基于斑馬魚毒理基因組學(xué)的化學(xué)品測試技術(shù)研究進(jìn)展

王志浩，彭穎，王萍萍，夏普，張效偉,2,*

1. 污染控制與資源化研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京大學(xué)環(huán)境學(xué)院，南京 210023 2. 江蘇省環(huán)境保護(hù)化學(xué)品安全與健康風(fēng)險(xiǎn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210023

由于人類活動(dòng)的需求，市場上使用的化學(xué)品已逾10萬種，大部分(80%以上)現(xiàn)有化學(xué)品的環(huán)境安全信息是缺失的，且每年新化學(xué)品進(jìn)入市場的速度遠(yuǎn)大于傳統(tǒng)化學(xué)品風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)的速度[1-2]。依賴傳統(tǒng)的毒性測試(如利用大鼠、小鼠、兔子等模式動(dòng)物進(jìn)行測試)因?yàn)闇y試通量低、耗時(shí)長、成本高以及動(dòng)物倫理問題[3]，已經(jīng)不能滿足化學(xué)品毒性測試的需求[4]。發(fā)展快速、高效、低成本的化學(xué)品毒性預(yù)測技術(shù)已成為新的毒性測試思路[4-5]。另一方面，每年大約有3億噸化合物隨著工業(yè)、農(nóng)業(yè)、生活用水和地表徑流匯入環(huán)境水體，導(dǎo)致水體的污染嚴(yán)重。同時(shí)，除水體的急性毒性外，大量化學(xué)污染物長期低濃度存在于環(huán)境水體中，因此，低濃度復(fù)合污染持續(xù)暴露對人類和生態(tài)環(huán)境健康產(chǎn)生的風(fēng)險(xiǎn)也逐漸引起人們的重視。如何識(shí)別和評(píng)價(jià)復(fù)合污染水體的生物效應(yīng)和毒性是研究的難點(diǎn)[6]。

目前，復(fù)合污染水體的環(huán)境監(jiān)測與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估主要依賴于化學(xué)分析手段。盡管隨著分析儀器的發(fā)展，利用高通量靶向分析與非靶向分析的技術(shù)手段可以檢測出復(fù)雜環(huán)境樣品中的上百種(甚至上千種)化學(xué)污染物，但是化學(xué)分析檢測出的化學(xué)物質(zhì)并不能解釋復(fù)合污染的毒性，而且，環(huán)境中仍然存在現(xiàn)有分析手段無法檢測的未知化合物[7]。組學(xué)技術(shù)可以檢測生物體在基因組水平上生物學(xué)通路(biological pathway)的響應(yīng)與改變，且致毒通路可以用來預(yù)測化學(xué)品潛在的毒性終點(diǎn)，為化學(xué)品優(yōu)先性篩選及毒性預(yù)估提供指導(dǎo)[8]?；谏镄?yīng)為導(dǎo)向的分析(effect directed analysis, EDA)評(píng)估策略將體外生物測試方法應(yīng)用于環(huán)境水體復(fù)合污染的生物效應(yīng)監(jiān)測和關(guān)鍵毒害物質(zhì)的鑒定研究中，能夠有效檢測環(huán)境樣品的特定生物毒性效應(yīng)[9]。然而，現(xiàn)今較為完善的以細(xì)胞為基礎(chǔ)的高通量體外篩選毒性測試只涉及較少的生物學(xué)通路，不能體現(xiàn)出生物個(gè)體水平的響應(yīng)，限制了對潛在有害結(jié)局的預(yù)測和評(píng)估[10-11]。因此，需要開發(fā)一套新的毒性測試，能夠?qū)Νh(huán)境水體的毒性及其有害結(jié)局進(jìn)行評(píng)估和預(yù)測。

