轉(zhuǎn)GsERF71基因苜蓿的培育及耐堿性

王子君，陳冉冉，朱娉慧，于 洋，陳 超，孫曉麗，段香波，杜建英，任 皓，劉 琪，朱延明

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物功能基因重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030)

紫花苜蓿(Medicagosativa)被稱為“牧草之王”，是種植面積大、分布廣泛的高蛋白豆科牧草，具有較高的經(jīng)濟(jì)價值[1-2]。苜蓿的根系發(fā)達(dá)、生長密集、莖葉繁多、覆蓋度高，可對退化草地進(jìn)行一定程度的植被恢復(fù)，從而遏制草地退化。因此，種植紫花苜蓿不僅促進(jìn)畜牧業(yè)發(fā)展，還達(dá)到了防止水土流失和防風(fēng)固沙的目的[3]。而傳統(tǒng)育種存在時間長、見效慢、消耗人力等缺點[4]。采用基因工程技術(shù)手段培育耐鹽堿轉(zhuǎn)基因苜蓿新品種，對于鹽堿地改良和發(fā)展畜牧業(yè)具有重大的戰(zhàn)略意義，并能推動經(jīng)濟(jì)和生態(tài)的可持續(xù)發(fā)展[5]。

在耐鹽堿轉(zhuǎn)基因苜蓿方面，我國已取得了重大的研究進(jìn)展。Tang等[6]將WRKY20基因轉(zhuǎn)入紫花苜蓿中提高了苜蓿的耐旱和耐鹽能力；李燕等[7]將MsZIP基因轉(zhuǎn)入苜蓿中從而提高了苜蓿的耐鹽性和耐旱性；王臻昱等[8]通過將GsGST19超量表達(dá)的方法，顯著增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因苜蓿的耐堿性。因此，耐鹽堿轉(zhuǎn)基因苜蓿對于促進(jìn)奶業(yè)及草食畜牧業(yè)的健康發(fā)展和環(huán)境改善具有重要意義。

在植物中存在一類ERF基因，它屬于AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子超家族[9]。根據(jù)結(jié)構(gòu)域的個數(shù)將AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子分為3個家族：含有1個AP2/ERF結(jié)構(gòu)域?qū)儆贓RF家族；含有兩個重復(fù)的AP2/ERF結(jié)構(gòu)域?qū)儆贏P2家族[10]；除了含有1個AP2/ERF結(jié)構(gòu)域以外，還有另外的1個B3結(jié)構(gòu)域則屬于RAV家族。另外，根據(jù)AP2/ERF結(jié)構(gòu)域中不同的保守氨基酸，又將ERF轉(zhuǎn)錄因子家族分為ERF亞家族和CBF/DREB亞家族。研究證明，DRE類轉(zhuǎn)錄因子可以結(jié)合DRE/CRT順式作用元件來參與植物響應(yīng)非生物脅迫[11]。而超量表達(dá)的ERF類轉(zhuǎn)錄因子可以顯著提高植物對脅迫的耐性[12]；在擬南芥(Arabidopsis)中超量表達(dá)AtERF98可以顯著提高植物的耐鹽性[13]；超量表達(dá)CarERF116能夠提高擬南芥對滲透脅迫和冷脅迫的耐性[14]；GsERF71的超量表達(dá)調(diào)節(jié)水稻(Oryzasativa)根部木質(zhì)素的合成，最終提高水稻的耐旱能力[15]。由此可見，超量表達(dá)ERF類基因可以提高植物對相關(guān)脅迫的耐性。但目前研究多集中在對模式植物的功能分析上，對其他植物的研究報道較少。

