益母草堿對異丙腎上腺素誘導(dǎo)大鼠心肌纖維化和miR-1表達(dá)的影響*

盧麗娜， 袁 露， 梁博志， 羅建華， 楊 輝， 李 利， 楊冬花△

(1貴州省人民醫(yī)院干醫(yī)科, 2貴陽中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科, 3貴州省人民醫(yī)院內(nèi)分泌科， 貴州 貴陽 550002)

心肌重構(gòu)導(dǎo)致心臟舒縮功能障礙和惡性心律失常的發(fā)生，是心力衰竭發(fā)生、發(fā)展的基本機(jī)制[1]。心肌重構(gòu)病理改變主要包括心肌細(xì)胞肥大、心肌細(xì)胞壞死、心肌細(xì)胞凋亡和心肌纖維化，其中心肌纖維化起十分重要作用[2]，抑制心肌纖維化可明顯延緩心力衰竭的發(fā)生、發(fā)展及改善預(yù)后[3]。益母草(LeonurusjaponicusHoutt.)為傳統(tǒng)中藥，過去主要用于治療婦科和產(chǎn)科疾病。近年研究發(fā)現(xiàn)，益母草水提物可通過影響基質(zhì)金屬蛋白酶2的表達(dá)及活性，改善膠原表達(dá)，抑制大鼠心肌重構(gòu)[4]。益母草堿(leonurine)是從益母草中提取的主要化合物，對心臟具有保護(hù)作用，有廣闊的開發(fā)前景[5]。微小RNA(microRNA，miRNA，miR)中的miR-1在心臟和骨骼肌組織中特異性表達(dá)，參與調(diào)節(jié)心臟發(fā)育和病理生理過程[6]。研究表明，miR-1在心力衰竭時表達(dá)下調(diào)，恢復(fù)miR-1表達(dá)可抑制心肌纖維化，是逆轉(zhuǎn)心肌纖維化的潛在治療靶點[7]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，益母草(30 mg·kg-1·d-1)通過減少慢性心力衰竭大鼠血清心房利鈉肽和血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)含量，改善心臟結(jié)構(gòu)異常和收縮功能障礙，抑制心肌重構(gòu)[8]，但其機(jī)制有待進(jìn)一步明確。AngⅡ是心肌纖維化的主要刺激因素[9]，益母草堿是否通過影響miR-1的表達(dá)抑制心肌纖維化，目前尚不清楚。本研究采用異丙腎上腺素(isoproternol，ISO)誘導(dǎo)心肌纖維化動物模型，探討益母草堿通過影響miR-1表達(dá)抑制心肌纖維化的可能機(jī)制，為其開發(fā)利用奠定理論基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1 實驗動物、藥物、試劑和儀器

SD雄性大鼠90只，體重(200±10) g，由重慶騰鑫比爾實驗動物銷售有限公司提供，合格證號為SCXK(渝)2012-0011。

ISO(上海禾豐制藥有限公司)；益母草堿(上海思域化工科技有限公司)；內(nèi)皮素1(endothelin-1,ET-1)和AngⅡ ELISA試劑盒(南京建成公司)；p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK)抑制劑SB203580(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；抗I型膠原(collagen I)及III型膠原(collagen III)抗體(北京博奧森公司)；SP免疫組化檢測試劑盒(北京中杉金橋公司)；Masson 染色試劑盒(上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；抗p38 MAPK抗體(Abcam)；抗β-肌球蛋白重鏈(β-myosin heavy chain，β-MHC)和α-肌球蛋白重鏈(α-myosin heavy chain，α-MHC)抗體(Santa Cruz)；TRIzol總RNA提取試劑 (天根生化科技北京有限公司)；real-time PCR相關(guān)試劑盒(TaKaRa)；引物由Invitrogen合成。

熒光定量PCR儀(Applied Biosystems)；電鏡(JEM-1400 Plus， JEOL)；酶標(biāo)儀(北京新風(fēng)公司)；蛋白電泳儀(Tanon)；蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(Bio-Rad)。