斑馬魚作為一種較為完善的模式脊椎動(dòng)物，大量應(yīng)用于基因研究、發(fā)育研究及生態(tài)毒理學(xué)研究等科研領(lǐng)域[12]，本文主要綜述了斑馬魚胚胎毒性測試、行為分析及組學(xué)技術(shù)進(jìn)展及其集成技術(shù)在化學(xué)品毒性篩選評(píng)估管理與水環(huán)境復(fù)合污染毒性監(jiān)測中的應(yīng)用，并對斑馬魚毒理基因組學(xué)測試技術(shù)在水環(huán)境管理中的應(yīng)用前景進(jìn)行展望。

1 斑馬魚胚胎測試(Zebrafish Embryo Testing Techniques)

相比傳統(tǒng)毒性測試，斑馬魚胚胎毒性測試具有以下優(yōu)點(diǎn)：1)斑馬魚胚胎具有體外受精、體積小、透明易觀察、發(fā)育快以及實(shí)驗(yàn)成本低等優(yōu)點(diǎn)[13]；2)與標(biāo)準(zhǔn)成魚急性毒性測試之間有很好的相關(guān)性，可以替代成魚急性毒性試驗(yàn)[14]；3)可以反映眾多的生物學(xué)通路和毒性終點(diǎn)，如內(nèi)分泌干擾、心臟毒性及神經(jīng)肌肉異常等[15]；4)斑馬魚基因組與人類基因組相似度高，其與發(fā)育相關(guān)的信號(hào)通路保守性強(qiáng)，為斑馬魚毒性測試的物種間毒性外推提供了基礎(chǔ)[16]；5)在1%二甲亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)暴露條件下，斑馬魚胚胎的正常發(fā)育不會(huì)受到顯著影響，為疏水性化學(xué)品的毒性測試提供條件[17]。目前，斑馬魚胚胎測試已成為化學(xué)品毒性評(píng)價(jià)中常用的替代測試方法，可以快速高效準(zhǔn)確獲取化學(xué)品毒性信息[18]，并為復(fù)合污染水體的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供更多毒性數(shù)據(jù)[15]。

斑馬魚胚胎測試方法已被普遍應(yīng)用在化學(xué)品毒性評(píng)估方面，如經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(OECD)提出化學(xué)品急性及慢性毒性測試導(dǎo)則TG 212, TG 236。最近又有大量研究開發(fā)了更為高效的斑馬魚胚胎毒性測試體系，如自動(dòng)化斑馬魚胚胎絨毛膜去除及自動(dòng)化多孔板胚胎放置技術(shù)，提高了斑馬魚胚胎暴露效率[19]；基于384孔板的高內(nèi)涵測試對(fli1:egfp)轉(zhuǎn)基因魚進(jìn)行自動(dòng)化捕捉獲取體長、心率、心血管速率等毒性指標(biāo)數(shù)據(jù)，并且定量表征神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的自主尾部收縮活性，實(shí)現(xiàn)機(jī)器自動(dòng)化觀測斑馬魚毒性終點(diǎn)，大大提高了測試效率[20]。但是，通過斑馬魚胚胎發(fā)育毒性測試(zebrafish embryo developmental toxicity test, ZEDT)得到的毒性終點(diǎn)指標(biāo)主要為個(gè)體水平上的致死致畸等(如圖1表格)[20-24]，這些毒性終點(diǎn)的出現(xiàn)通常要求化學(xué)品暴露濃度很高，有時(shí)化學(xué)品濃度不能達(dá)到致毒濃度，且該方法并不能有效識(shí)別更敏感毒性效應(yīng)終點(diǎn)，導(dǎo)致化學(xué)品毒性預(yù)測及環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)過程中存在誤差。