因此，從野生大豆(Glycinesoja)轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)中得到的堿脅迫應(yīng)答基因GsERF71，選用USER載體構(gòu)建植物超量表達(dá)載體，采用EHA105農(nóng)桿菌侵染苜蓿子葉節(jié)，將GsERF71基因?qū)胱匣ㄜ俎Ｖ?，獲得抗性株系，并通過PCR、Southern blot、RT-PCR的技術(shù)獲得轉(zhuǎn)基因株系；分析在堿脅迫處理下的苜蓿生長狀況及相應(yīng)的生理指標(biāo)，以期獲得耐堿性轉(zhuǎn)基因苜蓿，并確定轉(zhuǎn)GsERF71基因能提高紫花苜蓿的耐堿性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

東北野生大豆，肇東紫花苜蓿(G07256)，大腸桿菌DH5α，根癌農(nóng)桿菌EHA105菌株及植物表達(dá)載體pCAMBIA330035S均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物功能基因重點實驗室提供并保存；質(zhì)粒提取試劑盒、植物總RNA、DNA提取試劑盒均購自全式金公司。引物合成及測序由英俊生物公司完成。

1.2 植物表達(dá)載體的構(gòu)建

本研究基于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物功能基因重點實驗室前期獲得的堿脅迫應(yīng)答基因Glyma02G016100，設(shè)計上下游引物(5′-GGCTTAAUATGTGTGGCGGTGCCATCAT-3′；5′-GGTTTAAUCTAATCGAAACTCCAGAGATCCCC-3′)。Pfu Turbo Cx Hotstart DNA Polymerase[16-17]進(jìn)行PCR擴(kuò)增并得到完整的CDS序列。回收目的條帶后，將目的基因和被Sacl和Nt.Bbvcl雙酶切后的pCAMBIA30035Su植物表達(dá)載體重新連接。得到CaMV35S強(qiáng)啟動子調(diào)控，Bar基因作為篩選標(biāo)記基因的植物表達(dá)載體pCAMBIA330035Su-GsERF71，通過凍融法將植物表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105中，用于下一步的試驗。

1.3 轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿的培育

選取淺黃色、腎形飽滿、形狀完整的苜蓿種子進(jìn)行滅菌，春化2 d后置于萌發(fā)培養(yǎng)基上培養(yǎng)8 d，在無菌苗的子葉節(jié)下方約1 mm處剪取子葉節(jié)并接種到預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基上。2 d后用根癌農(nóng)桿菌EHA105對苜蓿子葉節(jié)進(jìn)行侵染，將子葉節(jié)接種于含有100 μmol·L-1乙酰丁香酮共培養(yǎng)的培養(yǎng)基中。于28 ℃暗培養(yǎng)3 d后對子葉進(jìn)行除菌培養(yǎng)。使用100 mg·L-1的阿莫西林-克拉維酸鉀的液體培養(yǎng)基沖洗子葉節(jié)，隨后將外植體接種到含有0.5 mg·L-1的草甘膦的培養(yǎng)基上，進(jìn)行繼代培養(yǎng)。當(dāng)子葉節(jié)分化出2～3 cm的不定芽時，剪取不定芽并浸泡在1 g·mL-1的IBA 1 min并轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根，約14 d左右長出不定根。當(dāng)根系生長至2～3 cm長時，取出小苗，在水中進(jìn)行馴化。待小苗適應(yīng)環(huán)境后將抗性苗移栽到土中繼續(xù)培養(yǎng)。最終獲得抗性植株[18]。

1.4 再生植株的分子生物學(xué)檢測

1.4.1PCR檢測 利用Bar基因的特異性引物(5′-TGCACCATCGTCAACCACTACATCG-3′；5′-CCAGCTGCCAGAAACCCACGTCATG-3′)對抗性植株進(jìn)行PCR鑒定。其中，含有GsERF71基因的重組質(zhì)粒作為陽性對照，水和野生型株系的DNA為陰性對照，進(jìn)行PCR檢測。

