神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子—β₁及Smad蛋白通路的影響

朱海燕 吳雄健 葉艷清 曾斌 謝志軍

[摘要]目的 研究神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞-T6（HSC-T6）增殖、凋亡的影響以及大鼠HSC-T6中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）/Smad蛋白通路的變化，探討NGF影響 HSC-T6增殖及凋亡的可能作用機(jī)制。方法 體外培養(yǎng)大鼠HSC-T6，將HSC-T6與不同濃度的NGF孵育，分為對(duì)照組（0 ng/ml NGF）、實(shí)驗(yàn)組（100 ng/ml NGF），應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HSC-T6凋亡情況，通過(guò)XTT法了解NGF對(duì)HSC-T6增殖的影響；免疫細(xì)胞化學(xué)法觀察NGF對(duì)HSC作用后TGF-β1、Smad3、Smad7表達(dá)的變化。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組（OD值為0.65±0.03）對(duì)HSC-T6的增殖抑制作用與對(duì)照組（OD值為0.73±0.01）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。實(shí)驗(yàn)組的凋亡率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組的TGF-β1、Smad3表達(dá)明顯降低，Smad7表達(dá)明顯升高（P<0.05）。 結(jié)論 NGF可抑制HSC-T6增殖、促進(jìn)其凋亡，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad蛋白通路有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]肝星狀細(xì)胞；凋亡；神經(jīng)生長(zhǎng)因子；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1

[中圖分類號(hào)] R332 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2018）8（c）-0004-04

[Abstract] Objective To study the influence of nerve growth factor （NGF） on the proliferation and apoptosis of hepatic stellate cell-T6 （HSC-T6） and transforming growth factor-β1 （TGF-β1）/Smad protein pathway change in HSC-T6 of rat， and explore the possible mechanism of NGF influencing HSC-T6 proliferation and apoptosis. Methods HSC-T6 of rat was cultured in vitro. HSC-T6 was incubated with different concentrations of NGF and divided into the control group （0 ng/ml NGF） and experimental group （100 ng/ml NGF）. The flow cytometry was used for detection of HSC-T6 apoptosis. By XTT， the influence of NGF on the proliferation of HSC-T6 was understood. The expression of TGF-β1， Smad3 and Smad7 after NGF affecting on HSC was observed by immunocytochemistry. Results The inhibition of HSC-T6 proliferation in the experimental group （OD value was 0.65±0.03） was significantly different from that in the control group （OD value was 0.73±0.01） （P<0.05）. The apoptosis rate of the experimental group was higher than that of the control group with a statistical difference （P<0.05）. The expression of TGF-β1 and Smad3 in the experimental group was down-regulated significantly， while the expression of Smad7 was greatly up-regulated compared with those in the control group （P<0.05）. Conclusion NGF can inhibit the proliferation of HSC-T6 and promote its apoptosis. The mechanism may be related to the regulation of TGF-β1/Smad protein pathway.

[Key words] Hepatic stellate cell； Apoptosis； Nerve growth factor； Transforming growth factor-β1

肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell，HSC）的活化是慢性肝病進(jìn)展的中心環(huán)節(jié)[1]。近期的研究表明，神經(jīng)生長(zhǎng)因子（nerve growth factor，NGF）可誘導(dǎo)HSC凋亡，但其相關(guān)作用機(jī)制尚未明確。TGF-β1是目前為止公認(rèn)最強(qiáng)的致肝纖維化細(xì)胞因子[2]，HSC TGF-β1/Smads信號(hào)通路的激活及其所導(dǎo)致的病理變化在肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展中具有非常重要的作用。本研究主要探討NGF影響 HSC增殖及凋亡的可能作用機(jī)制，尋找防治肝纖維化的新途徑。

1材料與方法

1.1 材料

NGF購(gòu)自美國(guó)RD公司；AnnexinⅤ-FITC購(gòu)自美國(guó)羅氏公司；TGF-β1、Smad3、Smad7抗體購(gòu)自武漢博士德公司；S-P超敏試劑盒（鼠/兔）及DAB顯色試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；DMEM培養(yǎng)液及胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司。HSC系HSC-T6由上海中醫(yī)藥大學(xué)徐列明教授提供，系SV40 轉(zhuǎn)染后的大鼠HSC，具有活化HSC表型。

