二代測(cè)序在家族遺傳性高危胃腸腫瘤篩查中的應(yīng)用*

消化道腫瘤是世界范圍內(nèi)高發(fā)的惡性腫瘤。中國(guó)人群消化道腫瘤的發(fā)病率逐年升高，其中胃癌發(fā)病率位居第3位，結(jié)直腸癌位居第5位［1］。絕大多數(shù)胃癌為散發(fā)性病例，但約10%患者具有家族聚集特征，其中約1/3被認(rèn)為具有遺傳背景。遺傳性彌漫型胃癌主要與CDH1的胚系突變有關(guān)，病理類型多為彌漫型和（或）印戒細(xì)胞癌；除了胃癌，小葉性乳腺癌和結(jié)直腸癌等腫瘤的發(fā)生率也明顯升高［2］。對(duì)于遺傳家系中CDH1基因突變攜帶者終生胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)高達(dá)60%～80%［3］。同樣在結(jié)直腸癌中，約30%患者具有家族遺傳特征，其中有明確致病因素的遺傳性結(jié)直腸癌約占5%～6%［4］。目前，發(fā)病率最高、研究相對(duì)系統(tǒng)的Lynch綜合征約占全部結(jié)直腸癌的3%，由錯(cuò)配修復(fù)基因的胚系突變導(dǎo)致，其攜帶者具有早發(fā)結(jié)直腸癌和易患第二原發(fā)腫瘤的特點(diǎn)［5-7］。對(duì)于攜帶腫瘤遺傳相關(guān)基因人群進(jìn)行及時(shí)的診斷和規(guī)范的隨訪監(jiān)測(cè)，有助于降低該特定人群腫瘤發(fā)生率及死亡率，具有明確的一、二級(jí)預(yù)防價(jià)值。

對(duì)遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌（hereditary non?polyposis colorectal cancer，HNPCC）來說，雖然修正的“百慕大標(biāo)準(zhǔn)”明顯提高了診斷的敏感度，但仍有20%～30%患者會(huì)被遺漏［7］。遺傳性彌漫性胃癌更因國(guó)內(nèi)認(rèn)知及研究匱乏，容易被臨床忽視。目前，關(guān)于遺傳性消化腫瘤篩查的結(jié)果顯示，50%甚至更多符合臨床診斷的患者或家系無法找到明確的分子致病機(jī)制。其原因包括：1）目標(biāo)基因新的致病性突變未被發(fā)現(xiàn)；2）由于臨床表現(xiàn)多樣和腫瘤家族史不典型，其臨床診斷的遺傳綜合征與遺傳致病基因不符。因此，傳統(tǒng)的表型特異性單基因檢測(cè)模式已難以滿足當(dāng)前遺傳性消化道腫瘤的診療需求。隨著測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步［8］，對(duì)遺傳性腫瘤多基因平臺(tái)的同時(shí)性檢測(cè)，極大地推動(dòng)了低外顯率及未知突變的發(fā)現(xiàn)，因此運(yùn)用二代測(cè)序的方法對(duì)遺傳性消化道腫瘤進(jìn)行篩查具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。

本文擬通過發(fā)病年齡、家族史、病理類型、腫瘤微衛(wèi)星狀態(tài)等遺傳性消化道腫瘤的危險(xiǎn)因素，篩選高危人群，通過二代測(cè)序的方法同時(shí)性檢測(cè)42個(gè)遺傳性腫瘤相關(guān)基因，探索對(duì)遺傳性消化道腫瘤高危患者進(jìn)行遺傳篩查的意義及不同危險(xiǎn)因素在患者篩選中的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 病例資料

選取2016年3月至2016年4月收治于北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院的322例結(jié)直腸癌及胃癌患者，篩選滿足遺傳性胃腸腫瘤的高危人群，入組患者需滿足下述1項(xiàng)：1）患者年齡≤30歲，不論有無家族史；2）患者年齡≤35歲，不論有無家族史；特殊病理類型：印戒細(xì)胞癌或黏液腺癌；3）患者年齡≤50歲；且≥1位一級(jí)親屬中發(fā)生惡性腫瘤；4）≥2位一、二級(jí)親屬發(fā)生惡性腫瘤，其中至少1位是一級(jí)親屬；5）患者本身≥2種惡性腫瘤，且患第1種惡性腫瘤時(shí)年齡≤50歲；6）組織標(biāo)本微衛(wèi)星不穩(wěn)定（microsatellite instability，MSI）或錯(cuò)配修復(fù)蛋白缺失。共篩選79例滿足入組條件患者，排除臨床資料不完善及樣本不完整者，共入組患者25例。本研究經(jīng)過北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)審批（編號(hào)：2016YJZ52）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本的獲取 入組患者抽取外周血5 mL，使用 Maxwell?RSC DNA FFPE Kit試劑和 Maxwell?RSC自動(dòng)提取儀（均購(gòu)自美國(guó)Promega公司）按照說明書標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行全血樣本DNA提取。提取的DNA使用NanoDropTM2000（購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司）進(jìn)行檢測(cè)，使用Qubit?3.0熒光定量?jī)x（購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司）進(jìn)行定量。