1.4.2Southern Blot檢測 為了鑒定GsERF71基因是否整合并遺傳到苜蓿以及在苜蓿中的拷貝數(shù)，對PCR陽性植株進(jìn)行Southern blot免疫印跡分析。CTAB法提取苜蓿DNA[19]，以GsERF71基因的特異性引物(5′-GGCTTAAUATGTGTGGCGGTGCCATCAT-3′；5′-GGTTTAAUCTAATCGAAACTCCAGAGATCCCC-3′)為探針。經(jīng)過酶切、電泳、轉(zhuǎn)膜、預(yù)雜交、雜交等步驟進(jìn)行Southern blot檢測。

1.4.3RT-PCR檢測 以Southern blot檢測得到的陽性植株葉片總RNA為模板制備cDNA，用于RT-PCR分析。GAPDH作為內(nèi)參基因(5′-GACTGGTATGGCATTCCGTGT-3′；5′-GCCCTCTGATTCCTCCTTGA-3′)，非轉(zhuǎn)基因苜蓿作為陰性對照，用基因序列特異性引物(5′-AACTCCTTCGCCAAAGACGATGACT-3′；5′-ACCTTAGCCTTTTTGCCTCGGATTT-3′)對轉(zhuǎn)GsERF71基因苜蓿進(jìn)行RT-PCR檢測。

1.5 轉(zhuǎn)基因苜蓿的耐堿性生物學(xué)分析

1.5.1轉(zhuǎn)基因植株的扦插擴(kuò)繁 于2017年7-8月對苜蓿進(jìn)行扦插擴(kuò)繁。選取生長狀況良好的、木質(zhì)化程度均勻一致的枝條，每隔2～3個節(jié)點剪為一段，浸泡在1∶5 000的生根粉溶液中2 h后轉(zhuǎn)移到含有蛭石∶珍珠巖∶草炭土比例為1∶1∶1的小缽中，模擬室外環(huán)境，16 h的光照8 h的黑暗的光照周期以及白天27 ℃夜晚20 ℃的晝夜溫差，濕度70%的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)28 d直至材料逐漸生根，地上部分長出新葉，將生根后的材料轉(zhuǎn)移到蛭石∶珍珠=1∶1的小缽中繼續(xù)培養(yǎng)，用稀釋后的霍格蘭溶液對植物進(jìn)行澆灌，連續(xù)28 d[20]。得到900株轉(zhuǎn)基因株系以及450株野生型株系。

1.5.2轉(zhuǎn)基因植株的堿脅迫處理 選擇生長狀況一致的轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因扦插苗，分別用含有0、100和150 mmol·L-1NaHCO3溶液的霍格蘭營養(yǎng)液每兩天澆灌一次扦插苗,連續(xù)兩周后觀察表型[21]。10株扦插苗為一組。3次重復(fù)下每個濃度共測量9組植株，統(tǒng)計株高。將植株從盆中取出，洗凈根部，測量每個植株毛狀根的長度。每個濃度下選取轉(zhuǎn)基因株系60株，非轉(zhuǎn)基因株系30株進(jìn)行測量。

1.5.3轉(zhuǎn)基因植株生理指標(biāo)的測定 分別取不同堿脅迫處理條件下轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因植株的葉片。測定每個生理指標(biāo)需要轉(zhuǎn)基因株系60株，非轉(zhuǎn)基因株系30株。取同一株系不同枝條上的綠色嫩葉進(jìn)行各項指標(biāo)的測定。分別剪取葉片放入液氮中帶回實驗室，并儲藏于-80 ℃冰箱中, 用于測定葉綠素和丙二醛的含量。測定相對質(zhì)膜透性、過氧化物酶以及脯氨酸含量時則需要洗凈葉片表面的殘留物進(jìn)行測定。稱取0.05 g葉片放入離心管中，液氮冷凍后使用組織破碎儀震蕩成粉末。采用丙酮法[22]檢測葉綠素含量；選取葉齡相似的待測植物葉片，剪下后用沾濕的紗布包裹住留存待用。將剪下的葉片用清水沖洗幾次直到洗去葉片表面的殘留物。用蒸餾水洗2～3次后使用紗布擦干葉片表面，使用打孔器取直徑1 cm的圓片，用電導(dǎo)法[23]測定相對質(zhì)膜透性。取液氮冷凍后的0.05 g葉片，組織破碎儀震蕩成粉末后用硫代巴比妥酸法(TBA)[24]來測定丙二醛含量。天平稱取1 g植物材料，選用愈創(chuàng)木酚法[25]測定其活性?；腔畻钏岱╗26]測定植物葉片中游離脯氨酸含量。以上形態(tài)指標(biāo)及生理指標(biāo)均設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)，為同一批培養(yǎng)同一濃度處理同時取樣的不同植株。

