一種次氯酸根離子熒光探針的合成及熒光性能研究*

金洗郎，解 璞，師 歡，周宏偉，陳衛(wèi)星

(西安工業(yè)大學(xué) 材料與化工學(xué)院，西安 710021)

次氯酸鹽作為世界上最早的殺菌劑，殺菌譜廣，合成工藝簡單，價格低廉、毒性低，在防止感染方面具有重要的作用，因而被廣泛應(yīng)用[1].然而，一旦次氯酸的使用濃度超過一定水平，高濃度的次氯酸鹽溶液就會成為一種潛在的污染物，危害動植物甚至人類[2].而生物體內(nèi)源性次氯酸主要是通過單核巨噬細(xì)胞與中性粒細(xì)胞中的髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO) 催化產(chǎn)生，可以自由穿過細(xì)胞膜，在機(jī)體免疫系統(tǒng)起著重要的作用[3].HClO能夠滲入病毒體與細(xì)菌體內(nèi)，與蛋白質(zhì)、核酸等發(fā)生氧化反應(yīng)進(jìn)而起到殺死病原微生物的作用.但是，如果出現(xiàn)MPO酶催化產(chǎn)生的HClO過量，超過局部抗氧化劑的所需量，將導(dǎo)致氧化過激甚至氧化性細(xì)胞損傷.經(jīng)證實，過量HClO 引起的氧化過激會導(dǎo)致白血病、腎炎、腫瘤和動脈粥樣硬化疾病等[4].

基于HClO在病理及生理過程中的重要作用，發(fā)展高性能的檢測HClO的方法，能夠為進(jìn)一步研究其在生物學(xué)過程中的細(xì)胞和分子事件提供探測工具，為疾病的發(fā)病機(jī)制、診斷及干預(yù)的研究提供可靠信息，具有重要意義[5-8].針對這種情況，大量的檢測方法，如比色法、熒光法、電化學(xué)法和色譜法等被大量設(shè)計，但是幾乎所有的這些方法都還沒有被真正用于生物學(xué)體系中的次氯酸檢測[9].相反，基于各種成像方法基礎(chǔ)上的熒光成像由于具有其靈敏、快捷、良好的實時性而備受越來越多的科研工作者的關(guān)注[10-11].文中以熒光素為母體，采用鄰甲氧基苯甲醛進(jìn)行修飾，兩步法合成目標(biāo)探針，利用OCl-的氧化性，實現(xiàn)熒光性能的“OFF-ON”的轉(zhuǎn)變，可用于環(huán)境和生物體內(nèi)OCl-的熒光分析檢測.

1 實驗材料及表征

1.1 實驗原料

熒光素、水合肼、鄰甲氧基苯甲醛購自薩恩化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司.氫氧化鈉、無水乙醇和二氯甲烷購自天津市富宇精細(xì)化工有限公司.實驗所用去離子水全部自制.

1.2 測試表征

核磁共振氫譜(1H NMR)和碳譜(13C NMR)采用Varian INOVA-400 MHz 核磁共振波譜儀測試，溶劑為氘代二甲基亞砜(DMSO)，溫度室溫；熒光光譜采用日本日立F-4500熒光光譜儀分析，發(fā)射波長和激發(fā)波長狹縫均設(shè)置為5.0 nm；質(zhì)譜采用Bruker microTOF-QⅡ ESI-Q-TOF LC/MS/MS 飛行時間質(zhì)譜測試；pH值采用pHs-3C精密 pH計分析，X-4型數(shù)字顯微熔點儀(北京泰克儀器有限公司).

1.3 實驗步驟

中間體2的合成:在250 mL 圓底燒瓶中加入6.00 g 熒光素，60 mL無水乙醇使其溶解，緩慢滴加8.0 mL水合肼，約30 min加完.加熱至80 ℃ 回流12 h，反應(yīng)完畢后，冷卻至室溫，減壓蒸除溶劑.加入500 mL 水，調(diào)節(jié)pH至4～5左右.再用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至pH=9，有大量淡黃色固體析出.抽濾，用水洗滌固體數(shù)次，干燥，得白色固體5.10 g.產(chǎn)率為81.56%.熔點：262～264 ℃.

探針1的合成:探針1的合成路線圖如圖1所示.在100 mL 圓底燒瓶中加入熒光素肼(10 mmol,3.46 g)，50 mL無水乙醇，攪拌下，滴加溶有2-鄰甲氧基苯甲醛(15 mmol,2.04 g)的乙醇溶液，約10 min滴加完畢，加熱回流8 h.TLC (薄層色譜法)檢測反應(yīng)完畢，將反應(yīng)液冷卻至室溫，析出大量固體，抽濾，用少量無水乙醇洗滌數(shù)次，取固體，乙醇重結(jié)晶，得到淺黃色固體3.81 g.產(chǎn)率：82.11%.