1.2.2 胚系基因檢測(cè) 所有患者均進(jìn)行了42個(gè)遺傳性腫瘤相關(guān)基因的胚系檢測(cè)，包括：APC、ATM、BLM、BMPR1A、BRCA1、BRCA2、CDH1、CDKN2A、CFTR、CHEK2、CTNNA1、DDB2、EPCAM、ERCC1、ERCC2、ERCC3、ERCC4、ERCC5、FANCC、FANCG、GALNT12、GREM1、MLH1、MLH3、MSH2、MSH6、MSR1、MUTYH、PALB2、PMS2、POLD1、POLE、POLH、PRSS1、PTEN、SMAD4、SPINK1、STK11、TGFBR2、TP53、XPA、XPC。

1.2.3 技術(shù)及數(shù)據(jù)分析 全外顯子組高通量測(cè)序技術(shù)基于美國(guó)Agilent公司的SureSelect全外顯子組捕獲技術(shù)對(duì)人類全部已知基因的外顯子區(qū)域進(jìn)行捕獲。采用SureSelect Human All Exon V5+UTRs Kit試劑盒。捕獲后的DNA序列采用美國(guó)Illumina公司的HiSeq X10高通量測(cè)序平臺(tái)的標(biāo)準(zhǔn)文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序流程進(jìn)行測(cè)序測(cè)序，對(duì)高通量數(shù)據(jù)運(yùn)用GATK（Genome Analysis Toolkit，https：//software.broadinstitute.org/gatk/）標(biāo)準(zhǔn)方法流程進(jìn)行分析，基因突變位點(diǎn)的臨床意義主要參照ClinVar數(shù)據(jù)庫(kù)［9］。

2 結(jié)果

2.1 一般資料

本研究共入組25例患者，其中男性占48%（12/25），≤50歲的患者占72%（18/25），結(jié)直腸癌和胃癌患者分別占76%（19/25）和24%（6/25），腫瘤組織有黏液腺癌和印戒細(xì)胞癌成分的占42%（10/25），絕大多數(shù)患者具有腫瘤家族史80%（20/25），2例患者自身患有2種惡性腫瘤，免疫組織化學(xué)顯示錯(cuò)配修復(fù)基因表達(dá)缺失（mismatch repair-deficient，dMMR）的患者占32%（8/25），錯(cuò)配修復(fù)蛋白表達(dá)正常（mismatch repair-proficient，pMMR）的患者占28%（7/25），微衛(wèi)星狀態(tài)未知的患者占40%（10/25）。

2.2 突變患者臨床分子特征

入組的25例患者中，6例患者檢測(cè)到病理性胚系突變，總發(fā)生率為24%。其中50%（3/6）患者腫瘤組織表現(xiàn)為錯(cuò)配修復(fù)蛋白缺失，83%（5/6）患者發(fā)病年齡≤50歲且具有惡性腫瘤家族史（表1）。

1例MYH相關(guān)性息肉病患者［10（MUTYH，c.467G＞A：p.Trp156Ter）臨床診斷為胃腸息肉綜合征及早發(fā)結(jié)腸癌，該患者2例一級(jí)親屬均在35歲診斷為結(jié)直腸癌，1例一級(jí)親屬因結(jié)腸息肉行全結(jié)腸切除術(shù)。1例APC（c.3126_3130del：p.I1042fs）移碼突變患者臨床表現(xiàn)出家族性腺瘤性息肉病的特征，并且其2例一級(jí)親屬及1例二級(jí)親屬均于50歲前診斷出結(jié)直腸癌。4例患者攜帶遺傳性結(jié)直腸癌相關(guān)基因突變，其中1例MLH1（c.2041G＞A：p.Ala681Thr）錯(cuò)義突變?yōu)長(zhǎng)ynch綜合征明確的致病突變［11］；1例MLH3（c.2221G＞T：p.Val741Phe）胚系突變的患者40歲診斷為直腸腺癌，該患者的哥哥存在MLH3相同位點(diǎn)的突變，并且臨床表現(xiàn)為小腸腺鱗癌及肝癌，進(jìn)一步提供家系驗(yàn)證；1例TGFBR2突變（c.C944T：p.T315M）患者41歲診斷為升結(jié)腸中分化腺癌伴黏液腺癌，并且其降結(jié)腸及小腸均發(fā)現(xiàn)腺癌病灶；1例患者檢測(cè)出MSH6（c.C1387T：p.Q463X）的胚系無義突變，且該患者腫瘤組織MSH6蛋白表達(dá)缺失。