1.6 數(shù)據(jù)分析

利用IBM SPSS Statistics 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和顯著性分析，采用Excel 2007進(jìn)行制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物表達(dá)載體構(gòu)建及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

根據(jù)野生大豆基因Glyma02G016100序列，設(shè)計特異性引物。PCR擴(kuò)增得到GsERF71基因，將回收的基因片段與雙酶切后的植物表達(dá)載體進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌，經(jīng)過菌落PCR鑒定、測序得到正確的轉(zhuǎn)化子。此重組載體上含有Bar基因和35S強(qiáng)啟動子調(diào)控的GsERF71基因(圖1)，使用凍融法將重組載體pCAMBIA330035Su-CsERF71轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，菌落PCR鑒定得到約900 bp左右的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物(圖2)，表明重組質(zhì)粒已成功導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌中，可用于下一步侵染苜蓿子葉節(jié)的遺傳轉(zhuǎn)化。

圖1 GsERF71植物超量表達(dá)載體的構(gòu)建Fig. 1 Construction of GsERF71 plant overexpression vector

圖2 植物表達(dá)載體pCAMBIAs330035Su-GsERF71導(dǎo)入農(nóng)桿菌PCR鑒定結(jié)果Fig. 2 PCR identification results for the pCAMBIAs330035Su-GsERF71 plant expression vector were transformed into Agrobacterium

M,DL2000；+,陽性對照(pCAMBIAs330035Su-GsERF71質(zhì)粒)；-,陰性對照(去離子水陰性對照)；1-4,陽性轉(zhuǎn)化子。

M, DL2000 marker；+, positive control (pCAMBIAs330035Su-GsERF71plasmid); -, negative control(deionized water); 1-4, positive transformants.

2.2 GsERF71基因?qū)ψ匣ㄜ俎５倪z傳轉(zhuǎn)化

遺傳轉(zhuǎn)化具體流程如圖3所示。經(jīng)過無菌苗的培養(yǎng)、預(yù)培養(yǎng)、共培養(yǎng)、除菌篩選及不定芽分化伸長、生根培養(yǎng)等步驟，將含有pCAMBIAs330035Su-GsERF71植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌侵染大約8 000個子葉節(jié)，最終獲得了轉(zhuǎn)GsERF71基因抗性植株69株。

2.3 轉(zhuǎn)GsERF71基因苜蓿的分子生物學(xué)檢測

2.3.1轉(zhuǎn)GsERF71基因苜蓿的PCR檢測 以抗性植株葉片總DNA為模板，含有目的基因的質(zhì)粒作為陽性對照，非轉(zhuǎn)基因植株基因組DNA為陰性對照，進(jìn)行PCR檢測。結(jié)果如圖4所示。與對照組相比，陽性對照和抗性植株均擴(kuò)增出了長度約450 bp左右的特異性片段。表明GsERF71基因可能已整合到苜?；蚪M中，一共得到陽性植株13株，陽性率為18.84%。