斑馬魚行為分析(zebrafish photo motor response, ZPMR)是利用斑馬魚胚胎或幼魚的行為改變反映環(huán)境脅迫對斑馬魚胚胎發(fā)育影響的技術(shù)[25-26]?；诎唏R魚胚胎與幼魚行為分析技術(shù)能有效識(shí)別敏感的毒性測試終點(diǎn)，如運(yùn)動(dòng)活躍程度的改變等，有效表征化學(xué)品對神經(jīng)功能的干擾[27-28]。研究顯示，低濃度暴露條件下斑馬魚的行為改變與高濃度暴露所引起的斑馬魚胚胎的畸形和死亡具有顯著相關(guān)性，該測試技術(shù)極大地提高了斑馬魚胚胎毒性測試的靈敏度[22,24,29]。有研究利用96 hpf斑馬魚行為分析毒性終點(diǎn)與斑馬魚成魚急性毒性建立毒性外推模型，準(zhǔn)確利用行為分析的結(jié)果預(yù)測神經(jīng)毒性化學(xué)品的成魚急性毒性LC50(半數(shù)致死濃度)，而這些化學(xué)品在以往斑馬魚胚胎發(fā)育毒性測試中一般毒性較弱，行為分析毒性指標(biāo)的納入將大大提高斑馬魚胚胎測試體系的準(zhǔn)確性[30]。由于斑馬魚行為分析測試的靈敏度較高，已有研究將該測試技術(shù)應(yīng)用在復(fù)合污染環(huán)境水體的毒性評(píng)估中[31]。然而，行為分析仍是在個(gè)體水平上對化學(xué)品進(jìn)行區(qū)分，無法對化學(xué)品的分子作用類型及毒性潛力大小進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)估。

圖1 斑馬魚發(fā)育毒性測試及行為分析流程圖Fig. 1 Zebrafish embryo developmental toxicity test

生物毒性(Biological Toxicity)斑馬魚胚胎發(fā)育毒性測試(Zebrafish EDT)斑馬魚行為分析(Zebrafish PMR)斑馬魚胚胎轉(zhuǎn)錄組測試(Zebrafish Transcriptome)致死 (Mortality)√○○發(fā)育毒性 (Developmental Toxicity)√○○神經(jīng)毒性 (Neurotoxicity)×√○生殖毒性 (Reproductive Toxicity)××○遺傳毒性 (Genotoxicity)××○

注：√表示可以直接獲得該毒性終點(diǎn)；×表示不能獲得該毒性終點(diǎn)；○表示可以通過預(yù)測得到該毒性終點(diǎn)。

Note： √ Can get the endpoint by this method; × Can’t get the endpoint by this method; ○ Can predict the endpoint by this method; EDT stands for Embryo Developmental Toxicity Test; PMR stands for Photo Motor Response.

基于斑馬魚胚胎的毒性測試存在局限性，主要包括：1)斑馬魚并非中國本土物種，其對化學(xué)物質(zhì)毒性的敏感性可能與本土生物有一定差異；2)斑馬魚胚胎正常培養(yǎng)孵化溫度為(28±2) ℃，因此不適用于低溫水體的原位分析；3)不同品系斑馬魚存在毒性敏感差異等。此外，斑馬魚胚胎測試在測試通量和毒性終點(diǎn)上但還存在以下不足：1)測試所用的毒性終點(diǎn)不全面，無法對化學(xué)品的生殖毒性及遺傳毒性進(jìn)行評(píng)估(表1)；2)該測試方法只是在個(gè)體水平上對測試化學(xué)物質(zhì)導(dǎo)致的胚胎的死亡、畸形等毒性終點(diǎn)進(jìn)行評(píng)價(jià)，并不能揭示化學(xué)品毒性作用機(jī)制。

2 組學(xué)技術(shù)(Omics Techniques)

毒理基因組學(xué)(Toxicogenomics)是一種利用“組學(xué)”技術(shù)(如轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、代謝組等)，研究化合物作用于機(jī)體引起的基因組水平變化，并利用基因變化評(píng)價(jià)和預(yù)測化合物毒性的新興學(xué)科[32]。與以表型為測試終點(diǎn)的傳統(tǒng)毒性測試不同，毒理基因組學(xué)檢測基因水平的毒性終點(diǎn)，具有更高的敏感性和特異性[32-34]。其中，轉(zhuǎn)錄組技術(shù)(如微陣列芯片、轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)等)能夠檢測全基因組的轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜，反映最早期的生物分子響應(yīng)，被廣泛應(yīng)用于化合物生物標(biāo)志物的鑒定及致毒機(jī)理的解釋[35-37]。而且，由于蛋白質(zhì)及代謝物的豐度會(huì)影響蛋白質(zhì)組及代謝組的檢出，其分辨率和應(yīng)用范圍現(xiàn)今還不及轉(zhuǎn)錄組技術(shù)[38]。目前，毒理基因組學(xué)在環(huán)境污染物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)中的應(yīng)用還十分有限，主要難題包括：1)根據(jù)基因水平變化預(yù)測表型毒性；2)對污染物的毒性進(jìn)行定量評(píng)價(jià)；3)缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的毒理基因?qū)W測試方法及分析流程；4)測試成本高昂，難以實(shí)現(xiàn)大量樣品的測試。

