多指標(biāo)綜合評(píng)分法優(yōu)化十味鵝黃顆粒的水提工藝

羅宇東 朱智德 譚安薔 陸施衡 李芳嬋

[摘要]目的 研究十味鵝黃顆粒水提工藝的優(yōu)化及質(zhì)量控制。方法 以十味鵝黃顆粒水提液中黃芪甲苷、木蘭脂素、柴胡皂苷A、總浸出物含量為指標(biāo)并進(jìn)行綜合評(píng)分，應(yīng)用正交設(shè)計(jì)，考查加水量、水提取次數(shù)、煎煮時(shí)間三個(gè)因素對(duì)產(chǎn)品水提工藝的影響，確定十味鵝黃顆粒的最佳水提取工藝。結(jié)果 十味鵝黃顆粒的最佳水提取工藝為藥材加14倍量水，煎煮3次，每次1 h。按該工藝提取的干膏中黃芪甲苷、柴胡皂苷A及木蘭脂素的平均含量分別為5.78、1.78和3.30 mg/g，RSD為1.56%、2.77%、0.61%（n=3）。結(jié)論 優(yōu)化的十味鵝黃顆粒水提工藝，重現(xiàn)性好，質(zhì)量穩(wěn)定，適合大生產(chǎn)，因此該水提工藝是合理可行的。

[關(guān)鍵詞]十味鵝黃顆粒；水提??；多指標(biāo)；綜合評(píng)分法

[中圖分類號(hào)] R284.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2018）8（b）-0004-04

Optimization of water extraction technology of Shiwei Ehuang Granules by multi-index comprehensive evaluation method

LUO Yu-dong1，3 ZHU Zhi-de2 TAN An-qiang1 LU Shi-heng1 LI Fang-chan2

1. Department of Research and Development， Pharmaceutical Factory of Guangxi University of Traditional Chinese Medicine， Guangxi Zhuang Autonomous Region， Nanning 530023， China； 2. College of Pharmacy， Guangxi University of Traditional Chinese Medicine， Guangxi Zhuang Autonomous Region， Nanning 530001， China； 3. Key Laboratory of Basic and Applied Research of Zhuang Medicine in Guangxi University， Guangxi Zhuang Autonomous Region， Nanning 530001， China

[Abstract] Objective To study the optimization and quality control of water extraction process of Shiwei Ehuang Granules. Methods Astragaloside A， Magnolin， Saikosaponin A and total extract of Shiwei Ehuang Granules were taken as the indexes and comprehensive evaluation. The orthogonal design was applied to investigate the effect of water addition， water extraction times and boiling time on the product water extraction process， and to determine the optimal water extraction process for Shiwei Ehuang Granules. Results The optimum water extraction process of Shiwei Ehuang Granules was to add 14 times the amount of water to the medicinal materials， and decoct three times for 1 h each time. The average content of Astragaloside A， Saikosaponin A， and Magnolia extracted from dry paste extracted by this process was respectively 5.78， 1.78 and 3.30 mg/g， and RSD was 1.56%， 2.77% and 0.61% （n=3）. Conclusion The optimized water extraction process of Shiwei Ehuang Granules has good reproducibility and stable quality， and is suitable for mass production. Therefore， the water extraction process is reasonable and feasible.

[Key words] Shiwei Ehuang Granules； Water extraction； Multi index； Comprehensive grading methods