2.3.2轉(zhuǎn)GsERF71基因苜蓿的Southern blot鑒定 為了鑒定GsERF71基因是否整合并遺傳到苜蓿中并確定目的基因在苜蓿中的拷貝數(shù)，對PCR檢測后得到的13株陽性植株進(jìn)行Southern blot分析，Southern blot檢測獲得2株陽性植株，結(jié)果如圖5所示。#15、#39兩個株系均檢測到雜交信號，表明GsERF71基因已成功整合到苜?；蚪M中，均為單拷貝，陽性率為15.38%。

圖3 苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化及植株再生Fig. 3 Genetic transformation and plant regeneration of alfalfa

A,種子萌發(fā); B,8日齡無菌苗; C,預(yù)培養(yǎng); D,共培養(yǎng); E,不定芽誘導(dǎo);F,不定芽伸長;G,抗性芽生根;H,抗性植株獲得。

A, seed germination; B, 8-day-old seedling; C, preculture; D, Co-cultivation; E, adventitious bud induction; F, adventitious buds elongate and grow; G, resistant shoots rooting; H, resistant plants are obtained.

圖4 轉(zhuǎn)GsERF71基因抗性植株的PCR檢測Fig. 4 PCR identification of resistant plants with GsERF71

M,DL2000 marker；+,陽性對照；-,水對照；CK,非轉(zhuǎn)基因?qū)φ眨?-9,轉(zhuǎn)GsERF71基因抗性植株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物。下同。

M, DL2000 marker; +, positive control; -, water control; CK, control check; 1-9, amplification products of transgenic plants withGsERF71 gene. similarly for the following figures.

圖5 轉(zhuǎn)基因植株的Southern blot鑒定Fig. 5 Southern blot identification of transgenic alfalfa

2.3.3轉(zhuǎn)GsERF71基因苜蓿的RT-PCR檢測 以Southern blot檢測得到的陽性植株葉片總RNA為模板制備cDNA，進(jìn)行RT-PCR的檢測分析，如圖6所示。結(jié)果表明#15、#39株系中GsERF71已成功整合至苜?；蚪M并能在轉(zhuǎn)錄水平上有表達(dá)。陽性率為100%。

圖6 轉(zhuǎn)基因植株的RT-PCR鑒定Fig. 6 Semi-RT PCR of transgenic alfalfa resistant plants with GsERF71

CK為野生型，下圖同。

CK, wild type; similarly for the following figures.

2.4 轉(zhuǎn)基因苜蓿的耐堿性生物學(xué)分析

2.4.1堿脅迫下轉(zhuǎn)基因苜蓿的表型分析 對轉(zhuǎn)基因株系#15、#39和野生型株系的扦插植株統(tǒng)一進(jìn)行堿脅迫處理，用NaHCO3模擬堿脅迫，選取生長狀況一致的野生型和轉(zhuǎn)基因株系，分別用含有0、100和150 mmol·L-1NaHCO3的霍格蘭溶液連續(xù)處理14 d后，對野生型與轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行耐堿性分析。

對處理后的植株進(jìn)行株高與根長的統(tǒng)計分析,發(fā)現(xiàn)堿脅迫下，轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因苜蓿的株高和根長均受到抑制。隨著堿脅迫濃度的增加，所有株系的形態(tài)指標(biāo)均呈逐漸下降趨勢。在NaHCO3未處理條件下轉(zhuǎn)GsERF71基因與非轉(zhuǎn)基因植株生長一致且無顯著差異(P<0.05)；150 mmol·L-1NaHCO3的霍格蘭溶液處理14 d后，轉(zhuǎn)基因株系與對照株系的生長均受到抑制，所有植株的株高與根長均呈下降趨勢，但非轉(zhuǎn)基因株系減少的幅度更大，與轉(zhuǎn)基因植株相比差異顯著(P<0.05)，由此說明轉(zhuǎn)基因株系表現(xiàn)出一定程度的堿脅迫抗性(圖8)。

