左卡尼汀對(duì)糖尿病腎病大鼠的腎臟保護(hù)機(jī)制研究*

夏天皓， 金吉哲， 鄭海蘭， 樸尚國(guó)， 李錦姬， 李 燦

(延邊大學(xué)附屬醫(yī)院腎病學(xué)科， 吉林 延吉 133000)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是導(dǎo)致終末期腎臟病(end-stage renal disease，ESRD)的重要原因。臨床上盡管嚴(yán)格控制DM患者的血糖和代謝異常，但由于DM步入ESRD的患者比例仍高達(dá)40%[1-2]。糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是DM最常見且嚴(yán)重的一種微血管并發(fā)癥，需昂貴的腎臟替代治療維持生命，如透析和腎移植。因此，減少DN的發(fā)生不僅能改善DM患者的生活質(zhì)量，亦可降低整個(gè)社會(huì)的負(fù)擔(dān)。DN以腎小球炎癥反應(yīng)、系膜細(xì)胞增生和進(jìn)行性腎小球硬化為典型的病理改變，最終導(dǎo)致蛋白尿和腎功能衰竭[3]。DN的發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜，由多種因素相互作用所致，其中包括炎癥介質(zhì)、致纖因子、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡等[4-5]。

左卡尼汀(L-carnitine，LC)是一種季銨鹽化合物，是長(zhǎng)鏈脂肪酸進(jìn)入線粒體基質(zhì)內(nèi)被氧化分解、為周圍組織提供能量的重要鋪助因子之一。LC可抑制氧自由基的產(chǎn)生，防止線粒體內(nèi)脂肪酸β氧化損傷，修復(fù)組織氧化的脂質(zhì)代謝[6]。有文獻(xiàn)證實(shí)LC是清除氧自由基和 H2O2的清道夫[7-8]。由于LC具有抗氧化屬性，常被用來防治胰島素抵抗、糖尿病足細(xì)胞損傷及糖尿病所致血管內(nèi)皮功能障礙[9-11]。我們?cè)鴪?bào)道LC可防治環(huán)孢素A導(dǎo)致的大鼠胰腺和腎臟損傷[12]，類似的腎保護(hù)作用在缺血再灌注損傷[13]、造影劑腎病[14]、高血壓性腎纖維化[15]、順鉑相關(guān)性腎病[16]和阿霉素相關(guān)腎病綜合癥[17]中均得到證實(shí)。本實(shí)驗(yàn)利用鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)誘導(dǎo)的DN大鼠模型為研究對(duì)象，探討LC對(duì)DN的腎臟保護(hù)機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑和儀器

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SD大鼠(Charles River Technology)，體重240～260 g，合格證編號(hào)為SPF2017005202，恒溫恒濕飼養(yǎng)。

1.2試劑 LC(Sigma)；STZ(Sigma-Aldrich)；抗單核細(xì)胞趨化蛋白1(monocyte chemotactic protein 1，MCP-1)、Toll樣受體2(Toll-like receptor-2，TLR-2)、Bcl-2、核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)、NF-κB抑制蛋白(inhibitor of NF-κB，IκB)和WT-1抗體(Santa Cruz)；抗ED-1 單克隆抗體(Serotec)；抗轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)抗體(R&D Systems)；抗TGF-β 誘導(dǎo)基因h3產(chǎn)物(TGF-β-induced gene h3 product，βig-h3)抗體(Proteintech)；抗active caspase-3抗體(Millipore)。

1.3儀器 全自動(dòng)生化分析儀(Coulter Electro-nics)；彩色圖像自動(dòng)分析儀和數(shù)字化顯微鏡分析儀(Olympus)；1200EX型透射電鏡(JEOL)；LKB-V型超薄切片機(jī)(LKB)。