利用斑馬魚這一模式動(dòng)物，可以將組學(xué)技術(shù)與傳統(tǒng)毒性測試相結(jié)合，為基因表達(dá)變化與表型毒性終點(diǎn)建立關(guān)聯(lián)提供有利的條件。斑馬魚轉(zhuǎn)錄組學(xué)已在化合物安全評(píng)價(jià)、作用機(jī)制研究、水生生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估以及水體樣品毒性評(píng)估等領(lǐng)域得到應(yīng)用[39-40]。有研究利用斑馬魚胚胎轉(zhuǎn)錄組研究阻燃劑mITP (monosubstituted isopropylated triaryl phosphate, mITP)的分子致毒機(jī)制，發(fā)現(xiàn)mITP是潛在的芳香烴受體(AHR)配體，并通過抑制視磺酸受體的生成誘發(fā)斑馬魚胚胎的心臟毒性[41]。

斑馬魚轉(zhuǎn)錄組學(xué)與斑馬魚胚胎毒性測試聯(lián)用后，可以將轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)與表型毒性數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)，結(jié)合分子網(wǎng)絡(luò)公共數(shù)據(jù)庫，能夠得到從分子響應(yīng)到生物學(xué)過程，再到表型效應(yīng)的網(wǎng)絡(luò)圖譜，從而為化學(xué)品致毒模式研究及環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供新思路。有研究組利用斑馬魚胚胎研究了三氯乙烯(trichloroethylene, TCE)的毒性，主要對TCE暴露后，斑馬魚胚胎的血管生成、肌動(dòng)蛋白、線粒體功能及轉(zhuǎn)錄組變化進(jìn)行測試分析，結(jié)果表明轉(zhuǎn)錄組響應(yīng)與生化指標(biāo)的變化可以建立很好的關(guān)聯(lián)，TCE具有心臟毒性，并利用FAK信號(hào)通路(focal adhesion kinase signaling pathway)等生物學(xué)通路解析了TCE的毒性作用機(jī)制[42]。另外，有研究組綜合了斑馬魚胚胎毒性測試、轉(zhuǎn)錄組、q-PCR及轉(zhuǎn)基因魚系形態(tài)學(xué)觀察幾種測試方法，對污水處理廠出水的毒性進(jìn)行了測試；同時(shí)，研究對水樣毒性的分子機(jī)制及生物標(biāo)志物進(jìn)行了分析，并結(jié)合有害結(jié)局路徑(adverse outcome pathway, AOP)框架對長期水樣暴露可能顯現(xiàn)出的斑馬魚形態(tài)毒性進(jìn)行了預(yù)測，該研究為環(huán)境水體監(jiān)測及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估方法的改進(jìn)建立了基礎(chǔ)[43]。

有害結(jié)局路徑框架的提出將化學(xué)污染物的結(jié)構(gòu)、致毒的分子啟動(dòng)事件和有害結(jié)局建立關(guān)聯(lián)。因此，得到化學(xué)品或環(huán)境樣品的敏感分子響應(yīng)后，可結(jié)合AOP對樣品最敏感毒性終點(diǎn)作出預(yù)測，這為化學(xué)品的毒性預(yù)測評(píng)估及環(huán)境復(fù)合污染監(jiān)測提供了新的思路[44]。