圖7 #15和#39轉(zhuǎn)基因株系的影響Fig. 7 Effect of alkali stress on strain #15 and #39

2.4.2堿脅迫下轉(zhuǎn)基因苜蓿的生理指標(biāo)檢測 在不同梯度NaHCO3溶液脅迫下，轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因植株的脯氨酸含量均呈現(xiàn)上升趨勢(圖9)。在相同濃度NaHCO3脅迫處理下轉(zhuǎn)基因株系中的脯氨酸含量顯著高于非轉(zhuǎn)基因植株(P<0.05)說明在堿脅迫下轉(zhuǎn)基因苜蓿能夠積累大量脯氨酸提高細(xì)胞滲透勢來防止細(xì)胞失水，從而提高苜蓿的耐堿性。

圖8 堿脅迫對轉(zhuǎn)GsERF71基因苜蓿株高和根長的影響Fig. 8 Changes of plant height and root length of transgenic alfalfa with GsERF71 under alkaline stress

不同小寫字母表示不同濃度不同材料間差異顯著(P<0.05)，下同。

Different lowercase letters indicate significant difference at the 0.05 level; similarly for the Figure 9.

對轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因植株的相對質(zhì)膜透性分析，結(jié)果顯示，未NaHCO3處理條件下轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因苜蓿的相對質(zhì)膜透性基本無差異。隨著堿處理濃度的增高所有植株的相對質(zhì)膜透性均呈現(xiàn)上升趨勢，且非轉(zhuǎn)基因植株相對質(zhì)膜透性的上升幅度顯著高于轉(zhuǎn)基因植株(P<0.05)。由此表明，堿脅迫下非轉(zhuǎn)基因植株細(xì)胞膜所受的損害較轉(zhuǎn)基因植株更為嚴(yán)重，進(jìn)一步說明轉(zhuǎn)GsERF71基因的苜蓿細(xì)胞膜受到相對較輕的損害，因此能提高植株的耐堿能力(圖9)。

丙二醛可以反映植物細(xì)胞內(nèi)積累活性氧的程度。當(dāng)植物受到堿脅迫時植物體內(nèi)會產(chǎn)生大量的活性氧，因而測定丙二醛可以直接反映植物所受到的堿脅迫傷害。在100和150 mmol·L-1兩種NaHCO3濃度的霍格蘭溶液處理下，轉(zhuǎn)基因植株葉片中的丙二醛含量顯著低于非轉(zhuǎn)基因植株(P<0.05) (圖9)。說明與非轉(zhuǎn)基因苜蓿相比，轉(zhuǎn)GsERF71基因的苜蓿受到相對較輕的堿脅迫傷害。

在100和150 mmol·L-1NaHCO3溶液脅迫處理下，CK ，#15，#39植株的POD活性均有上升，且轉(zhuǎn)基因株系的POD活性均顯著高于對照株系(P<0.05)(圖9)。說明轉(zhuǎn)GsERF71基因苜蓿的株系能更好的還原過氧化氫，從而減少對植物細(xì)胞的傷害，達(dá)到延緩植株衰老的效果。

轉(zhuǎn)GsERF71基因和非轉(zhuǎn)基因的苜蓿葉綠素含量檢測結(jié)果顯示，堿脅迫會對植物體內(nèi)光合作用相關(guān)元件造成傷害損傷，從而使植物失綠甚至死亡。在100和150 mmol·L-1NaHCO3濃度的堿脅迫下，#15和#39葉片中的葉綠素含量均高于非轉(zhuǎn)基因株系(P<0.05)。說明轉(zhuǎn)基因植株通過減少葉綠體的受損程度來提高其光合能力從而提高耐堿性。

圖9 堿脅迫下轉(zhuǎn)GsERF71基因苜蓿的生理指標(biāo)檢測Fig. 9 Physiological indices analysis of transgenic alfalfa with GsERF71 under alkaline stress

