夏 玙,羅惠波,2,*,周 平,黃 丹,鄧 波,沈才萍,鄔捷峰
(1.四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院,四川 自貢 643000;
2.釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川 自貢 643000;3.勁牌有限公司,湖北 大冶 435100;4.瀘州老窖股份有限公司 國(guó)家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心,四川 瀘州 646000)
作為白酒釀造的糖化發(fā)酵劑,大曲與白酒風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生、風(fēng)格的形成及質(zhì)量的變化密切相關(guān)[1]。由于其開(kāi)放式的制作方式,大曲中的微生物類(lèi)群十分豐富,包括霉菌、細(xì)菌及酵母菌等,這些微生物能夠產(chǎn)生各種酶和風(fēng)味物質(zhì),因此,微生物群落是決定大曲品質(zhì)的核心因素之一[2-3]。大曲中數(shù)量巨大的微生物類(lèi)群的準(zhǔn)確描述和定義、功能菌的精準(zhǔn)定位、微生物與白酒釀造調(diào)控技術(shù)等研究一直是白酒釀造領(lǐng)域的重大理論和技術(shù)問(wèn)題[4-5]。在此前研究中,業(yè)內(nèi)學(xué)者將分子生物學(xué)的研究融合到中國(guó)大曲微生物群落構(gòu)成的探索性研究中,并取得了一定的成果。徐占成等[6]采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性凝膠梯度電泳技術(shù)研究中溫大曲真菌群落結(jié)構(gòu)及其多樣性。羅惠波等[7]利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)-單鏈構(gòu)象多態(tài)技術(shù)研究濃香型大曲,發(fā)現(xiàn)在大曲發(fā)酵過(guò)程中可能是受溫度變化的影響,真核微生物群落多樣性呈先升高后降低,然后又升高并且基本保持穩(wěn)定的特征??梢?jiàn)大曲真菌類(lèi)群的變化因不同的發(fā)酵階段、工藝呈不同的特點(diǎn)。
大曲在培菌的過(guò)程中,特別是在降溫排潮期和貯存期,常會(huì)遭受曲蟲(chóng)的侵害[8-9]。本課題組建立外源加熱的大曲熱風(fēng)干燥工藝,在有助排濕的同時(shí)又能有效地殺滅曲蟲(chóng)。而大曲在生產(chǎn)應(yīng)用中往往要經(jīng)過(guò)3~6個(gè)月貯存成為陳曲,一般地,在曲庫(kù)內(nèi)進(jìn)行貯存也未免于曲蟲(chóng)的侵害。因此,另尋大曲貯存環(huán)境也是大曲制作的關(guān)注點(diǎn),若在沒(méi)有曲蟲(chóng)存在的自然條件下貯存可行,則可設(shè)置特定環(huán)境進(jìn)行貯存。
為探究外源熱風(fēng)干燥對(duì)大曲在貯存期帶來(lái)的相關(guān)影響,本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和高通量測(cè)序技術(shù),對(duì)排潮降溫期大曲進(jìn)行熱風(fēng)、自然干燥處理后,對(duì)比實(shí)驗(yàn)室貯存、曲庫(kù)貯存以及自然干燥后曲庫(kù)貯存不同處理方式下大曲的真菌微生物群落差異,以期為進(jìn)一步優(yōu)化大曲干燥工藝提供技術(shù)依據(jù),為指導(dǎo)大曲熱風(fēng)干燥工業(yè)化應(yīng)用提供一定的參考。
大曲采集于四川瀘州市懷玉制曲生態(tài)園,于秋季10月采樣,環(huán)境溫度21 ℃。
蛋白酶K、溶菌酶、十六烷基三甲基溴化銨(hexadecyl trimethyl ammonium bromide,CTAB)、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS) 美國(guó)Sigma公司;P7589熒光定量染料 美國(guó)Invitrogen公司;AceQ?qPCR SYBR?Green Master Mix Q112-02 南京諾唯贊生物科技有限公司;RNA、DNA檢測(cè)試劑 美國(guó)Agilent公司;MiSeq測(cè)序試劑盒 美國(guó)Illumina公司。