圖1 探針1的合成路線圖

1H NMR(DMSO-d6,400 MHz):δ(ppm) 3.74(s,3H),4.38(s,1H),6.47(m,4H),6.65(d,1.9 Hz,2H),6.91(d,7.5 Hz,1H),6.99(d,8.4 Hz,1H),7.12(d,7.5 Hz,1H),7.34(s,1H),7.44(d,7.7 Hz,1H),7.61(m,2H),7.91(d,7.1 Hz,1H),9.19(s,1H),9.92(s,1H).13C NMR(DMSO-d6,101 MHz):δ(ppm) 57.24,66.32,103.6,111.2,113.1,113.5,121.9,123.7,124.3,125.0,125.8,129.3,130.2,130.3,133.1,135.2,145.2,151.9,153.3,158.9,159.8,164.8.MS(ESI) m/z = 487.128 5[M+Na]+,calc.for C28H20N2NaO5+= 487.126 4.

熒光探針溶液制備和檢測:稱取一定量的探針1溶于乙腈中，制成濃度為1 000 μmol·L-1的貯備液，4 ℃冷藏保存，使用時根據(jù)需要適當(dāng)稀釋.常用陰離子標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取一定量的鈉鹽或鉀鹽溶于水中，制成濃度為2 000 μmol·L-1的貯備液，使用時根據(jù)需要適當(dāng)稀釋.實驗用水均為二次蒸餾水，所用試劑均為分析純.

2 結(jié)果與討論

2.1 探針對OCl-的熒光滴定

圖2為OCl-滴定探針1的熒光光譜.從滴定測試的結(jié)果可以看出，由于熒光素母體內(nèi)酯式結(jié)構(gòu)的存在，探針本身幾乎沒有熒光.當(dāng)固定探針1的濃度為5 μmol·L-1時，隨著OCl-的加入，熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，當(dāng)OCl-濃度(OCR)大于20 μmol·L-1時，熒光強(qiáng)度基本飽和.

圖2 探針對OCl-的熒光滴定關(guān)系Fig.2 The fluorescence titration relationship between probe 1 and OCl-

圖3為發(fā)射波長為534 nm處，探針1在OCl-濃度為0～20 μmol·L-1的熒光強(qiáng)度關(guān)系圖.可以得出，該探針在OCl-濃度為0～20 μmol·L-1時，具有很好的線性關(guān)系，其線性方程為：y=45.16x-4.506(線性度R2=0.998).因此，該探針可用于OCl-濃度的定量檢測.

2.2 探針對離子的選擇性識別

探針的專一性識別是探針性能是否優(yōu)異的重要評價標(biāo)準(zhǔn).圖4為不同干擾物質(zhì)對探針的熒光強(qiáng)度影響圖，固定探針濃度為5 μmol·L-1，加入干擾物質(zhì)為1:Cl-;2:SO42-;3:PO43-;4:CO32-;5:CH3COO-;6:SCN-;7:SO32-;8:ClO3-;9:ClO4-;10:IO3-;11:NO2-;12:NO3-;13:tBuOOH;14:·OH;15:H2O2;16:O2-;17:NO;18:blank.黑色條為探針對各種離子的響應(yīng)情況，紅色條為在OCl-存在條件下，探針對各種離子的響應(yīng)情況.從圖4中可以看出，除了NO有輕微的響應(yīng)外，其他離子的加入均無響應(yīng).在其他干擾物質(zhì)存在的條件下，對探針檢測OCl-的數(shù)值未產(chǎn)生較大影響.說明該探針對OCl-的檢測具有很好的專一性.

圖3 熒光強(qiáng)度與OCl-濃度之間的線性關(guān)系Fig.3 The linear relationship between the fluorescence intensity and concentration of OCl-

圖4 探針中加入OCl-和共存離子的熒光變化

2.3 pH值對熒光光譜的影響

為了考察該探針實際應(yīng)用中的酸堿性環(huán)境對探針的影響，本文對探針1熒光值與pH的關(guān)系進(jìn)行研究.如圖5所示，當(dāng)不添加OCl-時，探針對pH的響應(yīng)非常弱，但隨著OCl-的加入，在pH=6.6～8.6下熒光強(qiáng)度達(dá)到最大，且變化較小.因此，該類探針能夠應(yīng)用于pH=6.6～8.6的體系中.

圖5 pH值對探針的影響Fig.5 Influence of pH on the probe

2.4 反應(yīng)時間的影響

為了探究探針的實時檢測性能，固定探針濃度為5 μmol·L-1，OCl-的濃度為20 μmol·L-1，對其不同時間下的熒光性能進(jìn)行檢測，從圖6可以看出，熒光強(qiáng)度急劇增大，在8 min后，幾乎達(dá)到最大值.說明該探針具有對OCl-實時監(jiān)測的特點.

圖6 反應(yīng)時間對熒光強(qiáng)度的影響Fig.6 Influence of reaction time on the fluorescence intensity of the probe with OCl-

3 結(jié) 論

文中以熒光素為母體，通過兩步法反應(yīng)設(shè)計合成了一種可用于檢測OCl-的熒光探針，并采用核磁共振(氫譜、碳譜)、質(zhì)譜對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征.通過熒光滴定(線性關(guān)系曲線為y=45.16x-4.506)、熒光時間響應(yīng)(8 min)、離子干擾和pH響應(yīng)(pH=6.6～8.6)等方面對其熒光性能進(jìn)行檢測.結(jié)果顯示該探針可實現(xiàn)對OCl-高選擇性和高靈敏度的檢測.