2 方法

2.1實驗分組及用藥方法 90只健康SD雄性大鼠，同批在動物房適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d 后隨機(jī)分為正常(normal)組10只和實驗組80只，實驗組復(fù)制慢性心力衰竭心肌重構(gòu)動物模型，方法參考文獻(xiàn)[8]：ISO(5 mg·kg-1·d-1)連續(xù) 2周腹腔注射。2周后實驗組存活大鼠 55只，再以心臟超聲評價模型成功與否：如模型大鼠出現(xiàn)心臟左室內(nèi)徑明顯擴(kuò)大，室壁增厚，左室射血分?jǐn)?shù)及左室短軸縮短率下降，提示造模成功[10]。將造模成功的48只大鼠隨機(jī)分成5組：模型(model)組(10只)、益母草堿低劑量[leonurine (low)；7.5 mg·kg-1·d-1]組(10只)、益母草堿中劑量[leonurine (middle)；15 mg·kg-1·d-1]組(10只)、益母草堿高劑量[leonurine (high)；30 mg·kg-1·d-1]組(9只)和p38 MAPK抑制劑(p38 inhibitor; 0.3 mg·kg-1·d-1)組(9只)。藥物治療組分別按上述藥物劑量腹腔注射治療，正常對照組和模型組給予相同體積生理鹽水腹腔注射，每日1次，共2周。所有大鼠均予標(biāo)準(zhǔn)飼料飼養(yǎng)，自由飲水。

2.2電鏡觀察左心室肌組織超微結(jié)構(gòu) 6組動物相應(yīng)時間處死后，取出心臟，剪取左心室壁≤1 mm×1 mm×1 mm心肌塊，置于2.5%戊二醛中固定，經(jīng)脫水、包埋、固化后，超薄切片機(jī)切片50～60 nm，3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，透射電鏡觀察、拍片。

2.3Masson染色觀察心肌膠原纖維變化 取0.5 cm×0.5 cm大小左心室肌組織以10%甲醛固定，石蠟包埋、切片，Masson 染色，顯微鏡下觀察心肌纖維化情況，并計算心肌膠原容積分?jǐn)?shù)(collagen volume fraction，CVF)。CVF(%)=心肌膠原面積/所測視野面積×100%。

2.4免疫組織化學(xué)法觀察左心室肌組織I型膠原和III型膠原的表達(dá) 左心室肌組織標(biāo)本固定及石蠟包埋同Masson染色，經(jīng)脫蠟、水化、煮沸法修復(fù)，按照二步法免疫組化試劑盒說明操作，I 抗按Ⅰ型膠原1 ∶ 400、Ⅲ型膠原1 ∶ 600濃度稀釋，PBS代替 I 抗作為空白對照。顯微鏡下選取5個視野，測定其吸光度(A)值，取平均值，應(yīng)用圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0分析圖片數(shù)據(jù)。

2.5左心室肌組織ET-1和AngⅡ的檢測 將約100 mg左心室組織按10%(重量體積)加入酶抑制劑，用勻漿器碾磨，4 ℃、3 000 r/min離心20 min，取上清液置于-70 ℃ 以下保存待測。以ELISA法檢測ET-1和AngⅡ的含量，操作過程參照試劑盒說明進(jìn)行。

2.6Real-time PCR 法檢測左心室肌組織 miR-1和ET-1 mRNA的表達(dá) 取大鼠心室組織100 mg勻漿后，TRIzol抽提心肌總RNA，逆轉(zhuǎn)錄cDNA，SYBR GreenⅠ real-time PCR測定 miR-1和ET-1的表達(dá)量，分別以 U6 和GAPDH作為內(nèi)參照。miR-1的上游引物序列為5’-TGGAATGTAAAGAAGTGTGTAT-3’，下游引物序列為5’-GGCCAACCGCGAGAAGATG-3’；U6的上游引物序列為5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物序列5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’；ET-1的上游引物序列為5’-TGGACATCATCTGGGTCAACACT-3’，下游引物序列為5’-CCCTTGGTCTGTGGTCTTTGTG-3’；GAPDH的上游引物序列為5’-TTCCTACCCCCAATGTATCCG-3’，下游引物序列為5’-CCACCCTGTTGCTGTAGCCATA-3’。PCR反應(yīng)按以下程序進(jìn)行： 95 ℃ 30 s； 95 ℃ 10 s， 72 ℃ 5 min， 60 ℃ 60 s， 95 ℃ 15 s， 40個循環(huán)。為了建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，再以95 ℃ 10 s、60 ℃ 60 s、95 ℃ 15 s的程序運(yùn)行，并從60 ℃緩慢加熱到99 ℃(儀器自動進(jìn)行，Ramp Rate為0.05 ℃/s)。每個樣本檢測3個復(fù)孔。數(shù)據(jù)采用2- ΔΔCt法進(jìn)行分析。