84Y-3型風(fēng)速可控干燥箱 和成儀器儀表(昆山)有限公司;PICO 17臺(tái)式高速離心機(jī)、ABI2700 PCR儀、ABI Step-One Plus實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng) 上海派森諾生物科技有限公司;Tanon 2500凝膠成像系統(tǒng) 上海天能科技有限公司;TGL-16臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司;DYY-6C型電泳儀 北京六一儀器廠(chǎng);2720型PCR擴(kuò)增儀 美國(guó)ABI公司;Illumina MiSeq高通量測(cè)序平臺(tái) 美國(guó)Illumina公司。
1.3.1 樣品采集及處理
取培菌第8天排潮降溫期的大曲進(jìn)行最佳熱風(fēng)干燥處理,同時(shí)與同一曲庫(kù)、同一存放地點(diǎn)的自然干燥大曲進(jìn)行對(duì)比。熱風(fēng)干燥分兩階段進(jìn)行,第1階段溫度為48 ℃,轉(zhuǎn)換點(diǎn)含水率為15.5%,第2階段溫度為45 ℃。自然干燥環(huán)境與曲房溫度一致,自熱排潮降溫。
曲庫(kù)中曲蟲(chóng)滋生較多,與實(shí)驗(yàn)室貯存(幾乎無(wú)曲蟲(chóng))作對(duì)比。在實(shí)驗(yàn)室貯存和曲庫(kù)中貯存均在自然溫度下進(jìn)行的,溫度與環(huán)境溫度一致。將進(jìn)行熱風(fēng)干燥處理后的大曲分成2 批:一批大曲在熱風(fēng)干燥處理后直接在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行貯存,另一批大曲熱風(fēng)干燥后放回曲庫(kù)中繼續(xù)貯存。研究這3 種處理方式和3 種貯存方式的大曲在干燥前后、貯存1 個(gè)月、貯存2 個(gè)月時(shí)的差異。將干燥前的大曲批次(原曲)標(biāo)記為RG1,將進(jìn)行熱風(fēng)干燥處理后的大曲批次標(biāo)記為FK1,將在曲庫(kù)進(jìn)行自然干燥的大曲批次(與熱風(fēng)干燥同時(shí)間的大曲)標(biāo)記為ZR1;將熱風(fēng)干燥處理的大曲FK1直接在實(shí)驗(yàn)室條件下貯存1、2 個(gè)月后的大曲批次分別標(biāo)記為RG2、RG3,將熱風(fēng)干燥處理的大曲FK1在曲庫(kù)貯存1、2 個(gè)月后的大曲批次分別標(biāo)記為FK2、FK3;將大曲ZR1直接在曲庫(kù)貯存1、2 個(gè)月后的大曲批次分別標(biāo)記為ZR2、ZR3。曲樣均于-20 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>
1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系及程序
引物:18s_F(5’-ACTCAACACGGGAAAACTC-3’)和18s_R(5’-CGGAATGAACCAGACAAATC-3’),由上海派森諾生物科技股份有限公司提供。每個(gè)樣品設(shè)3 個(gè)復(fù)孔,采用20 孔,體系:0.4 μL PCR特異引物F(10 μmol/L)、0.4 μL PCR特異引物R(10 μmol/L),10 μL 2×SYBR real-time PCR premixture,1 μL DNA模板,加水至總體積20 μL。反應(yīng)程序:95 ℃、5 min,95 ℃、15 s,60 ℃、30 s,共40 個(gè)循環(huán)。10 倍梯度稀釋為模板制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。
1.3.3 目標(biāo)片段PCR擴(kuò)增及高通量測(cè)序
