小鼠子宮內(nèi)膜干細(xì)胞損傷修復(fù)調(diào)控機(jī)制的研究

葉國柳 靳麗杰 王玲玲 周玉

（蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科 安徽 蚌埠 233004）

1.引言

人類子宮內(nèi)膜是一種高度再生組織，一個生育年齡婦女的子宮內(nèi)膜要經(jīng)歷超過400個周期以上的增長，分化，和脫落。子宮內(nèi)膜炎，子宮內(nèi)膜結(jié)核等婦科疾病以及宮腔手術(shù)都可能導(dǎo)致子宮內(nèi)膜損傷，從而引起繼發(fā)性閉經(jīng)、不孕、習(xí)慣性流產(chǎn)等疾病。近年來宮腔鏡的廣泛應(yīng)用使子宮內(nèi)膜疾病的診斷及療效更具針對性，但是對于子宮內(nèi)膜修復(fù)障礙的治療方法仍舊十分有限。近年來，國內(nèi)外的學(xué)者從子宮內(nèi)膜中分離出基質(zhì)和上皮兩種類型的干細(xì)胞，而子宮內(nèi)膜上皮在月經(jīng)中脫落后的再生有可能是間充質(zhì)干細(xì)胞增殖分化的結(jié)果?？傊?，子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的相關(guān)研究，為子宮內(nèi)膜損傷修復(fù)的細(xì)胞療法提供了理論依據(jù)，但對于子宮內(nèi)膜干細(xì)胞分化調(diào)控機(jī)制需要進(jìn)一步的研究。

2.材料與方法

2.1 材料

10～14周齡Wistar雌鼠(220～250g），中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供)20只；40mg/kg 戊巴比妥(Sigma)；SP免疫組織化學(xué)超敏試劑盒、DAB顯色劑、多聚賴氨酸（上海生工）；辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗（1∶2000稀釋），羊抗鼠單克隆抗體Wnt-1（1∶100稀釋），兔抗鼠單克隆抗體β-Catenin（1∶200稀釋，碧云天）；PVDF膜（Takara）

2.2 方法

2.2.1 確證Wnt/β-catenin信號通路存在于子宮內(nèi)膜損傷修復(fù)中并起著重要作用 本部分實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用Wnt/β-catenin信號通路轉(zhuǎn)基因報告鼠（BAT-gal 小鼠）進(jìn)行研究，用100°熱水導(dǎo)管損傷小鼠Y型子宮一側(cè)宮角，在損傷后6h、8h、7d、14d進(jìn)行取材制作小鼠子宮內(nèi)膜損傷模型，與正常小鼠比較通過對子宮內(nèi)膜進(jìn)行組織切片及X-gal染色，了解Wnt信號在小鼠子宮內(nèi)膜的分布和表達(dá)的變化。

2.2.2 分離純化小鼠子宮內(nèi)膜邊緣（SP）群干/祖細(xì)胞；觀察它們移植到小鼠損傷子宮內(nèi)膜后的存活和遷移。

利用MEF作為飼養(yǎng)層培養(yǎng)EGFP+SP細(xì)胞，急性損傷后移植一定量未分化的GFP+小鼠邊緣（SP）群干/祖細(xì)胞至內(nèi)膜損傷小鼠宮腔內(nèi)，14天后取子宮，直接熒光顯微鏡觀察和HE染色后及抗GFP蛋白抗體免疫組化染色后顯微鏡下觀察小鼠邊緣（SP）群干/祖細(xì)胞的存活和遷徙情況。

2.2.3 本部分研究旨在了解Wnt-7a和SFRP-2 對小鼠子宮內(nèi)膜損傷模型中經(jīng)典Wnt信號通路的關(guān)鍵蛋白和下游靶基因的表達(dá)水平的影響。

用western blot方法檢測各組小鼠子宮內(nèi)膜損傷模型β-catenin、GSK3b、Apc、c-myc的表達(dá)水平；采用BCA蛋白測定試劑盒對蛋白進(jìn)行定量，聚丙烯酰胺SDS凝膠電泳后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉后加入一抗，4℃搖動過夜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，加入化學(xué)發(fā)光劑，X線片顯影、定影，用圖像分析儀測定各條帶的吸光度值作定量分析，同時檢測B一肌動蛋白表達(dá)，確保各組蛋白上樣量相等

2.2.4 統(tǒng)計學(xué)分析 使用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，Western blotting 灰度值利用ANOVA法中的多重比較判斷組間差異（設(shè)定P＜0.05）。

3.結(jié)果

3.1 Wnt/β-catenin信號通路轉(zhuǎn)基因報告鼠（BAT-gal 小鼠）建立小鼠子宮內(nèi)膜損傷模型；通過特殊的X-gal染色確證Wnt/β-catenin信號通路存在于子宮內(nèi)膜損傷修復(fù)中并起著重要作用。

3.2 通過直接熒光顯微鏡觀察和免疫組化染色后顯微鏡下觀察,證實(shí)產(chǎn)后小鼠子宮內(nèi)膜邊緣（SP）群干/祖細(xì)胞分離純化并進(jìn)行培養(yǎng)后移植到損傷的宮腔內(nèi)，能在宮腔內(nèi)存活和遷移并且對損傷內(nèi)膜組織發(fā)揮修復(fù)作用