組學(xué)研究可以根據(jù)劑量-效應(yīng)關(guān)系對化學(xué)品毒性進(jìn)行定量評(píng)價(jià)，預(yù)測毒性起始濃度(point of departure, POD)[45]。例如，研究表明，有些內(nèi)分泌干擾物低濃度暴露后生物體內(nèi)的基因變化是非單調(diào)的，這就表明其中存在新的分子機(jī)制[46]。另外，有研究表明利用斑馬魚胚胎進(jìn)行多劑量實(shí)驗(yàn)可以有效識(shí)別出雄激素響應(yīng)基因[47]。而且，以差異表達(dá)基因活性值為基礎(chǔ)進(jìn)行的生物學(xué)通路分析可以用于化學(xué)品的毒性診斷分析[48]。然而，面對大量的毒性測試，轉(zhuǎn)錄組測試成本高昂，缺乏標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)分析方法，這些原因限制了轉(zhuǎn)錄組特別是基于多劑量基因組數(shù)據(jù)在危害識(shí)別中的應(yīng)用[49-50]。因此，降低轉(zhuǎn)錄組成本及建立劑量效應(yīng)模型的標(biāo)準(zhǔn)化生物信息學(xué)方法對組學(xué)技術(shù)在化學(xué)物質(zhì)毒性測試中應(yīng)用推廣至關(guān)重要。

3 簡化轉(zhuǎn)錄組測試(Reduced Transcriptome)

為了降低轉(zhuǎn)錄組測試成本，實(shí)現(xiàn)大批量化學(xué)品全劑量濃度的轉(zhuǎn)錄組測試，通過篩選關(guān)鍵基因?qū)θ蚪M進(jìn)行簡化，組成關(guān)鍵基因集代表全轉(zhuǎn)錄組信息。其基本原理是關(guān)鍵基因可以作為生物體分子網(wǎng)絡(luò)中共調(diào)控或共表達(dá)基因的替代物，來表征整個(gè)生物學(xué)通路網(wǎng)絡(luò)的動(dòng)態(tài)響應(yīng)[51]。本課題組利用該原理對人類簡化轉(zhuǎn)錄組(reduced human transcriptome, RHT)進(jìn)行了試驗(yàn)研究，挑選了1 200個(gè)關(guān)鍵人類基因作為RHT基因集，進(jìn)行劑量效應(yīng)模型分析。結(jié)果表明，該技術(shù)可以利用經(jīng)暴露后細(xì)胞的動(dòng)態(tài)生物學(xué)響應(yīng)來表征環(huán)境樣品的潛在毒性效力，實(shí)現(xiàn)高效檢測水體質(zhì)量的目標(biāo)，大大節(jié)省了實(shí)驗(yàn)成本[52]。

人類簡化轉(zhuǎn)錄組技術(shù)存在細(xì)胞類型單一、無組織結(jié)構(gòu)等問題，為彌補(bǔ)該缺陷，有效增多毒害物質(zhì)評(píng)估中的生物學(xué)通路，課題組在此基礎(chǔ)上用斑馬魚胚胎作為多細(xì)胞測試體系開展斑馬魚簡化轉(zhuǎn)錄組(reduced zebrafish transcriptome, RZT)研究，形成了一套標(biāo)準(zhǔn)化的基于斑馬魚模型的化學(xué)品簡化轉(zhuǎn)錄組測試與評(píng)價(jià)技術(shù)，其中包括毒性數(shù)據(jù)的獲取、分析及呈現(xiàn)過程。該研究通過挑選斑馬魚簡化基因集，結(jié)合Ion Ampliseq Technology測序形成斑馬魚簡化轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)(RZT-Ampliseq)，同時(shí)構(gòu)建了RZT-Ampliseq與斑馬魚胚胎多劑量模型相結(jié)合的分析方法(RZT-Ampliseq-embyro)(如圖2)[53]。