2 動(dòng)物分組與藥物治療

SD大鼠隨機(jī)分為6組(n=8)：(1)正常對(duì)照(control)組：正常大鼠靜脈給予生理鹽水(1 mL·kg-1·d-1)；(2)LC50組：正常大鼠靜脈給予LC (50 mg·kg-1·d-1)；(3) LC200組：正常大鼠靜脈給予LC (200 mg·kg-1·d-1)；(4) DN組：DN大鼠靜脈給予生理鹽水(1 mL·kg-1·d-1)；(5) DN+LC50組：DN大鼠靜脈給予LC (50 mg·kg-1·d-1)；(6) DN+LC200組：DN大鼠靜脈給予LC (200 mg·kg-1·d-1)。

采用一次性腹腔注射STZ(65 mg/kg)誘導(dǎo)糖尿病模型，大鼠尾尖血測(cè)血糖值≥16.7 mmoL/L視為造模成功。造模2周后糖尿病大鼠給予LC治療，共12周，在0、4、8、12周分別處死大鼠，收集血液、尿液和腎組織標(biāo)本以備進(jìn)一步檢測(cè)。LC劑量選擇基于以往報(bào)道[12]。該動(dòng)物實(shí)驗(yàn)得到韓國(guó)加圖立大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(CUMC-2016-0101-01)。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1生化檢測(cè) 定期測(cè)量各組大鼠的體重，分別在0、4、8和12周檢測(cè)空腹血糖及24 h尿蛋白排泄率，12周處死各組大鼠，用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血肌酐(serum creatinine，SCr)。

3.2腎臟的病理組織學(xué)檢查 各組大鼠腎組織由過碘酸-賴氨酸-多聚甲醛液固定，石蠟包埋后切片，行PAS染色，采用彩色圖像自動(dòng)分析儀高倍鏡視野下分析腎小球硬化指數(shù)(glomerulosclerosis index，GSI)。每個(gè)標(biāo)本至少觀察40個(gè)非重疊腎小球并取平均數(shù)。

3.3免疫組織化學(xué)染色 石蠟包埋切片置二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，37 ℃、0.3%過氧化氫/甲醛處理30 min后，PBS液洗 3 次。置微波爐中加熱行波爐抗原修復(fù)(98 ℃、5 min)。室溫下非免疫性血清封閉液20 min。在 4 ℃下滴加抗ED-1和 WT-1單克隆抗體孵育12～16 h。PBS 液洗3次后滴加 II 抗，室溫孵育2 h。以DAB為底物顯色，呈棕黃色為止。自來水流水洗滌，復(fù)染蘇木素，常規(guī)樹脂封片。染色程度用數(shù)字化顯微鏡分析儀的Polygon程序算出每0.5 mm×0.5 mm染色面積的百分比。

3.4電鏡觀察 取各組大鼠腎皮質(zhì)組織在二甲胂酸鈉溶液配制的戊二醛固定48 h，PBS沖洗3次，1% 鋨酸固定2 h，雙蒸水沖洗，常規(guī)脫水、環(huán)氧樹脂定向包埋，先行半薄切片，甲苯胺藍(lán)染色，光鏡定位后行超薄切片，厚50～70 nm，醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙染色，透射電鏡觀察。

3.5Western blot法測(cè)定蛋白水平 腎組織用蛋白質(zhì)裂解液[10 mmoL/L Tris-HCl (pH 7.6)、150 mmol/L NaCl、1% sodium deoxycholate、1% Triton X-100、0.1% sodium dodecyl sulfate、1% aprotinin、2 mmol/L Na3VO4、1 mg/L leupeptin和1 mmol/L PMSF]制成勻漿，室溫下離心(1 500 r/min)后，取上清液測(cè)定蛋白濃度(Bio-Rad)，取20 μg標(biāo)本行SDS-PAGE; 電轉(zhuǎn)膜(90 V)2 h后，4 ℃下置抗MCP-1抗體于非脂牛乳中以1 ∶1 000濃度孵育12～16 h，室溫下緩沖液洗3次，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的驢抗兔IgG(Amersham)孵育1 h；室溫下緩沖液洗3次，增強(qiáng)發(fā)光(ECLTM，Amersham)和曝光。以對(duì)照組為標(biāo)準(zhǔn)(100%)測(cè)定條帶的吸光度值，以β-actin為內(nèi)參照。同樣方法分別測(cè)定TLR-2、TGF-β1、βig-h3、Bcl-2、active caspase-3、NF-κB和IκB的蛋白水平。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)和Bonferroni校正t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 LC對(duì)生化指標(biāo)的影響