圖2 Wnt-l免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果

3.3 western blot和QPCR等方法檢測來證實(shí)Wnt信號通路激動劑Wnt-7a和阻斷劑SFRP-2后Wnt信號通路的調(diào)節(jié)變化。證實(shí)Wnt/β-catenin信號通路在（SP）群干/祖細(xì)胞修復(fù)損傷子宮內(nèi)膜中的調(diào)節(jié)作用。

圖3 Wnt-1與β-catenin蛋白印跡免疫分析

4.討論

子宮內(nèi)膜干/祖細(xì)胞再生人類子宮內(nèi)膜的能力,已在異種移植模型中被證明。把人子宮內(nèi)膜上皮和間質(zhì)單細(xì)胞懸液移植到免疫功能嚴(yán)重低下，缺乏T，B和NK細(xì)胞的NOG小鼠腎包膜下方，產(chǎn)生了包含有子宮內(nèi)膜和子宮肌層的子宮組織。再生子宮內(nèi)膜移植到去卵巢NOG小鼠，生成了角蛋白+CD9+腺體結(jié)構(gòu)，CD10+CD13+基質(zhì)和α-平滑肌細(xì)胞（αSMA）陽性的肌樣組織。異種移植的子宮內(nèi)膜隨著雌激素和孕激素的周期循環(huán)而變化，類似人的月經(jīng)周期。新鮮分離的SP細(xì)胞主要構(gòu)建血管和遷移ERβ，表達(dá)血管內(nèi)皮細(xì)胞（80%）。13%基質(zhì)和8%腺體分別由移植的SP細(xì)胞產(chǎn)生。當(dāng)移植到免疫功能低下小鼠中，克隆的人子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和間質(zhì)SP細(xì)胞也產(chǎn)生了子宮內(nèi)膜組織。這些移植產(chǎn)物免疫組化染色顯示基質(zhì)（波形蛋白+）與上皮（CD9+），但不是內(nèi)皮細(xì)胞（CD31+）。有組織的子宮內(nèi)膜腺體不容易區(qū)分，這可能是由于長期的SP細(xì)胞克隆培養(yǎng)。再生的子宮內(nèi)膜組織沒有表達(dá)ER，但一些細(xì)胞表達(dá)PR。這些研究表明，具有干/祖細(xì)胞活性的子宮內(nèi)膜細(xì)胞亞群可以在體內(nèi)產(chǎn)生子宮內(nèi)膜組織。這些亞群還可能誘發(fā)子宮內(nèi)膜異位病灶的生長。

小鼠是一個公認(rèn)的研究子宮內(nèi)膜功能的動物模型。在人類胎兒期子宮腺體發(fā)育，但在嚙齒類動物中腺體發(fā)育在出生后，這對于在子宮內(nèi)膜腺體發(fā)育過程中研究子宮內(nèi)膜干/祖細(xì)胞是一個絕對的優(yōu)勢。幾種小鼠模型已經(jīng)被建立,用來研究子宮內(nèi)膜再生和類似月經(jīng)后的子宮內(nèi)膜修復(fù)。Wnt/β-catenin信號通路是調(diào)控細(xì)胞生長和增殖的關(guān)鍵途徑，激活靶基因。該通路的核心是胞質(zhì)內(nèi)β-catenin穩(wěn)定，當(dāng)β-catenin水平低下時，Wnt通路關(guān)閉；反之，Wnt通路開啟。人類子宮內(nèi)膜也特征性表達(dá)Wnt信號蛋白，并受雌、孕激素調(diào)節(jié)，參與子宮內(nèi)膜的發(fā)育、分化和胚胎著床等生理過程。

子宮內(nèi)膜損傷后干細(xì)胞的修復(fù)和因損傷或其他嚴(yán)重疾病而切除組織或器官的干細(xì)胞替代是眾多婦產(chǎn)科及干細(xì)胞研究者關(guān)注的焦點(diǎn)。目前已經(jīng)證實(shí)成人干細(xì)胞存在于子宮內(nèi)膜并且它們可以在體內(nèi)重建內(nèi)膜組織，以及Wnt信號相關(guān)分子在子宮內(nèi)膜生長中起著重要作用等。本研究項(xiàng)目利用Wnt/β-catenin信號通路轉(zhuǎn)基因報告鼠（BAT-gal小鼠）建立子宮內(nèi)膜損傷模型，了解Wnt信號分布和表達(dá)的變化；并把分離純化小鼠子宮內(nèi)膜邊緣群干/祖細(xì)胞移植到損傷的小鼠子宮中,通過對經(jīng)典Wnt信號通路的干涉，觀察其對子宮內(nèi)膜損傷后修復(fù)的影響，探討Wnt信號在子宮內(nèi)膜干細(xì)胞修復(fù)中的作用，為子宮內(nèi)膜損傷修復(fù)障礙及其引發(fā)疾病的干細(xì)胞治療方法提供新的研究思路。