3 討論

野生大豆具有耐鹽堿、抗寒、抗病等優(yōu)良性狀，含有多種耐逆基因。作為豆科植物的野生大豆與紫花苜蓿具有高度同源性，野生大豆基因轉(zhuǎn)入豆科作物中不存在異源表達(dá)的差異性，因而表達(dá)效率更高，被視為研究豆科作物耐堿轉(zhuǎn)基因分子機(jī)理的理想材料[27]。根據(jù)前期構(gòu)建的野生大豆堿脅迫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，從ERF類轉(zhuǎn)錄因子中篩選到響應(yīng)堿脅迫相關(guān)基因GsERF71。已有研究證明，在擬南芥中，野生大豆堿脅迫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子GsERF71基因的超量表達(dá)可以提高植物的耐堿性[12]。GsERF71與其他物種的成員LeERF2和CaERFLP1也具有較高的同源性，向煙草中導(dǎo)入LeERF2基因明顯增強(qiáng)了植物的耐鹽性[28]；來自胡椒(LinderachieniiCheng)CaERFLP1基因可以提高煙草的耐鹽性[29]。研究表明，這兩個基因在不同物種中均能提高植物的耐鹽性，而GsERF71基因已經(jīng)被證實在擬南芥中可以提高植物的耐堿性[12]。因此推測GsERF71在同為豆科植物的苜蓿中也具有相似的功能。本研究主要從分子育種的角度來培育轉(zhuǎn)基因植株并驗證目的基因的耐堿性。結(jié)果顯示，GsERF71基因在紫花苜蓿中的超量表達(dá)提高了其對堿脅迫的耐受力[30]，這一結(jié)果為豆科作物耐堿轉(zhuǎn)基因分子育種提供了重要的基因資源[31]。

堿脅迫條件下，植物能夠通過調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)膜上H+-ATPase，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)和調(diào)控生長素的分布來響應(yīng)堿脅迫[32-33]。GsERF71能夠通過維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，調(diào)控H+-ATPase等脅迫相關(guān)基因來提高植物的耐堿能力[12]。GsERF71基因在野生大豆的根和下胚軸中表達(dá)量較高，而在其他組織中的表達(dá)量則相對較低，相差100～200倍；說明此基因在野生大豆組織中的分布都具有時空特異性。表達(dá)模式分析表明，GsERF71能夠被堿脅迫快速誘導(dǎo)表達(dá)。堿脅迫下，GsERF71表達(dá)量在根中的變化更快更高，可能由于根部是最先接觸到脅迫處理的部位。而且GsERF71在堿脅迫條件下的變化量要高于鹽脅迫條件下，說明GsERF71對于堿脅迫的響應(yīng)更顯著，在植物響應(yīng)堿脅迫過程中具有重要的作用。在擬南芥中超量表達(dá)GsERF71基因，通過對比野生型與超量表達(dá)植株對堿脅迫的耐性來確定GsERF71基因的功能。結(jié)果表明超量表達(dá)GsERF71能夠顯著提高植物各個生長時期對堿脅迫(NaHCO3)的耐性，說明GsERF71在植物響應(yīng)堿脅迫過程中具有重要的功能。研究發(fā)現(xiàn)生長素合成相關(guān)基因ASA1和ASB1受堿脅迫誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)[34]，但是其表達(dá)量在GsERF71超量表達(dá)植株中要低于野生型植株，表明在堿脅迫條件下GsERF71可能間接或者直接負(fù)調(diào)生長素的累積。堿脅迫條件下生長素合成相關(guān)基因PAT1、PAI1和TRP倚賴的生長素合成基因TAR1、TAR2，NIT3還有IAA氨基酸合成酶基因GH3.2和GH3.3在GsERF71超量表達(dá)植株中的表達(dá)量均顯著低于野生型植株。生長素結(jié)合基因ILL2和ILL3能夠通過水解釋放游離的生長素，其表達(dá)量在超表達(dá)植株中也顯著低于野生型，表明在堿脅迫下GsERF71能夠負(fù)調(diào)植物體內(nèi)生長素的累積，從而減緩生長素過高對于根生長的抑制作用，表現(xiàn)出對堿脅迫耐性的增強(qiáng)。酵母單雜交試驗發(fā)現(xiàn)，GsERF71在酵母細(xì)胞內(nèi)能夠與DRE和GCC元件結(jié)合，啟動下游報告基因HIS的表達(dá)。DRE和GCC元件廣泛存在于許多生物脅迫或非生物脅迫相關(guān)基因的啟動子中，因此，GsERF71極有可能通過調(diào)控脅迫相關(guān)Marker基因的表達(dá)提高植物對堿脅迫的耐性。通過qRT-PCR方法檢測了野生型擬南芥和超表達(dá)GsERF71擬南芥中脅迫相關(guān)基因RD29A、COR47和KIN1以及堿脅迫相關(guān)基因NADP-ME，V-H+-PPase和H+-ATPase[34-35]在堿脅迫條件下的表達(dá)模式。脅迫相關(guān)基因RD29A，COR47和KIN1的啟動子中含有多個DRE和GCC元件，能夠響應(yīng)多種非生物脅迫和激素信號如鹽、低溫、干旱和ABA等[36]。這些脅迫相關(guān)基因在堿脅迫條件下均被上調(diào)表達(dá)，并且在超量表達(dá)植株中這些基因的表達(dá)量顯著高于野生型植株。有研究報道H+-ATPase能夠通過與14-3-3蛋白互作來提高植物對堿脅迫的耐性[35]，而該基因在GsERF71轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)量也顯著高于野生型植株，GsERF71可能通過上調(diào)H+-ATPase及相關(guān)非生物脅迫應(yīng)答基因的表達(dá)來提高植物的耐堿能力。因此，GsERF71通過正調(diào)控脅迫相關(guān)基因的表達(dá)來幫助植物提高耐堿能力的。