與control組相比，DN組大鼠體重下降,血糖升高, 24 h尿蛋白排泄率增加, SCr上升(P<0.05);與DN組相比，LC治療除對(duì)血糖水平無(wú)明顯作用外,均使上述指標(biāo)逆轉(zhuǎn)(P<0.05)，見圖1。

Figure 1.Basic parameters during the treatment period. Mean±SD. n=8. *P<0.05 vs control group; △P<0.05 vs DN group; #P<0.05 vs DN+LC50 group.

2 LC對(duì)腎組織病理學(xué)的影響

DN組大鼠腎小球系膜細(xì)胞和基質(zhì)增生、基底膜增厚、腎小球硬化，LC治療可明顯改善腎小球硬化；半定量計(jì)分系統(tǒng)分析發(fā)現(xiàn)DN組GSI明顯升高(與control組相比，P<0.05)，低劑量LC治療可明顯減少GSI(P<0.05)，而高劑量LC進(jìn)一步減少GSI(P<0.05)，見圖2。免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)WT-1水平以觀察足細(xì)胞損傷程度，與對(duì)照組相比，DN組腎小球內(nèi)WT-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著減少(P<0.05)，LC治療有效地增加了WT-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，呈劑量依賴性(P<0.05)，見圖3。電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)DN組大鼠足突融合、增寬甚至消失，足細(xì)胞數(shù)明顯減少，基底膜彌漫性增厚；LC治療有效地保護(hù)了足細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性，見圖4。

3 LC對(duì)炎癥反應(yīng)的影響

免疫組化結(jié)果示，正常腎小球偶見ED-1陽(yáng)性細(xì)胞，而DN組ED-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增多(P<0.05)；LC隨治療劑量的遞增腎小球ED-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著減少(P<0.05)，見圖5。Western blot法檢測(cè)MCP-1和TLR-2表達(dá)，發(fā)現(xiàn)LC明顯抑制MCP-1 和TLR-2蛋白的表達(dá)，呈劑量遞減型(P<0.05),見圖6。以上結(jié)果表明，LC對(duì)STZ誘導(dǎo)的DN具有抗炎作用。

4 LC對(duì)致纖因子表達(dá)的影響

TGF-β1在諸多腎臟疾病的硬化和纖維化中扮演著重要角色。本研究采用Western blot檢測(cè)TGF-β1和βig-h3的表達(dá),結(jié)果顯示與control組相比，DN組的TGF-β1及βig-h3蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.05)；LC在50 mg·kg-1·d-1的劑量時(shí)顯著下調(diào)TGF-β1和βig-h3的表達(dá)，而在200 mg/kg/d的劑量時(shí)LC進(jìn)一步下調(diào)它們的表達(dá)(P<0.05)；直線回歸分析提示腎小球硬化程度與TGF-β1(r=0.812，P<0.01)和βig-h3的表達(dá)(r=0.889，P<0.01)均呈正相關(guān)，見圖7。

5 LC對(duì)NF-κB的作用

與control組相比，DN組NF-κB表達(dá)明顯上調(diào)，IκB則明顯下調(diào)；LC治療抑制NF-κB表達(dá)(P<0.05)，反之上調(diào)IκB的表達(dá)(P<0.05)，此作用亦呈劑量依賴性，見圖8。

6 LC對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

抑凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)在DN組中明顯減少(P<0.05)，而活性caspase-3的蛋白水平明顯增加(P<0.05)，說明細(xì)胞凋亡參與了DN的發(fā)?。籐C逆轉(zhuǎn)DN 對(duì)Bcl-2和caspase-3蛋白水平的影響，有利于細(xì)胞生存，此作用在高劑量LC組尤為顯著(P<0.05)，見圖9。

Figure 3.The representative photomicrographs of immunohistochemistry for determining the WT-1 expression in the renal tissues and semiquantitative analysis (×400). Mean±SD. n=8. *P<0.05 vs control group; △P<0.05 vs DN group; #P<0.05 vs DN+LC50 group.