大曲總D N A提取采用改良的C T A B法,借助酶、反復(fù)凍融、酚-氯仿-異戊醇(體積比25∶24∶1)抽提等操作,形成復(fù)合優(yōu)化的手提方法提取大曲中微生物的總DNA[10]。用引物ITS1F(5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’)和2043R(5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’)[11]擴(kuò)增真菌的ITS1序列。PCR體系(25 μL)包括以下試劑:5 μL 5×reaction buffer,5 μL 5×GC buffer,2 μL 2.5 mmol/L dNTPs,1 μL Forward Primer(10 μmol/L),1 μL Reverse Primer(10 μmol/L),2 μL Template DNA,0.25 μL Q5 DNA Polymerase和8.75 μL ddH2O。PCR條件:1)98 ℃預(yù)變性2 min;2)98 ℃變性15 s,55 s退火30 s,72 s延伸30 s,29 個(gè)循環(huán);3)72 ℃延伸5 min,10 ℃到取出為止。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè),并對(duì)目標(biāo)片段進(jìn)行切膠回收。
基因文庫(kù)測(cè)序由上海派森諾生物科技股份有限公司提供服務(wù),用Illumina MiSeq平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。
1.3.4 微生物信息分析
對(duì)有效序列的質(zhì)量作進(jìn)一步的評(píng)估,用于后續(xù)分析的序列[12]。將相似性大于97%的序列聚類(lèi)成一個(gè)操作分類(lèi)單元(operational taxonomic unit,OTU)[13],并進(jìn)行物種注釋。與NCBI的GenBank進(jìn)行BLAST比對(duì),確定真菌序列的分類(lèi)信息,獲得門(mén)和屬水平下的種類(lèi)及相對(duì)豐度[14]。
稀疏曲線(xiàn)可評(píng)判當(dāng)前測(cè)序深度是否足以反映該群落樣本所包含的微生物多樣性[15]。Alpha多樣性用Chao1、ACE、Shannon和Simpson指數(shù)計(jì)算,以評(píng)價(jià)大曲曲樣中真菌群落的生物多樣性。Beta多樣性分析,采用主成分分析(principal component analysis,PCA)方法,通過(guò)線(xiàn)性變換,將原始的高維數(shù)據(jù)降維、簡(jiǎn)化結(jié)構(gòu),從而量化樣本間的差異和相似度,從中發(fā)現(xiàn)不同樣品或樣品組間的差異[16]。
實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用Origin、Excel作圖,SPSS 20進(jìn)行方差分析,多重比較采用Duncans新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性的分析,以P<0.05為差異顯著。GraPhlAn軟件構(gòu)建大曲樣本總體分類(lèi)等級(jí)樹(shù),R軟件作生物組成熱圖。
以4.287×108copies/μL為起始濃度,設(shè)置5 組10 倍稀釋濃度的標(biāo)品,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為:Y=-3.144 3X+45.654,R2=0.997 3,擴(kuò)增效率為107.992%,表明不同稀釋梯度定量模板的對(duì)數(shù)值和Ct值之間呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)能夠準(zhǔn)確地反映目的產(chǎn)物的擴(kuò)增,且由樣品的Ct值就可算出樣品中的真菌數(shù)量。
