌群可影響哺乳動(dòng)物的大腦發(fā)育以及成體行為。與具有正常腸道菌群的小鼠相比，無(wú)菌小鼠運(yùn)動(dòng)較多、焦慮較少[18]。這種行為表型與有關(guān)運(yùn)動(dòng)控制和焦慮樣行為的第二信使通路和突觸長(zhǎng)期增強(qiáng)的基因在腦區(qū)域的表達(dá)改變相關(guān)。當(dāng)無(wú)菌小鼠接觸了正常的腸道菌群，腳手架蛋白PSD-95(postsynaptic density protein 95)和突觸素在紋狀體中的表達(dá)減少[18]，從而影響控制運(yùn)動(dòng)和焦慮行為的神經(jīng)元電路的信號(hào)機(jī)制。

腸道菌群還會(huì)影響神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育。胃腸道微生物群落異常的母體免疫激活(MIA)小鼠模型，表現(xiàn)出自閉癥譜系障礙[19](屬神經(jīng)發(fā)育障礙)。如果用與人類共生的脆弱擬桿菌對(duì)MIA小鼠后代進(jìn)行治療，可糾正腸道的通透性，改變微生物群落組成，進(jìn)而改善交際的刻板、焦慮和感覺(jué)運(yùn)動(dòng)行為的缺陷[19]。

有研究分析了晚期黑色素瘤患者的腸道菌群樣本，發(fā)現(xiàn)對(duì)免疫治療產(chǎn)生應(yīng)答的癌癥病人腸道中的細(xì)菌多樣性更高(尤其是產(chǎn)氣莢膜梭菌家族的細(xì)菌)，而且其體內(nèi)能特異性殺傷腫瘤的免疫細(xì)胞數(shù)量也比免疫治療不響應(yīng)的患者明顯增多。該研究還表明，在進(jìn)行免疫治療前通過(guò)給予抗生素、益生菌或者移植糞便改變腸道菌群，能增加免疫治療藥物的效果，這些新藥目前已用于治療幾種不同類型的癌癥，但仍需要進(jìn)一步的臨床試驗(yàn)驗(yàn)證。

3 展望

健康人的糞便移植到患者腸道，可重建腸道菌群。由于腸道微生物與營(yíng)養(yǎng)代謝、免疫、神經(jīng)發(fā)育相關(guān)，腸道微生物群落的改變會(huì)引發(fā)微生態(tài)結(jié)構(gòu)改變，導(dǎo)致肥胖癥、Ⅱ型糖尿病、腸炎等疾病，因此糞便移植可用于相關(guān)疾病的治療。

今后對(duì)于腸道微生物的研究將會(huì)更加深入、全面，將建立腸道菌群的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)、完善腸道微生態(tài)生物學(xué)信息，進(jìn)一步探究腸道微生物與人類疾病的關(guān)系、微生物與其宿主相互作用的機(jī)制以及如何通過(guò)改變微生物群治療疾病，加強(qiáng)人們對(duì)腸道微生物的認(rèn)識(shí)，從而促進(jìn)生物學(xué)、醫(yī)學(xué)以及食品等相關(guān)學(xué)科的發(fā)展，為人類健康做出貢獻(xiàn)。

現(xiàn)有的人類微生物組的研究方法正在不斷改進(jìn)，測(cè)序技術(shù)也在飛速發(fā)展中。人類遺傳學(xué)和基因組學(xué)的同步進(jìn)展提供了結(jié)合宿主基因型與微生物組表型研究的機(jī)會(huì)。未來(lái)的研究將整合宏基因組、轉(zhuǎn)錄組、代謝蛋白組和整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)，并在診斷、治療和預(yù)防等方面得到應(yīng)用。

(*通信作者)