2.7Western blot 法檢測心肌組織p38 MAPK、β-MHC和α-MHC蛋白質(zhì)的表達(dá)水平 取100 mg左心室組織提取蛋白，用BCA 法進(jìn)行蛋白定量。取各組蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜后以牛血清蛋白封閉，經(jīng) I 抗結(jié)合后洗膜，II 抗結(jié)合，洗膜后采用ECL顯色，軟件分析。采用Gel-Pro Analyzer 4圖像分析軟件測定各帶的灰度值，結(jié)果以各組目的蛋白與內(nèi)參照β-actin表達(dá)量的比值表示蛋白表達(dá)水平。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較用單因素方差分析(one-way ANVOA)，方差齊時，均數(shù)的兩兩比較用SNK-q法，方差不齊時，均數(shù)的兩兩比較用Tamhane’s法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 益母草堿對左心室肌組織超微結(jié)構(gòu)的影響

正常組大鼠左心室肌原纖維排列規(guī)整，Z線和明暗帶清晰；線粒體沿肌原纖維長軸平行排列，細(xì)胞核為圓形或橢圓形，核染色質(zhì)均勻。模型組大鼠左心室心肌細(xì)胞內(nèi)肌原纖維排列紊亂、增生，肌小節(jié)結(jié)構(gòu)破壞，Z線斷裂成波浪狀；線粒體形態(tài)異常，且排布紊亂，部分線粒體腫脹；心肌細(xì)胞肥大或固縮、畸形，核膜呈不規(guī)則凹陷。益母草堿高劑量組和p38抑制劑組大鼠左心室超微結(jié)構(gòu)較模型組有改善，見圖1。

2 益母草堿對左心室肌膠原纖維化的影響

經(jīng)Masson染色，心肌細(xì)胞呈紅色，膠原為藍(lán)色。正常組大鼠心肌纖維化不明顯，而模型組大鼠心肌大量膠原纖維增生及嚴(yán)重的膠原沉積，益母草堿高劑量組和p38抑制劑組心肌纖維化有所減輕。與正常組比較，模型組大鼠CVF明顯增加(P<0.05)；與模型組比較，益母草堿高劑量組和p38抑制劑組CVF明顯減少(P<0.05)，這2組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖2。

Figure 2.The effect of leonurine on collagen fibrosis in left ventricular myocardial tissues (Masson staining,×200). Mean±SD. n=9～10. * P<0.05 vs normal group;# P<0.05 vs model group.

3 益母草堿對左心室肌I型膠原、III型膠原的表達(dá)及I型膠原/III型膠原比值的影響

與正常組比較，模型組大鼠I型膠原和III型膠原表達(dá)明顯增加， I型膠原/III型膠原的比值顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，益母草堿高劑量組和p38抑制劑組I型膠原和III型膠原表達(dá)明顯減少，I型膠原/III型膠原的比值顯著降低(P<0.05)，這2組I型膠原、III型膠原表達(dá)及I型膠原/III型膠原蛋白比值的差異均無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖3。

Figure 3. The effect of leonurine on the protein expression of collagen Ⅰ and collagen Ⅲ in left ventricular myocardial tissues (×200). Mean±SD. n=9～10. * P<0.05 vs normal group; # P<0.05 vs model group.