依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算每克大曲樣品中真菌18S rRNA基因拷貝數(shù)。如圖1所示,不同處理方式大曲中的真菌18S rRNA基因拷貝數(shù)在1×1011~4.5×1011copies/g之間;ZR3拷貝數(shù)最大為4.5×1011copies/g。
圖1 不同處理方式大曲中真菌18S rRNA基因拷貝數(shù)Fig. 1 Number 18S rRNA gene copies of fungal communities in different samples
為獲取更多大曲真菌群落多樣性信息,利用Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)真菌ITS1進(jìn)行擴(kuò)增和序列比對(duì)后進(jìn)行種群多樣性分析和結(jié)構(gòu)組成。經(jīng)質(zhì)量篩選后,9 個(gè)大曲樣本真菌有效序列數(shù)總計(jì)有1 077 323 條,滿(mǎn)足基本分析要求,可用于進(jìn)一步的生物信息學(xué)分析。
圖2 大曲樣品真菌稀釋曲線(xiàn)Fig. 2 Rarefaction curves of fungal communities in Daqu samples
根據(jù)序列數(shù)及其代表的OTU數(shù)繪制樣品多樣性稀釋曲線(xiàn),由圖2可以看出,隨著樣品序列數(shù)的增加,可觀測(cè)物種數(shù)逐漸趨于平緩,Shannon指數(shù)值也逐漸趨于飽和,這表明測(cè)序深度合理,測(cè)序結(jié)果已足夠反映當(dāng)前大曲樣本絕大多數(shù)真菌微生物的物種信息。
不同處理方式大曲樣本的真菌群類(lèi)多樣性結(jié)果見(jiàn)表1。97%水平下共得到OTU數(shù)為844,每個(gè)大曲樣品的OTU數(shù)都在80以上。分析被注釋到不同分類(lèi)水平的真菌類(lèi)群發(fā)現(xiàn),大曲RG3的Chao1豐富度指數(shù)較高,Shannon和Simpson多樣性指數(shù)分析表明大曲RG2、RG3、ZR3的微生物多樣性較高。從工藝處理角度通過(guò)動(dòng)態(tài)比較分析大曲的多樣性指數(shù)發(fā)現(xiàn),相比RG1,不論是通過(guò)熱風(fēng)干燥工藝還是自然干燥工藝對(duì)大曲進(jìn)行處理后,大曲FK1與ZR1中真菌的豐富度指數(shù)均有所下降。通過(guò)比較ZR1、ZR2、ZR3的OTU、Chao1豐富度指數(shù),發(fā)現(xiàn)呈先下降后上升的趨勢(shì);而進(jìn)行熱風(fēng)干燥后的大曲,相比FK1,進(jìn)行曲庫(kù)貯存后的大曲FK2、FK3的多樣性指數(shù)均有呈先下降后上升的趨勢(shì);進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室貯存后的大曲RG2、RG3的多樣性指數(shù)均有上升的趨勢(shì),且比其他處理大曲的多樣性高。因此,熱風(fēng)干燥工藝對(duì)實(shí)驗(yàn)室貯存期大曲的真菌群落多樣性有一定促進(jìn)影響。
表1 不同處理方式大曲真菌多樣性指數(shù)Table 1 Diversity index of fungal communities from Daqu samples
圖3 大曲樣品中真菌在門(mén)分級(jí)水平上的種類(lèi)和相對(duì)豐度Fig. 3 Relative abundance of fungal communities at phylum level