1.2 方法

HSC-T6的培養(yǎng)與傳代：使用 DMEM培養(yǎng)液（含100 U/ml青霉素，100 U/ml鏈霉素，10%胎牛血清）進(jìn)行培養(yǎng)。設(shè)定培養(yǎng)溫度37℃，CO2濃度5%，濕度飽和。予隔天進(jìn)行1次換液。待細(xì)胞密度達(dá)80%～90%，以0.02% EDTA和0.25%胰蛋白酶分散細(xì)胞，按1∶4傳代。根據(jù)加入NGF濃度的不同分為對(duì)照組（0 ng/ml NGF）及實(shí)驗(yàn)組（100 ng/ml NGF）。

1.2.1 NGF對(duì)HSC-T6增殖的作用 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，細(xì)胞懸浮液濃度調(diào)至7×104/ml，接種于96孔板中，每孔200 μl，24 h后棄上清，加入各濃度NGF，兩組各設(shè)4個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h，而后將預(yù)配的 XTT比色液50 μl分別加入各孔，置于培養(yǎng)箱中再孵育4 h。使用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光值（OD值），設(shè)定主波長(zhǎng)570 nm，參考波長(zhǎng)690 nm。

1.2.2 NGF對(duì)HSC-T6凋亡的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，細(xì)胞懸液濃度調(diào)至5×105/ml，接種于 T-25培養(yǎng)瓶中，24 h后分別加入0 ng/ml及100 ng/ml的NGF培養(yǎng)24 h，收取所有細(xì)胞，取1×106洗滌細(xì)胞，加入100 μl的結(jié)合緩沖液，再加入AnnexinⅤ-FITC染液和碘化丙啶（PI）染液各2 μl，在室溫下避光染色30 min，然后再添加結(jié)合緩沖液300 μl，以流式細(xì)胞儀檢測(cè) HSC凋亡。

1.2.3 TGF-β1、Smad3、Smad7表達(dá)的測(cè)定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，細(xì)胞懸液濃度調(diào)配至7×104/ml，滴于預(yù)先處理好的置于6孔板內(nèi)的蓋玻片上，每孔0.4 ml，孵育24 h，將培養(yǎng)細(xì)胞在0 ng/ml及100 ng/ml的NGF中孵育，并另設(shè)不含 NGF的空白對(duì)照組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后以4%多聚甲醛固定細(xì)胞，分別使用 TGF-β1、 Smad3、 Smad7一抗，應(yīng)用 SP法進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，二甲苯透明，中性樹(shù)脂封片，在光學(xué)顯微鏡下胞膜或胞漿呈棕黃色的為陽(yáng)性細(xì)胞。每張切片在400×光鏡視野下共取10個(gè)視野，計(jì)數(shù)各自陽(yáng)性細(xì)胞所占比例。以各陽(yáng)性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)表示相應(yīng)蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組細(xì)胞增殖情況的比較

實(shí)驗(yàn)組NGF與HSC-T6作用24 h后，其OD值為0.65±0.03，與對(duì)照組（0.73±0.01）比較，對(duì)HSC-T6的增殖具有顯著抑制作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.2 兩組細(xì)胞凋亡情況的比較

實(shí)驗(yàn)組NGF作用HSC-T6 24 h后，凋亡率為（26.36±8.51）%，對(duì)照組為（6.88±1.35）%，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖1）。

2.3 TGF-β1、Smad3、Smad7蛋白表達(dá)的變化

實(shí)驗(yàn)組的TGF-β1、Smad3陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞率分別為（25.26±2.04）%、（30.24±1.52）%，與對(duì)照組[（76.24±2.54）%、（59.65±1.25）%]比較，均明顯降低（P<0.05），實(shí)驗(yàn)組的Smad7陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞率為（69.02±3.05）%，較對(duì)照組[（26.15±1.20）%]顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖2～5）。