4 益母草堿對左心室肌組織ET-1和AngⅡ含量的影響

與正常組比較，模型組大鼠左心室肌組織ET-1和AngⅡ的含量明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，益母草堿高劑量組和p38抑制劑組的ET-1和AngⅡ含量明顯降低(P<0.05)，這2組的ET-1和AngⅡ含量差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖4。

Figure 4.The effect of leonurine on the content of ET-1 and Ang II in left ventricular myocardial tissues. Mean±SD. n=9～10. * P<0.05 vs normal group; # P<0.05 vs model group.

5 益母草堿對左心室肌組織miR-1和ET-1 mRNA表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組大鼠左心室肌組織中miR-1的表達(dá)明顯降低，而ET-1 mRNA的表達(dá)明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，益母草堿高劑量組和p38抑制劑組miR-1表達(dá)明顯升高，ET-1 mRNA的表達(dá)明顯降低(P<0.05)，這2組的miR-1 和ET-1 mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖5。

Figure 5.The effect of leonurine on the expression of miR-1 and ET-1 mRNA in left ventricular myocardial tissues. Mean±SD. n=9～10. * P<0.05 vs normal group; #P<0.05 vs model group.

6 益母草堿對左心室肌組織p38 MAPK、β-MHC和α-MHC 蛋白質(zhì)表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組大鼠左心室肌組織中p38 MAPK和β-MHC蛋白表達(dá)量明顯升高，而α-MHC的蛋白表達(dá)量明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，益母草堿高劑量組和p38抑制劑組的p38 MAPK和β-MHC蛋白表達(dá)水平明顯降低，α-MHC的蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，這2組的p38 MAPK、β-MHC和α-MHC蛋白表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖6。

Figure 6.The effect of Leonurine on the protein expression of p38 MAPK, β-MHC and α-MHC in left ventricular myocardial tissues. Mean±SD. n=9～10. * P<0.05 vs normal group; # P<0.05 vs model group.

討 論

心肌纖維化是指心肌組織中膠原纖維過量沉積、各型膠原比例失調(diào)以及排列紊亂[11]，如Ⅰ、Ⅲ型膠原在細(xì)胞外基質(zhì)大量沉積，Ⅰ/Ⅲ型膠原比例失調(diào)，導(dǎo)致心肌僵硬增加，收縮功能障礙[2]。本實驗以異丙腎上腺素誘導(dǎo)動物心肌重構(gòu)模型后，模型大鼠左心室肌經(jīng)Masson 染色顯示大量膠原纖維增生及嚴(yán)重的膠原沉積，CVF值明顯升高，免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果提示Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白質(zhì)的表達(dá)及Ⅰ/Ⅲ型膠原比值明顯增加，心臟超微結(jié)構(gòu)則顯示心肌纖維排列紊亂、增生，肌小節(jié)結(jié)構(gòu)破壞。除了上述心肌纖維化病理改變外，前期研究也顯示該造模方法模型大鼠還出現(xiàn)心臟結(jié)構(gòu)異常及收縮功能障礙的表現(xiàn)[8]，從病理形態(tài)學(xué)和影像學(xué)方面驗證造模成功。

miRNAs是一類長度為19～23個核苷酸的內(nèi)源性單鏈非編碼RNA分子，通過堿基互補(bǔ)與靶基因的特定位點結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后通過抑制蛋白質(zhì)翻譯或mRNA降解調(diào)控基因的表達(dá)[12]。作為miRNAs家族成員之一， Karakikes等[7]發(fā)現(xiàn)miR-1通過上調(diào)慢性心力衰竭大鼠α-MHC和Bcl-2的表達(dá)，下調(diào)β-MHC、心鈉素、轉(zhuǎn)化生長因子β1和結(jié)締組織生長因子的表達(dá)，抑制心肌肥大、心肌纖維化及心肌凋亡，逆轉(zhuǎn)心肌重構(gòu)。Sygitowicz等[13]臨床研究也發(fā)現(xiàn)，miR-1在心功能4級(紐約心臟病協(xié)會心功能分級)患者中表達(dá)明顯下降，miR-1表達(dá)和心衰標(biāo)記物N端利鈉肽前體濃度成反比關(guān)系，miR-1可能成為預(yù)測心衰加重的生物標(biāo)志物。