3.1 實(shí)驗(yàn)流程與方法

研究流程主要包括建立并驗(yàn)證RZT測試平臺(tái)、建立生物信息學(xué)分析方法、將RZT應(yīng)用于環(huán)境污染物的毒性評(píng)估三大部分：1)研究首先從斑馬魚生物學(xué)通路數(shù)據(jù)庫(包括KEGG和Gene Ontology數(shù)據(jù)庫)中，篩選得到1 000個(gè)斑馬魚的關(guān)鍵基因，并整合毒理學(xué)測試數(shù)據(jù)庫相關(guān)基因，建立一個(gè)由1 637個(gè)斑馬魚基因組成的RZT基因集，而后考察RZT基因集的生物學(xué)通路覆蓋度，并選取5個(gè)不同時(shí)期(24 hpf到成魚)的斑馬魚全轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(來自NCBI數(shù)據(jù)庫)，考察簡化基因集對全轉(zhuǎn)錄組基因圖譜的定性和定量表征能力，同時(shí)確立斑馬魚胚胎暴露及樣品處理的實(shí)驗(yàn)操作；2)對雙酚A(bisphenol A, BPA)(10～10E-5 μmol·L-1，10倍梯度稀釋)及4種環(huán)境水樣的有機(jī)污染物萃取液(10～6.4E-4富集系數(shù)，5倍梯度稀釋)進(jìn)行斑馬魚簡化轉(zhuǎn)錄組測試，所得結(jié)果與已有的體外生物測試(invitrobioassays)及人類細(xì)胞的RHT測試結(jié)果進(jìn)行比較；3)建立RZT生物信息學(xué)分析方法：利用劑量效應(yīng)模型，計(jì)算各基因的效應(yīng)濃度(effect concentration, EC)，挑選EC <= LOEC(最低有效應(yīng)濃度)的基因作為差異表達(dá)基因(differentially expressed genes, DEGs)，將DEGs比對到生物學(xué)通路上，篩選出匹配到至少3個(gè)DEGs的通路，并根據(jù)其匹配基因EC值的平均值，作為該通路的效應(yīng)濃度。

圖2 斑馬魚簡化轉(zhuǎn)錄組測試實(shí)驗(yàn)分析流程圖[4]Fig. 2 Framework of reduced zebrafish transcriptome (RZT) experiment and data analysis[4]

3.2 結(jié)果分析

1)RZT平臺(tái)驗(yàn)證：RZT基因集能覆蓋95%的生物學(xué)通路；能夠定性地模擬基于全轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)的聚類圖譜，定量地表征接近(差別<1個(gè)數(shù)量級(jí))基于全轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)的毒性起始濃度；RZT-ampliseq測試可以為斑馬魚mRNA多元測序分析提供一種高通量、低成本的技術(shù)平臺(tái)。

2)劑量效應(yīng)模型與生物學(xué)通路分析：利用劑量效應(yīng)模型可以定量表征基因的效應(yīng)濃度，進(jìn)而用于生物學(xué)通路的定量表征，識(shí)別樣品的潛在敏感生物學(xué)通路。

3)基于生物學(xué)通路的毒性評(píng)估：對樣品的生物通路效應(yīng)濃度進(jìn)行排序，得到各個(gè)樣品的生物學(xué)通路敏感性分布曲線，計(jì)算各樣品的毒性潛力，識(shí)別潛在的高毒性樣品(如圖3)。

4)RZT、invitro測試以及RHT結(jié)果的比較：RZT的BPA測試結(jié)果與ToxCast 中的BPAinvitro測試相比，2種測試得到的生物學(xué)通路及其敏感性排序相似，但RZT測試的敏感性更高，得到的結(jié)果比invitro測試低3個(gè)數(shù)量級(jí)左右；使用RZT平臺(tái)得到環(huán)境樣品暴露后的敏感生物學(xué)通路結(jié)果與RHT結(jié)果一致(如圖3)。在環(huán)境樣品測試方面，RZT-ampliseq-embryo更全面、更敏感，且RZT可以檢測出invitro測試(103種)無法檢出的弱響應(yīng)通路，如甲狀腺和下丘腦相關(guān)響應(yīng)等，但RZT對雌激素受體類通路檢出敏感性較低，這一問題可通過調(diào)整胚胎樣品收集時(shí)間(> 48 hpf)解決；RZT分析得到的富集通路能夠與有害結(jié)局建立聯(lián)系，表征樣品可能導(dǎo)致的最主要的生物學(xué)終點(diǎn)。