堿脅迫下，植物體內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧，導(dǎo)致植物體內(nèi)活性氧失衡，從而對核酸，蛋白質(zhì)的大分子造成不利的影響。其中包括光合作用元件損傷影響光合作用，膜系統(tǒng)過氧化而改變質(zhì)膜透性，產(chǎn)生丙二醛。而植物體內(nèi)的活性氧機(jī)制可以一定程度上清除活性氧自由基，維持細(xì)胞活性氧代謝平衡。因此本研究測定的生理指標(biāo)均可用來指示植物在堿脅迫下受到的損傷情況。苜蓿生理指標(biāo)結(jié)果顯示，在堿脅迫下GsERF71基因的超量表達(dá)可以調(diào)節(jié)相關(guān)酶活性，積累大量脯氨酸來提高細(xì)胞滲透勢來防止細(xì)胞失水，清除植株在脅迫下產(chǎn)生的活性氧，防止脂膜被氧化而產(chǎn)生丙二醛，減少質(zhì)膜損傷程度，維持細(xì)胞的穩(wěn)定性，減少葉綠體的受損程度來提高植物的光合能力[37]。產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因可能是苜蓿中GsERF71基因通過上調(diào)H+-ATPase、NADP-ME、KIN1、RD29A等苜蓿堿脅迫相關(guān)基因的表達(dá)來提高植物的耐堿能力。

4 結(jié)論

綜上所述，在苜蓿中超量表達(dá)GsERF71基因可以提高植物的耐堿能力。通過侵染苜蓿子葉節(jié)將GsERF71基因?qū)胲俎Ｖ校瑢剐悦邕M(jìn)行分子生物學(xué)檢測，得到轉(zhuǎn)基因植株#15和#39，對植株進(jìn)行模擬鹽堿土地的堿脅迫處理，從形態(tài)指標(biāo)株高和根長，生理指標(biāo)脯氨酸、丙二醛、葉綠素、過氧化物酶活的含量以及相對質(zhì)膜透性的表達(dá)量證實了GsERF71基因提高了苜蓿的耐堿性。