本研究結(jié)果進(jìn)一步顯示，心肌纖維化大鼠miR-1表達(dá)降低的同時，左心室肌組織ET-1和Ang II含量，ET-1的mRNA及p38 MAPK、β-MHC的蛋白表達(dá)水平明顯升高，而α-MHC的蛋白表達(dá)水平明顯降低。心肌纖維化發(fā)生、發(fā)展涉及復(fù)雜的細(xì)胞和分子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，Ang II作為心肌纖維化主要刺激因子，可激活ET-1[14]。ET-1是一種包括21個氨基酸內(nèi)源性多肽，具有強(qiáng)烈的血管收縮活性和促進(jìn)有絲分裂的作用[15]。p38 MAPK信號通路作為ET-1的下游效應(yīng)，ET-1顯著激活p38 MAPK信號通路[16]。p38 MAPK介導(dǎo)細(xì)胞增殖與分化，激活后可誘導(dǎo)心肌纖維化發(fā)生、發(fā)展[17]。Li等[18]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，miR-1調(diào)控ET-1的mRNA表達(dá)水平，抑制內(nèi)源性ET-1基因在轉(zhuǎn)錄后水平的表達(dá)，ET-1是miR-1的靶基因。因此，心力衰竭時，腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)激活，心肌組織的AngII含量增加，同時心力衰竭時miR-1表達(dá)下調(diào)，抑制ET-1基因表達(dá)能力的下降，導(dǎo)致ET-1表達(dá)增加，激活p38 MAPK信號通路，促使心肌纖維化發(fā)生，推測miR-1部分通過ET-1/p38 MAPK信號通路參與心力衰竭時心肌纖維化的發(fā)生、發(fā)展。

SB203580是p38 MAPK信號通路特異性抑制劑。本研究發(fā)現(xiàn)SB203580在抑制p38 MAPK信號通路活化逆轉(zhuǎn)心肌纖維化的同時，伴隨miR-1表達(dá)上調(diào)和ET-1 mRNA表達(dá)水平的明顯下調(diào)。miRNA作為特異性基因調(diào)節(jié)小分子，調(diào)節(jié)信號通路及信號通路之間的cross-talk，同時信號通路對miRNA的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、加工成熟以及功能發(fā)揮等方面也具有重要的作用[19]。因此，以SB203580治療后miR-1表達(dá)升高，可能在心肌纖維化過程中，p38 MAPK信號通路同樣調(diào)節(jié)miR-1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，促使心肌重構(gòu)信號通路級聯(lián)反應(yīng)不斷放大，調(diào)控信號通路之間cross-talk，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

益母草包含生物堿、黃酮、萜類化合物及脂肪酸等化學(xué)成分，益母草堿是益母草有效生物堿類成分，具有廣泛的藥理學(xué)作用[5]。本研究為研究益母草堿抑制心肌纖維化的作用機(jī)制，通過ISO誘導(dǎo)心肌纖維化大鼠模型，分別予益母草低(7.5 mg·kg-1·d-1)、中(15 mg·kg-1·d-1)和高劑量(30 mg·kg-1d-1)對模型大鼠進(jìn)行干預(yù)治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高劑量益母草堿可以明顯改善模型大鼠心肌纖維化心臟超微結(jié)構(gòu)，減少心肌纖維膠原沉積及左心室肌I型膠原和III型膠原蛋白表達(dá)，使I型膠原/III型膠原的比值顯著降低，同時減少ET-1和Ang II含量，上調(diào)miR-1和α-MHC的蛋白表達(dá)水平，下調(diào)ET-1的mRNA及p38 MAPK和β-MHC的蛋白表達(dá)水平，具有抑制心肌纖維化的作用。故根據(jù)文獻(xiàn)資料及實驗結(jié)果推測，高劑量益母草堿可能通過影響miR-1表達(dá)，抑制ET-1/p38 MAPK信號通路逆轉(zhuǎn)大鼠心肌纖維化，具體機(jī)制有待進(jìn)一步實驗證實。本研究為益母草堿進(jìn)一步開發(fā)利用提供了作用靶點，為其保護(hù)心肌、逆轉(zhuǎn)心肌重構(gòu)和改善心功能提供了新的理論依據(jù)。