綜上，斑馬魚簡化轉(zhuǎn)錄組技術(shù)的提出對毒理基因組學(xué)的發(fā)展有極大的促進(jìn)作用，該技術(shù)從測試通量、成本、冗余去除等多方面彌補(bǔ)了全轉(zhuǎn)錄組的不足，使得高效、快速、經(jīng)濟(jì)獲取大量化學(xué)品生物分子響應(yīng)成為可能；結(jié)合斑馬魚胚胎全劑量模型，可以對暴露后響應(yīng)基因及生物學(xué)通路做敏感性分析，從而得到生物體在該暴露條件下最敏感的毒性終點(diǎn)，有效避免了非單調(diào)響應(yīng)基因信息缺失的問題；建立了一套較為完善的數(shù)據(jù)分析方案，為轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)處理提供了解決思路；與目前在篩選生物標(biāo)志物研究中應(yīng)用較廣的invitro測試相比，RZT平臺(tái)作為生物有機(jī)體測試系統(tǒng)可以覆蓋更多的生物學(xué)通路，它不但覆蓋了invitro測試的終點(diǎn)，還可以鑒別如發(fā)育、生殖相關(guān)的生物學(xué)通路。斑馬魚簡化轉(zhuǎn)錄組技術(shù)將會(huì)對化學(xué)品篩選管理、化學(xué)品毒性預(yù)測、化學(xué)品優(yōu)先控制及環(huán)境監(jiān)測治理等領(lǐng)域產(chǎn)生重大影響。

4 斑馬魚簡化轉(zhuǎn)錄組集成測試及其應(yīng)用前景(Application Prospect of Reduced Zebrafish Transcriptome Aggregate Testing Method)

4.1 化學(xué)品測試、篩選、毒性預(yù)測與評(píng)估

斑馬魚胚胎毒性測試、行為分析及斑馬魚簡化轉(zhuǎn)錄組同時(shí)應(yīng)用構(gòu)建為斑馬魚簡化轉(zhuǎn)錄組集成測試技術(shù)。在化學(xué)品測試中，可利用斑馬魚簡化轉(zhuǎn)錄組得到化學(xué)品暴露后生物體最敏感的生物學(xué)響應(yīng)，將其與斑馬魚胚胎毒性測試、行為分析的表型效應(yīng)等結(jié)果相結(jié)合，能夠?qū)瘜W(xué)品致毒機(jī)制進(jìn)行解析，并建立化學(xué)品生物毒性數(shù)據(jù)庫，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對大量化學(xué)品的優(yōu)先性篩選；另一方面，可以將毒理基因組學(xué)與傳統(tǒng)毒理學(xué)檢測方法結(jié)合，利用組學(xué)對化學(xué)品的整體毒性進(jìn)行評(píng)估，確定其主要毒性后，再進(jìn)行單獨(dú)毒性的定量分析，這樣能夠?yàn)槎慷拘詸z測提供毒性機(jī)理上的支持，從而增強(qiáng)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)的可靠性。此外，利用該技術(shù)得到的早期分子響應(yīng)也可以為化學(xué)品毒性效應(yīng)預(yù)測提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)；由于斑馬魚轉(zhuǎn)錄組可以實(shí)現(xiàn)跨物種模型比對，因此可以利用該技術(shù)的轉(zhuǎn)錄組毒性信息進(jìn)行毒性物種間外推。由于化學(xué)品毒性測試數(shù)據(jù)的缺乏，若將該高通量測試方法標(biāo)準(zhǔn)化，形成具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的化學(xué)品毒性測試技術(shù)體系和相關(guān)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，形成的化學(xué)品毒性數(shù)據(jù)庫可以為我國化學(xué)品安全管理提供技術(shù)支撐。

利用斑馬魚簡化轉(zhuǎn)錄組集成測試技術(shù)可以高通量、低成本的獲得化學(xué)物質(zhì)對生物體多維毒性信息，并將體內(nèi)試驗(yàn)終點(diǎn)與生物個(gè)體有害結(jié)局直接相關(guān)，基于現(xiàn)有生物學(xué)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)整合不同層級(jí)毒性信息完善AOP框架，為實(shí)現(xiàn)化學(xué)品的毒性預(yù)測提供條件(圖4)。