Figure 4.The representative photomicrographs of transmission electron microscopy for podocytes.

Figure 5.The representative photomicrographs of immunohistochemistry for determining the ED-1 expression in the renal tissues and semiquantitative analysis (×400). Mean±SD. n=8. *P<0.05 vs control group; △ P<0.05 vs DN group; # P<0.05 vs DN+LC50 group.

討 論

LC 在環(huán)孢素A腎損傷和造影劑腎病中抑制MCP-1、TNF-α和IL-1 等炎性介質(zhì)表達(dá)、減少巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)、下調(diào)TGF-β1表達(dá)、防止細(xì)胞外基質(zhì)沉積，表明在腎臟疾病中，LC具有抗炎、抗纖維化功能[12, 14]。本研究利用STZ誘導(dǎo)的大鼠DN模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LC下調(diào)炎性介質(zhì)MCP-1和TLR-2的表達(dá)，繼之減少炎性細(xì)胞(ED-1陽(yáng)性細(xì)胞)的浸潤(rùn)。此外，LC下調(diào)致纖因子TGF-β1的表達(dá)，隨劑量依賴遞減。這些分子水平上的變化伴隨著蛋白尿的減少、腎功能的改善、腎小球硬化的減少。此結(jié)果與Shakeri等[18]在血液透析患者及Zambrano等[15]在高血壓相關(guān)腎損傷動(dòng)物模型中LC所發(fā)揮的腎臟保護(hù)作用機(jī)制相一致，表明LC在STZ誘導(dǎo)的大鼠DN模型中通過抑制MCP-1、TLR-2和TGF-β1的表達(dá)，從而減少腎臟炎癥反應(yīng)和硬化。

βig-h3是細(xì)胞外基質(zhì)成分之一，與其它不同的基質(zhì)成分或固有細(xì)胞相互連接構(gòu)成各種器官或組織系統(tǒng)的構(gòu)架包括腎臟，然而，對(duì)其確切的病理生理學(xué)作用尚不明確。但有證據(jù)顯示，在慢性環(huán)孢素A腎毒性模型和DN中，βig-h3 和TGF-β1表達(dá)上調(diào)與小管間質(zhì)纖維化及腎小球硬化密切相關(guān)[19]。因此，βig-h3 代表著TGF-β1的生物學(xué)活性，被認(rèn)為是腎臟組織損傷程度的標(biāo)志物[20]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)DN腎臟中βig-h3表達(dá)明顯增加接近2.5倍，伴隨著TGF-β1的高表達(dá)，LC即使在低劑量下也顯著抑制βig-h3和TGF-β1蛋白的表達(dá)，直線回歸相關(guān)分析表明腎小球硬化程度與βig-h3(r=0.889，P<0.01)和TGF-β1(r=0.812，P<0.01) 緊密相關(guān)。綜上我們推斷LC減少DN的腎小球硬化與βig-h3緊密相關(guān)。

Figure 6.The protein expression levels of MCP-1 and TLR-2 were detected by Western blot. Mean±SD. n=8. *P<0.05 vs control group; △ P<0.05 vs DN group; # P<0.05 vs DN+LC50 group.

Figure 7.The protein expression levels of TGF-β1 and βig-h3 were detected by Western blot (A) and Pearson correlation analysis between GSI and TGF-B1 or βig-h3 (B). Mean±SD. n=8. *P<0.05 vs control group; △ P<0.05 vs DN group; # P<0.05 vs DN+LC50 group.