過敏性鼻炎（allergic rhinitis，AR）為常見病、多發(fā)病，分為季節(jié)性及常年性發(fā)作兩種類型，隨著社會(huì)環(huán)境條件的惡化，該病的發(fā)生率呈逐年上升的趨勢(shì)。祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為過敏性鼻炎屬“鼻鼽”的范疇，應(yīng)用“辨證施治”及“治未病”等理論，中醫(yī)藥或少數(shù)民族醫(yī)藥治療AR具有療效確切、復(fù)發(fā)率低、毒副作用小等優(yōu)勢(shì)，研發(fā)治療AR的中藥或民族藥產(chǎn)品有很好的市場(chǎng)前景[1-9]。十味鵝黃顆粒為廣西中醫(yī)藥大學(xué)制藥廠擬開發(fā)的治療過敏性鼻炎的復(fù)方壯藥制劑，產(chǎn)品在民間治療過敏性鼻炎驗(yàn)方的基礎(chǔ)上，按中醫(yī)藥君臣佐使理論組方。方中，鵝不食草、黃芪、白術(shù)益氣固表、通鼻止喘為君藥；防風(fēng)、柴胡、白芷、辛夷祛風(fēng)散寒、宣通鼻竅為臣藥；廣藿香、丹皮、烏梅活血祛瘀、涼血止癢、收斂止涕為佐藥。諸藥合用，共奏益氣疏風(fēng)、利竅通鼻之功效，用于脾肺氣不足，外感風(fēng)寒之鼻鼽病。

現(xiàn)代研究表明，十味鵝黃顆粒方中的君藥黃芪對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)、心腦血管系統(tǒng)具有明顯的療效，黃芪甲苷為黃芪的主要有效成分[10-13]；臣藥辛夷臨床中普遍用于治療各種鼻炎，柴胡具有抗內(nèi)毒素作用、免疫調(diào)節(jié)功能、抗過敏、抗細(xì)胞黏附等藥理作用。辛夷和柴胡的主要指標(biāo)成分分別為木蘭脂素、柴胡皂苷A[14-20]。本研究綜合考慮中藥多指標(biāo)、多成分、多靶點(diǎn)發(fā)揮作用的特點(diǎn)，以十味鵝黃顆粒水提液中黃芪甲苷、木蘭脂素、柴胡皂苷A、總浸出物含量為代表性指標(biāo)并進(jìn)行多指標(biāo)綜合評(píng)分，應(yīng)用正交試驗(yàn)，對(duì)十味鵝黃顆粒水提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，為產(chǎn)品的注冊(cè)申報(bào)及規(guī)?；a(chǎn)提供依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1儀器與試藥

1.1儀器

1260型高效液相色譜儀（Agilent公司）；3300-ELSD型蒸發(fā)光散色檢測(cè)器（Alltech公司）；SQP型十萬分之一電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；KQ5200型超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；L600型和TGL-16G型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.2試藥

黃芪甲苷對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究所，110781-200613）；木蘭脂素對(duì)照品（上海源葉生物公司，R02J7F15582）；柴胡皂苷A（上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司，E3170010）。鵝不食草為菊科植物鵝不食草Centipeda minima （L.） A. Br. et Aschers.的干燥全草；白術(shù)為菊科植物白術(shù)Atractylodes macrocephala Koidz.的干燥根莖；白芷為傘形科植物白芷Angelica dahurica （Fisch. Ex Hoffm.） Benth. et Hook. f.的干燥根；防風(fēng)為傘形科植物防風(fēng)Saposhnikovia divaricata （Turcz.） Schischk.的干燥根；廣藿香為唇形科植物廣藿香Pogostemon cablin （Blanco） Benth.的干燥地上部分；丹皮為毛茛科植物牡丹Paeonia suffruticosa Andr.的干燥根皮；烏梅為薔薇科植物梅Prunus mume（Sieb.） Sieb. Et Zucc.的干燥近成熟果實(shí)。各藥材均購自南寧市友和古城大藥房，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)制藥廠質(zhì)量保證部檢驗(yàn)合格。乙腈（色譜純，F(xiàn)isher公司）；超純水由密思博超純水機(jī)制備；氨水、正丁醇、甲醇（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

2方法與結(jié)果

2.1 L9（34）正交試驗(yàn)因素水平的確定

十味鵝黃顆粒臨床研究以水為提取溶劑，采用傳統(tǒng)“湯劑”的形式，臨床藥效肯定，而且用水提取成本低廉，故產(chǎn)品提取工藝尊重臨床療效，采用水提的方式。影響水提取效果的主要因素為：①煎煮次數(shù)A；②煎煮時(shí)間B；③加水量C；④破碎度D。以上因素在三個(gè)水平上，進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化，經(jīng)水提預(yù)試后，采用L9（34）正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)（表1）。