4.2 復(fù)合污染毒性測試、評(píng)估與診斷

在環(huán)境監(jiān)測方面，將斑馬魚簡化轉(zhuǎn)錄組集成測試技術(shù)與AOP框架相結(jié)合，對復(fù)合污染進(jìn)行毒性預(yù)測和評(píng)估。利用該方法可以得到環(huán)境樣品暴露后分子水平響應(yīng)的敏感性差異，并基于分子效應(yīng)可以對不同環(huán)境樣品的毒性潛力進(jìn)行評(píng)估；而且，將初始分子響應(yīng)與AOP結(jié)合可以找到環(huán)境樣品最敏感的毒性效應(yīng)終點(diǎn)，從而為后續(xù)建立不同水體環(huán)境監(jiān)測與管理特異性指標(biāo)體系提供方向。

與EDA常用的生物體外毒性測試手段相比，利用斑馬魚簡化轉(zhuǎn)錄組集成測試能夠反映生物的整體效應(yīng)，不再局限于某種特定的效應(yīng)終點(diǎn)，將其與EDA相結(jié)合，應(yīng)用于環(huán)境水體復(fù)合污染的生物效應(yīng)監(jiān)測和關(guān)鍵毒害物質(zhì)的鑒定研究中，為化學(xué)品優(yōu)先管控提供指導(dǎo)。

此外，由于斑馬魚簡化轉(zhuǎn)錄組集成測試平臺(tái)靈敏度高，也適用于環(huán)境中低濃度暴露的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，這就為水源水、飲用水等相對干凈水體的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供了技術(shù)支撐，如對自來水廠出水或不同處理工藝段的水質(zhì)評(píng)估提供測試手段。

5 結(jié)語(Conclusions)

由于目前化學(xué)品的多樣性以及環(huán)境水體復(fù)合污染的復(fù)雜性，建立高效的生物測試是今后化學(xué)品與環(huán)境污染物毒性評(píng)估研究的必然趨勢。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多的基于斑馬魚模型的毒性測試方法被開發(fā)應(yīng)用，其在環(huán)境監(jiān)測管理中的應(yīng)用也逐漸普及。采用多種斑馬魚測試技術(shù)聯(lián)用是今后斑馬魚毒理學(xué)模型的一個(gè)發(fā)展方向。斑馬魚簡化轉(zhuǎn)錄組集成測試作為一種高效準(zhǔn)確的集成測試方法，有廣闊的應(yīng)用前景。斑馬魚簡化轉(zhuǎn)錄組集成測試，包括毒理基因組學(xué)、胚胎毒性測試、行為分析測試，與傳統(tǒng)動(dòng)物測試相比，不僅大大提高測試通量與效率，降低測試成本，并且從生物多層次(分子、細(xì)胞、組織、器官、個(gè)體)水平表征化學(xué)品毒性，揭示化學(xué)品毒性致毒機(jī)制信息，幫助構(gòu)建分子水平到毒性效應(yīng)終點(diǎn)聯(lián)系，為基于“毒性通路”的預(yù)測毒理學(xué)應(yīng)用于化學(xué)品毒害風(fēng)險(xiǎn)識(shí)別提供新機(jī)遇。另外，該測試技術(shù)可在環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)中起到重要作用：一方面，可利用該集成測試技術(shù)建立毒性信息更為全面的化學(xué)品毒性數(shù)據(jù)庫，將分子指標(biāo)、個(gè)體指標(biāo)及化學(xué)品結(jié)構(gòu)信息相關(guān)聯(lián)，為關(guān)鍵致毒化學(xué)品溯源及優(yōu)控管理提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)；另一方面，該集成測試技術(shù)可應(yīng)用于復(fù)合污染的研究中，為樣品中關(guān)鍵致毒物質(zhì)篩查提供新的解決思路。