根據(jù)物種注釋結(jié)果,選取大曲在門(mén)分類(lèi)水平上最大豐度排名靠前的物種,生成物種相對(duì)豐度柱形累加圖,便于直觀查看不同處理方式的大曲相對(duì)豐度較高的物種及其比例。由圖3可見(jiàn),在門(mén)的分級(jí)水平上,所有大曲中共檢測(cè)出了子囊菌門(mén)(Ascomycota)和接合菌門(mén)(Zygomycota)2大門(mén)類(lèi),其相對(duì)豐度較高,占到相應(yīng)樣品總類(lèi)群的99.9%以上,且在各處理后大曲中的含量不盡相同。子囊菌門(mén)在FK1和ZR1的豐度分別比RG1多11.2%、7.2%,說(shuō)明在大曲干燥的過(guò)程子囊菌門(mén)的比例逐漸增加;大曲在貯存1、2個(gè)月后,子囊菌門(mén)類(lèi)比例大小為ZR2>FK2>RG2和ZR3>RG3>FK3,可見(jiàn)在貯存期,自然干燥大曲有利于子囊菌門(mén)類(lèi)生長(zhǎng),而熱風(fēng)干燥對(duì)其成長(zhǎng)和繁殖存在阻礙作用。從大曲中接合菌門(mén)類(lèi)相對(duì)豐度來(lái)看,接合菌門(mén)比例大小是RG1>ZR1>FK1,說(shuō)明大曲干燥的過(guò)程接合菌門(mén)所占比例在逐漸較少,而熱風(fēng)干燥對(duì)其比例減少的可能性更大;大曲在貯存1、2個(gè)月后,接合菌門(mén)類(lèi)在RG2和FK2中的相對(duì)豐度比ZR2大,在RG3和FK3中的豐度比ZR3的豐度大,說(shuō)明熱風(fēng)干燥的大曲在貯存時(shí)期有利于接合菌門(mén)微生物的生長(zhǎng)和繁殖。
構(gòu)建基于GraPhlAn的大曲樣本總體分類(lèi)等級(jí)樹(shù),從復(fù)雜的群落數(shù)據(jù)中,快速發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)微生物類(lèi)群[17]。如圖4所示為從門(mén)到屬(從外圈到內(nèi)圈依次排列)所有分類(lèi)單元(以節(jié)點(diǎn)表示)的等級(jí)關(guān)系,節(jié)點(diǎn)大小對(duì)應(yīng)于該分類(lèi)單元的平均相對(duì)豐度。
圖4 基于GraPhlAn的大曲樣本總體分類(lèi)等級(jí)樹(shù)圖Fig. 4 Overall classification based on GraPhlAn of Daqu samples
結(jié)果顯示:所有大曲樣品里,真菌微生物屬水平上有4 種相對(duì)高豐度的微生物,平均相對(duì)豐度最高的是嗜熱子囊菌屬(Thermoascus),其次是根毛霉屬(Rhizomucor)、曲霉菌屬(Aspergillus),相對(duì)較低的是假絲酵母屬(Candida)。
圖5 大曲樣品中真菌在屬分級(jí)水平上的種類(lèi)和相對(duì)豐度Fig. 5 Relative abundance of fungal communities at genus level
如圖5所示,在屬的分級(jí)水平上,共檢測(cè)到19 種真菌類(lèi)群,優(yōu)勢(shì)類(lèi)群包括有:嗜熱子囊菌屬、嗜熱霉菌屬(Thermomyces)、根毛霉屬、曲霉菌屬、假絲酵母屬,其相對(duì)豐度占全部真菌群落的92.3%以上,其中最優(yōu)勢(shì)菌屬是嗜熱子囊菌屬,約占40.2%。
至今,嗜熱子囊菌相關(guān)研究已較成熟。它能產(chǎn)生具有高熱穩(wěn)定性和活力的纖維素酶、蛋白酶等,特別是其所產(chǎn)的過(guò)氧化氫酶是迄今為止已報(bào)道過(guò)的熱、堿穩(wěn)定性最好的[18]。張婕等[19]從嗜熱子囊菌原變種中克隆了一個(gè)幾丁質(zhì)酶同源基因,并在畢赤酵母中得到高效表達(dá)。嗜熱子囊菌能降解糖類(lèi)和蛋白質(zhì)等并具有良好的熱穩(wěn)定性,有利于大曲產(chǎn)酒生香作用[20]。結(jié)果分析顯示嗜熱子囊菌屬在大曲RG2、RG3中的相對(duì)豐度為31.2%、23.9%,相比于FK2和FK3,同比低了13.6%、20.5%,相對(duì)豐度下降明顯,說(shuō)明實(shí)驗(yàn)室貯存條件相比曲庫(kù)貯存會(huì)一定程度地抑制嗜熱子囊菌的生長(zhǎng);但在其他不同處理大曲中的生長(zhǎng)穩(wěn)定,基本恒定,且相對(duì)豐度比例較其他真菌微生物大,說(shuō)明嗜熱子囊菌在大曲真菌群落中具有較明顯的優(yōu)勢(shì),而要保持其的優(yōu)勢(shì),需提供曲庫(kù)的貯存條件。該結(jié)果為今后研究嗜熱子囊菌在熱風(fēng)干燥大曲中的應(yīng)用提供支持。