2.2考察指標(biāo)的確定及評(píng)價(jià)方法

2.2.1水提工藝正交試驗(yàn)的評(píng)價(jià) 本品方中君藥黃芪中黃芪甲苷、臣藥辛夷中木蘭脂素、柴胡中柴胡皂苷A的含量高低，與本品的有效性密切相關(guān)，另外，總浸出物可以綜合衡量處方中其他藥材成分的含量。因此，確定用十味鵝黃顆粒水提液中黃芪甲苷、木蘭脂素、柴胡皂苷A、總浸出物含量作為代表性指標(biāo)，評(píng)價(jià)水提工藝的優(yōu)劣。

2.2.2考查方法 以產(chǎn)品水提液中黃芪甲苷最高含量為40分，計(jì)算每個(gè)樣品的相對(duì)得分；水提液中木蘭脂素、柴胡皂苷A、總浸出物的最高得量均為20分，計(jì)算每個(gè)樣品的相對(duì)得分；以上四項(xiàng)得分相加，即為每個(gè)樣品的綜合評(píng)分。

2.3水提取液樣品的制備

依據(jù)處方藥材量，按正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)表安排試驗(yàn)，合并煎液，混勻，濾過，濾液濃縮后定容至1000 ml，作為供試液。

2.4總浸出物的測(cè)定

精密量取供試液100 ml，置于已經(jīng)105℃干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，80℃減壓干燥至恒重，稱定重量，計(jì)算干膏量。

2.5水提液中黃芪甲苷、木蘭脂素、柴胡皂苷A含量的測(cè)定

根據(jù)課題組前期采用HPLC-ELSD法，同時(shí)測(cè)定十味鵝黃顆粒中黃芪甲苷、柴胡皂苷A及木蘭脂素的含量。

2.5.1色譜條件 依據(jù)2015年版《中國藥典》高效液相色譜法，色譜柱：美國安捷倫公司ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水，梯度洗脫（表2）；流速：1 ml/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μl；Alltech3300-ELSD型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器參數(shù)（漂移管溫度：80℃，氣體流量：2.5 L/min，增益值：4.0）。

2.5.2對(duì)照品溶液的制備 分別取黃芪甲苷、柴胡皂苷A及木蘭脂素適量，精密稱定，用甲醇溶解配制成質(zhì)量濃度分別2.20、2.12、3.24 mg/ml的對(duì)照品溶液。分別吸取上述溶液適量定容至同一容量瓶中，加甲醇稀釋制備成含黃芪甲苷、柴胡皂苷A及木蘭脂素濃度分別為0.816、0.191、0.518 mg/ml的混合對(duì)照品溶液。

2.5.3供試品溶液的制備及測(cè)定 稱取“2.4方法”制備的十味鵝黃顆粒水提液干浸膏2 g，精密稱定，精密加入25 ml 10%氨水，回流30 min，以6000 r/min離心10 min，取上清液；回流提取2次。殘?jiān)尤? ml 10%氨水洗滌2次，離心。合并上清液，用水飽和正丁醇萃取2次，第1次加100 ml，第2次加50 ml，合并正丁醇液，于水浴鍋上蒸干，殘?jiān)眉状既芙?，移? ml容量瓶，定容，搖勻，以13 000 r/min離心10 min，上清液即為供試品溶液。供試品溶液按“2.5.1方法”測(cè)定各有效成分的含量。

2.6試驗(yàn)結(jié)果

分析正交試驗(yàn)結(jié)果表明，各因素對(duì)提取效率的影響依次為：煎煮次數(shù)>加水量>破碎度>煎煮時(shí)間，提取工藝的最佳水平組合為A3B1C3D2（表3）。方差分析結(jié)果可知，煎煮次數(shù)與加水量對(duì)提取總體有顯著性影響，而煎煮時(shí)間與破碎度對(duì)提取影響無差異性（表4）。因此，從提高工效考慮，確定水提工藝為藥材加水14倍，煎煮3次，每次1 h。