3 討論

肝纖維化是肝硬化的早期病理改變和必經(jīng)階段，是由各種致病因素導(dǎo)致的肝臟慢性損傷。目前的研究結(jié)果認(rèn)為，致病因素?fù)p傷肝細(xì)胞后，Kupffer細(xì)胞被激活，分泌出多種細(xì)胞因子，共同作用于HSC，最終導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)在肝內(nèi)過(guò)量積聚進(jìn)而形成肝纖維化[3-5]。肝纖維化尚屬于可逆性病理變化，但若不及時(shí)干預(yù)，可進(jìn)展為肝硬化、原發(fā)性肝癌。HSC的活化和增殖是肝纖維化發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程中的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。活化HSC已成為防治肝纖維化的主要靶細(xì)胞之一，抑制靜止HSC活化、誘導(dǎo)活化HSC凋亡等是防治肝纖維化的一個(gè)重要策略[6-7]。

肝纖維化是肝臟組織對(duì)各損傷作用進(jìn)行過(guò)度修復(fù)的結(jié)果。而NGF作為一種重要的組織修復(fù)因子，其在肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展中到底扮演著怎樣的角色呢？有研究發(fā)現(xiàn)，在肝臟受損情況下，肝細(xì)胞可表達(dá)NGF，用重組體NGF培養(yǎng)HSC，細(xì)胞凋亡明顯增多，且具有劑量依賴性，該作用可能通過(guò)調(diào)節(jié)NF-κB的活性而實(shí)現(xiàn)[8-10]。作者前期研究結(jié)果也顯示，經(jīng) NGF作用的大鼠HSC出現(xiàn)明顯的增殖受抑現(xiàn)象以及細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變[11]。NGF可抑制 HSC合成Ⅰ、Ⅲ型膠原，誘導(dǎo)HSC凋亡，因此，抑制膠原分泌可能是NGF抗肝纖維化的作用機(jī)制[12]。另有研究表明，NGF可有效阻斷由四氯化碳所誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化，降低肝臟組織的炎癥活動(dòng)度[13]。

機(jī)體內(nèi)TGF-β異常表達(dá)可誘導(dǎo)各種肝病的發(fā)生，且在誘導(dǎo)HSC轉(zhuǎn)化為肌成纖維樣細(xì)胞的致纖維化進(jìn)程方面，TGF-β的作用尤為顯著[14-15]。在向肌成纖維樣細(xì)胞轉(zhuǎn)變過(guò)程中，大鼠HSC中TGF-β1 mRNA的表達(dá)水平顯著高于 TGF-β2 mRNA和 TGF-β3 mRNA[16]。與TGF-β2、TGF-β3比較，TGF-β1在肝纖維化進(jìn)程中發(fā)揮了更重要的作用。TGF-β1對(duì)HSC等細(xì)胞的調(diào)控作用可通過(guò)自分泌和旁分泌的方式實(shí)現(xiàn)。TGF-β1在胞外被激活后，可通過(guò)特異性受體結(jié)合到活化的HSC等細(xì)胞胞膜上，繼而主要由Smads介導(dǎo)，移位至細(xì)胞核，與具有特異序列的DNA相結(jié)合[17-18]，調(diào)控ECM等因子的目的基因轉(zhuǎn)錄并發(fā)生高表達(dá)，如此推動(dòng)肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展。其中，Smad2/3作為TGF-β1在胞內(nèi)主要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，負(fù)責(zé)信息的特異性轉(zhuǎn)導(dǎo)；而Smad7則相反，主要是對(duì)該轉(zhuǎn)導(dǎo)通路產(chǎn)生抑制作用[19-20]。TGF-β1/Smads通路在肝纖維化進(jìn)程中的地位舉足輕重，調(diào)控該通路以防治肝纖維化應(yīng)為一種理想的選擇。

目前，關(guān)于NGF如何誘導(dǎo)HSC凋亡機(jī)制的研究較少，而 TGF-β1/Smads是促進(jìn)肝纖維化進(jìn)展的重要通路，NGF作為一種修復(fù)因子，是否通過(guò)此通路誘導(dǎo)HSC凋亡從而發(fā)揮抗肝纖維化的作用？本研究發(fā)現(xiàn)，NGF可抑制HSC增殖、促進(jìn)其凋亡，其機(jī)制可能為通過(guò)上調(diào) Smad7表達(dá)、抑制 Smad3表達(dá)，最終降低TGF-β1表達(dá)水平，為今后進(jìn)一步研究NGF作用于HSC的相關(guān)作用機(jī)制提供前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為防治肝硬化及肝纖維化提供新路徑。

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