霉菌主要產(chǎn)糖化酶,被視為大曲糖化降解動(dòng)力的主要來(lái)源[3,21]。近年有報(bào)道[22]分析了各釀造環(huán)境中曲霉的生態(tài)結(jié)構(gòu)分布。與降溫期大曲相比,曲霉菌在貯存期間表現(xiàn)出良好的生長(zhǎng)態(tài)勢(shì),與已報(bào)道霉菌在貯存階段活躍相一致[23]。曲霉菌在RG2、RG3中的相對(duì)豐度分別為25.5%、37.6%,相比于FK2、FK3,同比增加了11.2%、13%,隨著貯存時(shí)間的延長(zhǎng),曲霉菌生長(zhǎng)越旺盛。分析可能是實(shí)驗(yàn)室貯存環(huán)境里幾乎沒(méi)有曲蟲(chóng)的存在(除大曲自身所帶曲蟲(chóng)外),而曲庫(kù)中曲蟲(chóng)滋生,隨貯存時(shí)間延長(zhǎng)曲蟲(chóng)數(shù)量上升,曲蟲(chóng)能吃掉大曲,影響了曲霉菌類(lèi)的生長(zhǎng),并使得曲塊糖化力、液化力下降[24]。說(shuō)明實(shí)驗(yàn)室的貯存環(huán)境相比于曲庫(kù)更有利于曲霉菌的生長(zhǎng)。
假絲酵母屬是大曲發(fā)酵過(guò)程重要的真菌之一,主要產(chǎn)酒精和脂類(lèi)物質(zhì)[25]。在進(jìn)行干燥排潮后的大曲,假絲酵母屬在FK1、ZR1的相對(duì)豐度分別為22.3%、17.7%,均遠(yuǎn)大于在RG1中的豐度,表明當(dāng)溫度降到45℃左右時(shí),酵母菌類(lèi)活動(dòng)明顯,數(shù)量增加,說(shuō)明干燥工藝后的環(huán)境更利于假絲酵母生長(zhǎng),與已報(bào)道降溫期酵母的數(shù)量有所上升一致[26];在貯存1、2個(gè)月后,其豐度大小為FK2>FK3、ZR2>ZR3,隨貯存時(shí)間的延長(zhǎng)而減少,可能是受到其他微生物競(jìng)爭(zhēng)抑制的影響。
根據(jù)屬水平上的物種注釋及豐度信息,選取豐度排名靠前的真菌屬及其在每個(gè)樣品中的豐度信息,從物種和曲樣兩個(gè)層面進(jìn)行聚類(lèi),繪制成熱圖。根據(jù)顏色梯度反映不同大曲的真菌群落相似差異性及物種聚類(lèi)關(guān)系。不同處理的大曲真菌在屬水平上的微生物組成熱圖如圖6所示,反映了不同處理大曲樣品的相同性和差異性。
圖6 不同處理大曲真菌在屬水平上的微生物組成熱圖Fig. 6 Heat map showing fungal composition from Daqu samples with different treatments
由圖6上端的樣本間聚類(lèi)看出,所有樣品大致分為4 組。大曲RG3根據(jù)豐度信息單獨(dú)聚類(lèi)為一大組;其他8 種大曲聚類(lèi)為一大組,表明了8種大曲之間類(lèi)似的群落結(jié)構(gòu),其中,ZR2的真菌群落獨(dú)立為一組,大曲RG2和ZR3近似,F(xiàn)K1、FK3、RG1、ZR1、FK2聚類(lèi)成一組。
另外,從圖6左端物種聚類(lèi)可以看出,根霉菌屬(Rhizopus)、嗜熱子囊菌屬、根毛霉屬在大曲RG1、ZR1中的比例很高。但相對(duì)于RG1,經(jīng)過(guò)自然干燥后的大曲ZR1,柯達(dá)酵母屬(Kodamaea)、生絲畢赤酵母屬(Hyphopichia)、假絲酵母屬的比例均有所增加,說(shuō)明自然排潮降溫,曲房中的濕度和溫度的調(diào)節(jié)后,酵母群類(lèi)微生物生長(zhǎng)旺盛;但人為的熱風(fēng)干燥處理不利于大多數(shù)真菌微生物的生長(zhǎng),只有假絲酵母屬的數(shù)量有所增加。從貯存方式來(lái)看,相比于大曲ZR1,大曲ZR2中的擬青霉屬(Paecilomyces)、支頂孢屬(Acremonium)增加明顯;大曲ZR3中嗜熱子囊菌屬、Rasamsonia、生絲畢赤酵母屬(Hyphopichia)成為優(yōu)勢(shì)菌群。值得注意的是,耐鹽真菌(Wallemia)、絲衣霉菌屬(Byssochlamys)、青霉菌屬(Penicillium)、曲霉屬是大曲RG3中的主要真菌群類(lèi),其比例也遠(yuǎn)大于其他大曲。