全部入組患者滿足的篩選條件及致病突變患者在其中所占的比例，見表2。全部患者中滿足年齡≤50歲且≥1例一級(jí)親屬發(fā)生惡性腫瘤的比例最高（52%），滿足≥2例一級(jí)/二級(jí)親屬發(fā)生惡性腫瘤，其中至少1例是一級(jí)親屬的患者11例（44%），錯(cuò)配修復(fù)蛋白缺失的患者占32%（8/25）。

表1 具有致病性突變患者的臨床特征及突變基因

表2 滿足不同入組標(biāo)準(zhǔn)的全部患者人數(shù)及致病突變患者的比例

3 討論

遺傳性胃腸道腫瘤綜合征是一組非表型特異性的疾病，以家系中個(gè)體腫瘤遺傳易感為特征［12］。近年來，隨著對(duì)腫瘤遺傳綜合征認(rèn)知的進(jìn)步和基因檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步，遺傳性腫瘤的臨床診斷和致病機(jī)理研究也得到了發(fā)展。如遺傳性結(jié)直腸癌分類的細(xì)化及新的致病基因和突變位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)［6，13-15］，以及遺傳性慢性胃癌與CDH1基因突變的關(guān)系及臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)的改進(jìn)等。中國(guó)對(duì)于遺傳性胃腸道腫瘤的研究雖然起步較晚，但是相關(guān)研究也提示國(guó)內(nèi)外遺傳性腫瘤發(fā)生譜不同的可能［16］。最近，Pearlman 等［17］針對(duì)450例早發(fā)結(jié)直腸患者應(yīng)用二代測(cè)序進(jìn)行25個(gè)遺傳相關(guān)基因的篩查，結(jié)果顯示72例患者具有遺傳相關(guān)基因的胚系致病突變。接近16%的高突變率提示二代測(cè)序在遺傳性腫瘤綜合征研究中的應(yīng)用價(jià)值。

由于遺傳性腫瘤綜合征的臨床表現(xiàn)多樣和腫瘤家族史不典型，其臨床診斷與遺傳致病基因不符的情況較為常見，傳統(tǒng)的表型特異性單基因檢測(cè)模式已不適用于當(dāng)前遺傳性消化道腫瘤的診療需求。本研究結(jié)合目前研究相對(duì)成熟的遺傳性彌漫性胃癌及Lynch綜合征［11］的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，以發(fā)病年齡、特殊病理類型、惡性腫瘤家族史等因素作為高危人群的篩選條件，運(yùn)用二代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)42個(gè)腫瘤遺傳相關(guān)基因的全外顯子，發(fā)現(xiàn)24%患者攜帶致病性胚系突變。其中3例分別為具有明確致病性MLH1、APC和MUTYH胚系突變，并且這些突變與患者的臨床病理學(xué)特征相符。另外，1例攜帶MLH3 c.2221G＞T突變患者40歲診斷為直腸腺癌且具有Lynch綜合征相關(guān)惡性腫瘤家族史，雖然該基因突變位點(diǎn)在ClinVar數(shù)據(jù)庫(kù)中顯示致病性有爭(zhēng)議，但患者的一級(jí)親屬（哥哥）臨床診斷小腸腺鱗癌及肝臟神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤，同時(shí)檢測(cè)出MLH3相同位點(diǎn)的突變，提供了家系驗(yàn)證。并且既往研究也報(bào)道了2例攜帶MLH3 c.2221G＞T突變的Lynch相關(guān)腫瘤家系［18-19］，第一個(gè)家系中先證者為1例71歲診斷結(jié)直腸癌的男性患者，2例一級(jí)親屬分別于57歲和61歲診斷為乳腺癌及胃癌，3例患者均存在MLH3 c.2221G＞T突變。第二個(gè)家系先證者為1例子宮內(nèi)膜癌女性患者，本身及2例一級(jí)親屬均存在MLH3 c.2221G＞T突變，且其中1例一級(jí)親屬也診斷為子宮內(nèi)膜癌。1例患者檢測(cè)出TGFBR2胚系突變（c.C944T：p.T315M），既往報(bào)道該突變位點(diǎn)存在于微衛(wèi)星穩(wěn)定的HNPCC家系中［20］。1例腫瘤組織MSH6蛋白表達(dá)缺失的患者，檢測(cè)出MSH6的無義突變。本研究結(jié)果顯示，即使通過比較寬松的條件篩選遺傳性消化道腫瘤的高危患者，其中病理性突變的發(fā)生率仍可達(dá)25%，較以往整體人群5%的比例明顯提高。胚系突變檢出率的提高將有助于對(duì)攜帶者進(jìn)行早期的診斷和調(diào)整相應(yīng)的隨訪監(jiān)測(cè)，從而最終降低該特定人群腫瘤發(fā)生率及死亡率，具有重要的一、二級(jí)預(yù)防價(jià)值。