Figure 8.The protein expression of NF-κB and IκB was detected by Western blot. Mean±SD. n=8. *P<0.05 vs control group; △ P<0.05 vs DN group; # P<0.05 vs DN+LC50 group.

Figure 9.The protein expression of Bcl-2 and active caspase-3 was detected by Western blot.Mean±SD. n=8. * P<0.05 vs control group; △ P<0.05 vs DN group; #P<0.05 vs DN+LC50 group.

足細(xì)胞損傷是DN的主要特征之一，足細(xì)胞數(shù)目減少導(dǎo)致足突之間裂孔膜增寬是出現(xiàn)蛋白尿的重要原因[21]。在諸多細(xì)胞死亡的程序中(包括細(xì)胞凋亡和細(xì)胞自噬)，細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致DN足細(xì)胞數(shù)目減少的主要機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，高濃度葡萄糖刺激體外培養(yǎng)的小鼠足細(xì)胞可誘發(fā)細(xì)胞凋亡。在Akita和db/dbDM小鼠中約有1/3足細(xì)胞發(fā)生凋亡，而這種現(xiàn)象先于足細(xì)胞數(shù)目減少且與蛋白尿的發(fā)生密切相關(guān)[22-23]。以往報(bào)道證實(shí)LC改善過氧化氫介導(dǎo)的人腎小管上皮HK-2 細(xì)胞凋亡，緩解慶大霉素誘導(dǎo)的腎小管上皮NRK-52E細(xì)胞凋亡[24-25]。本研究結(jié)果顯示，LC治療可調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，即上調(diào)腎臟組織Bcl-2表達(dá)，抑制caspase-3活化，從而抑制足細(xì)胞凋亡，保持腎小球足細(xì)胞數(shù)量。免疫組織化學(xué)染色和電鏡方法進(jìn)一步確認(rèn)LC治療組增加足細(xì)胞(WT-1陽(yáng)性細(xì)胞)的數(shù)目和完整性。

NF-κB被各種生理性及非生理性刺激所激活，調(diào)控諸多促炎癥介質(zhì)和促纖維化因子的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，在各種腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展中扮演著關(guān)鍵性作用。眾所周知，高糖狀態(tài)可直接或間接地激活NF-κB信號(hào)通路，使足細(xì)胞及系膜細(xì)胞的MCP-1和TGF-β1過度表達(dá)，引起腎組織內(nèi)一系列炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致腎小球硬化及腎小管間質(zhì)纖維化[26-27]。在造影劑腎病和卡鉑所致腎損傷模型中，LC抑制 NF-κB活性，減少腎臟炎癥反應(yīng)及各種腎固有細(xì)胞凋亡，從而起到腎臟保護(hù)作用[14, 28]。在本實(shí)驗(yàn)中，LC下調(diào)DN大鼠腎NF-κB蛋白表達(dá)，相反激活I(lǐng)κB。因此，在STZ誘導(dǎo)的DM動(dòng)物模型中，LC通過干預(yù)NF-κB信號(hào)通路起到抗炎和抗硬化作用。

臨床常用LC治療遺傳性或血液透析相關(guān)的卡尼汀(肉毒堿)缺乏癥。LC 具有抗炎和抗氧化應(yīng)激作用，譬如LC 改善透析患者的血管內(nèi)皮損傷、急性心肌梗死病人的室性心律失常和心絞痛發(fā)作、糖尿病人的周圍神經(jīng)病變、非酒精性肝臟脂肪變性[29-31]。根據(jù)以上效能結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們推測(cè)，對(duì)DM患者盡管沒有腎臟病變，早期使用LC 也可以獲得意想不到的益處?？傊?，在 STZ 誘導(dǎo)的 DN 大鼠模型中，LC 減少蛋白尿，改善腎功能，具有腎臟保護(hù)作用，這將為臨床上使用常用藥防治 DN 提供有力的分子理論基礎(chǔ)。