按干燥和貯存處理的不同,將9 個(gè)大曲樣品分成3 個(gè)組,分別是RG1、FK1和ZR1為組A,RG2、FK2和ZR2為組B,RG3、FK3和ZR3為組C。
圖7 不同處理方式大曲中真菌微生物群落組成PCAFig. 7 Principal component analysis of fungal communities from Daqu samples with different treatments
由圖7可以看出,運(yùn)用PCA方法比較不同處理方式的大曲,可獲得兩個(gè)主成分,主成分1的貢獻(xiàn)率為77.16%,主成分2的貢獻(xiàn)率為12.04%,累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到89.2%,因此主成分1和主成分2基本可以全面反映研究區(qū)域真菌微生物群落情況并將不同處理方式的大曲真菌群落區(qū)分開(kāi)來(lái)。大曲樣品RG1和ZR1聚集,F(xiàn)K1雖落點(diǎn)較遠(yuǎn),但根據(jù)主成分1(貢獻(xiàn)率達(dá)到77.16%)可以將FK1與RG1、FK1聚成一類(lèi),說(shuō)明熱風(fēng)干燥工藝對(duì)大曲的真菌微生物群落有一定影響但影響較??;FK3、ZR3聚集,說(shuō)明基于熱風(fēng)干燥工藝并返回曲庫(kù)貯存這一處理方式的大曲與自然干燥自然貯存的大曲差異不明顯;而RG3落點(diǎn)相對(duì)較遠(yuǎn),說(shuō)明熱風(fēng)干燥后經(jīng)實(shí)驗(yàn)室貯存2 個(gè)月的大曲真菌群落有較大的變化。
通過(guò)燈光誘捕、使用藥劑等處理大曲制作環(huán)境,治理效果顯著[27-29],其中外源熱風(fēng)干燥工藝可以完全殺滅曲蟲(chóng),考慮到此工藝以及曲塊在不同貯存環(huán)境(是否避開(kāi)存在曲蟲(chóng)的曲房貯存)可能會(huì)對(duì)大曲中真菌群落產(chǎn)生影響,因此本研究對(duì)不同處理方式的大曲的真菌群落進(jìn)行了探索。采用熒光定量PCR和Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù),研究排潮降溫期大曲通過(guò)熱風(fēng)、自然干燥處理,對(duì)比實(shí)驗(yàn)室貯存、曲庫(kù)貯存9種不同處理方式的大曲在真菌群落之間的差異。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同處理方式大曲中的真菌18S rRNA基因拷貝數(shù)在1×1011~4.5×1011copies/g之間;ZR3拷貝數(shù)最大為4.5×1011copies/g?;诖笄恼婢鄻有灾笖?shù)分析,大曲RG2、RG3、ZR3的多樣性較高。屬水平上相對(duì)豐度的解析中,不同處理大曲的優(yōu)勢(shì)真菌類(lèi)群均為嗜熱子囊菌屬、根毛霉屬、曲霉菌屬、假絲酵母屬。其中嗜熱子囊菌屬在大曲真菌群落中具有明顯的優(yōu)勢(shì),若要保持其優(yōu)勢(shì),需提供曲庫(kù)的貯存條件;而實(shí)驗(yàn)室貯存環(huán)境相比于曲庫(kù)更有利于曲霉菌屬類(lèi)的生長(zhǎng);干燥工藝后的環(huán)境更利于假絲酵母屬類(lèi)生長(zhǎng)。
PCA可看出基于熱風(fēng)干燥工藝并返回曲庫(kù)貯存這一處理方式的大曲與自然干燥自然貯存的大曲差異不明顯;而大曲RG3落點(diǎn)相對(duì)較遠(yuǎn),再結(jié)合微生物組成熱圖可分析大曲RG3中耐鹽真菌、絲衣霉菌屬、青霉菌屬、曲霉屬在大曲RG3中的比例遠(yuǎn)大于其他大曲,是大曲RG3區(qū)別于其他大曲的主要真菌群類(lèi),說(shuō)明熱風(fēng)干燥工藝以及熱風(fēng)干燥后經(jīng)過(guò)2 個(gè)月實(shí)驗(yàn)室貯存的大曲中真菌群落有較大的變化,差異性明顯,故此類(lèi)大曲有進(jìn)一步研究的價(jià)值,為后續(xù)研究提供參考。