遺傳性綜合征常具有多種腫瘤易感傾向，如本研究中攜帶MLH1致病突變的患者診斷為胃竇腺癌，臨床特征并不符合“阿姆斯特丹標(biāo)準(zhǔn)”；既往報(bào)道乳腺癌的家系符合遺傳性彌漫型胃癌的基因突變特點(diǎn)，使得針對(duì)單一腫瘤部位的遺傳篩查可能造成偏差及漏診［21］。因此，對(duì)遺傳性腫瘤高危人群篩選時(shí)可考慮不再對(duì)腫瘤原發(fā)部位進(jìn)行嚴(yán)格限定。關(guān)于不同的篩選條件在遺傳性消化道腫瘤中的價(jià)值，研究初步顯示多原發(fā)腫瘤病史、微衛(wèi)星不穩(wěn)定狀態(tài)及惡性腫瘤家族史在篩查遺傳性消化道腫瘤中的權(quán)重較大。攜帶致病突變的患者中，50%患者具有惡性腫瘤家族史，50%患者腫瘤組織錯(cuò)配修復(fù)蛋白表達(dá)缺失。本研究顯示，患者的家族史及腫瘤組織微衛(wèi)星狀態(tài)在遺傳性腫瘤綜合征臨床診斷中具有重要作用。雖然進(jìn)行更嚴(yán)格的年齡限定似乎并未增加遺傳性腫瘤的檢出率，但是攜帶致病性胚系突變的患者發(fā)病年齡均≤50歲，仍符合遺傳性腫瘤綜合征早發(fā)的特點(diǎn)。同樣，進(jìn)行更嚴(yán)格的年齡限定似乎不如綜合患者的年齡、家族史和微衛(wèi)星狀態(tài)更具有臨床價(jià)值。

傳統(tǒng)的表型特異性單基因檢測(cè)模式不再適用于遺傳性腫瘤綜合征的診斷，近些年二代測(cè)序技術(shù)在遺傳病中應(yīng)用的重要性也逐漸突出，尤其是全外顯子測(cè)序或針對(duì)多個(gè)遺傳相關(guān)基因譜的測(cè)序?yàn)檫z傳性消化道腫瘤的診斷和研究提供了大量信息。對(duì)于具有遺傳性腫瘤家系進(jìn)行二代測(cè)序，能夠發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)檢測(cè)方法未發(fā)現(xiàn)和（或）既往尚未報(bào)道的新致病性基因突變［13，22］。同時(shí)，在具有消化道腫瘤遺傳性高危家系中，利用二代測(cè)序?qū)Χ鄠€(gè)相關(guān)遺傳基因檢測(cè)，可發(fā)現(xiàn)部分高危家系存在目前臨床標(biāo)準(zhǔn)無法診斷致病性的遺傳基因突變［23-24］。多基因平臺(tái)的同時(shí)性檢測(cè)，可以降低漏診率，一定程度上解決表型與基因型不一致的情況。如MLH3、TGFBR2與遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌的關(guān)系在本研究中得到了進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究具有樣本量小的局限性，并且檢測(cè)平臺(tái)均對(duì)目前已知的基因進(jìn)行檢測(cè)，并不能發(fā)現(xiàn)新的致病基因。二代測(cè)序面臨的另外一個(gè)問題是檢測(cè)出大量意義未明的基因突變，目前尚缺乏統(tǒng)一的方法明確其意義。如何正確地解讀這些數(shù)據(jù)，需要多專業(yè)的交叉合作。綜上所述，通過高危因素的篩查，富集遺傳性消化道腫瘤的高危人群，進(jìn)行多基因平臺(tái)的同時(shí)性檢測(cè)具有明確的臨床意義及良好的應(yīng)用前景。

致謝：感謝領(lǐng)星生物科技有限公司提供技術(shù)支持，對(duì)本研究中的患者進(jìn)行全外顯子組高通量測(cè)序及相關(guān)基因分析。