F0.01（2，2）=99.0，F(xiàn)0.05（2，2）=19.0

2.7正交優(yōu)化結(jié)果驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為驗(yàn)證正交優(yōu)化工藝的可行性及穩(wěn)定性，按上述水提優(yōu)化工藝重復(fù)3次，所得清膏干燥后測(cè)定黃芪甲苷、柴胡皂苷A及木蘭脂素含量，計(jì)算干膏得率。結(jié)果表明，優(yōu)化的水提工藝可將藥材的有效成分基本提取完全，且重復(fù)性好，具有可操作性（表5）。

3討論

本研究前期建立了采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)（HPLC-ELSD）法同時(shí)測(cè)定十味鵝黃顆粒中黃芪甲苷、柴胡皂苷A及木蘭脂素含量的方法，并進(jìn)行了方法學(xué)考察。結(jié)果提示，黃芪甲苷、柴胡皂苷A及木蘭脂素分別在0.0816～0.816、0.0191～0.191、0.0518～0.5184 mg/ml范圍內(nèi)，其峰面積的自然對(duì)數(shù)與進(jìn)樣量的自然對(duì)數(shù)成良好的線性關(guān)系（r=0.995、0.9935、0.9942），平均加樣回收率分別為101.5%，100.9%和101.5%，RSD為0.51%、0.56%、0.34%（n=6）。色譜條件選擇時(shí)，分別對(duì)甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水溶液流動(dòng)相，以及對(duì)柱溫、蒸發(fā)光檢測(cè)器參數(shù)（溫度、氣體流量、增益值）等色譜條件進(jìn)行考察，結(jié)果提示，采用乙腈-水為流動(dòng)相，柱溫30℃，蒸發(fā)光參數(shù)為溫度80℃，氣體流量為2.5 L/min，增益值4.0，得到的色譜圖較好。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，本法簡便快速、重復(fù)性好，結(jié)果準(zhǔn)確，可作為十味鵝黃顆粒產(chǎn)品及生產(chǎn)過程中的質(zhì)量控制方法，從而達(dá)到較好地控制產(chǎn)品質(zhì)量的目的。

本研究制劑處方中，黃芪為君藥，辛夷和柴胡為臣藥，黃芪甲苷、柴胡皂苷A及木蘭脂素分別為黃芪、柴胡和辛夷的主要有效成分。本研究依據(jù)處方“君臣佐使”的配伍原則，兼顧中藥多成份、多靶點(diǎn)作用的特點(diǎn)，采用正交設(shè)計(jì)結(jié)合多指標(biāo)綜合評(píng)分法，以制劑水提液中黃芪甲苷、柴胡皂苷A及木蘭脂素的含量及總浸出物為考察指標(biāo)，優(yōu)選產(chǎn)品的水提工藝，并經(jīng)工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)提示，藥材加14倍量水，煎煮3次，每次1 h為最佳水提工藝，按此工藝提取生產(chǎn)的產(chǎn)品，干膏中黃芪甲苷、柴胡皂苷A及木蘭脂素平均含量分別為5.78、1.78、3.30 mg/g，RSD為1.56%、2.77%、0.61%（n=3）；該水提工藝重現(xiàn)性好，質(zhì)量穩(wěn)定、可控，適合大生產(chǎn)使用；本工藝的優(yōu)選試驗(yàn)，為產(chǎn)品后續(xù)的中試研究、穩(wěn)定性試驗(yàn)及藥理藥效學(xué)研究提供了理論基礎(chǔ)。另外，本試驗(yàn)結(jié)果提示，產(chǎn)品按水提工藝處理后，干膏得率約22%，使得單劑藥量偏大，患者服用不方便，并可能導(dǎo)致成品顆粒吸濕性大，影響產(chǎn)品穩(wěn)定性。為減少單劑服用藥量，下一步研究將采用水煎煮得到的清膏經(jīng)乙醇沉淀除去雜質(zhì)的方法，降低干膏得率，并考察醇沉工藝對(duì)產(chǎn)品中有效成分含量的影響，以便篩選適合大生產(chǎn)的醇沉工藝參數(shù)。

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（收稿日期：2018-04-03 本文編輯：孟慶卿）