構(gòu)建化學(xué)發(fā)光-綠色熒光穩(wěn)定標(biāo)記的鼠傷寒沙門氏菌

廖何斌， 徐 磊， 楊國(guó)淋， 馬 強(qiáng),2,， 鄒 江， 孫 茹， 蔡 燕,2,， 郭曉蘭,2,*

(1.川北醫(yī)學(xué)院 轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心，四川 南充 637000；2.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 檢驗(yàn)科，四川 南充 637000；3.川北醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系，四川 南充 637000；4.川北醫(yī)學(xué)院 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，四川 南充 637000)

鼠傷寒沙門氏菌屬于腸桿菌科，沙門氏菌屬，是一種腸道致病菌，營(yíng)胞內(nèi)寄生，能通過(guò)多種途徑逃避宿主的免疫系統(tǒng)，在宿主體內(nèi)較長(zhǎng)時(shí)間存活并造成持續(xù)感染。由于其宿主廣泛，能感染包括人在內(nèi)的多種動(dòng)物，能通過(guò)定殖在腸道相關(guān)組織有效地刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫，容易表達(dá)外源抗原或其他蛋白等并呈遞給宿主，使宿主產(chǎn)生特異性抗體，所以鼠傷寒沙門氏菌常被改造為弱毒疫苗活載體，廣泛應(yīng)用于多種病毒[1-3]、細(xì)菌[4-6]、寄生蟲[7-8]等的免疫研究，并取得了良好的效果。此外，鼠傷寒沙門氏菌也被應(yīng)用于多種腫瘤治療的研究[9]，其中VNP20009株已用于一期臨床試驗(yàn)[10-11]。在弱毒疫苗活載體研究中，鼠傷寒沙門氏菌經(jīng)常被用于細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)，所以對(duì)其進(jìn)行信號(hào)標(biāo)記，使其可視化，將有利于相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，利用LUX系統(tǒng)對(duì)細(xì)菌進(jìn)行標(biāo)記，在活體成像系統(tǒng)中便能實(shí)時(shí)檢測(cè)細(xì)菌在動(dòng)物體內(nèi)的分布及轉(zhuǎn)移情況。發(fā)光桿菌的Lux operon編碼5個(gè)相關(guān)蛋白，包括LuxA、LuxB、LuxC、LuxD和LuxE，其中LuxA和LuxB組成異源二聚體，構(gòu)成熒光素酶，LuxC、LuxD和LuxE編碼脂肪酸還原酶復(fù)合體，熒光素酶氧化底物FMNH2和長(zhǎng)鏈脂肪醛生成FMN和長(zhǎng)鏈脂肪酸，同時(shí)產(chǎn)生生物光現(xiàn)象，長(zhǎng)鏈脂肪酸又能被脂肪酸還原酶還原為長(zhǎng)鏈脂肪醛[12]。所以，能表達(dá)完整Lux operon的細(xì)菌不需要外源底物便能持續(xù)產(chǎn)生生物發(fā)光。這種生物發(fā)光信號(hào)即使在動(dòng)物組織的深部也能被檢測(cè)到，所以是一種非常方便有效的小動(dòng)物活體檢測(cè)技術(shù)[13-14]。綠色熒光蛋白(GFP)是一類存在于腔腸動(dòng)物的生物發(fā)光蛋白，由于其生色基團(tuán)的形成沒(méi)有物種特異性，所以在原核和真核細(xì)胞都能合成有功能的GFP蛋白，GFP蛋白也被廣泛應(yīng)用于多學(xué)科的研究和生產(chǎn)中。GFP蛋白有諸多優(yōu)點(diǎn)，包括易于檢測(cè)、靈敏度高、蛋白質(zhì)穩(wěn)定、熒光性質(zhì)穩(wěn)定、對(duì)細(xì)胞無(wú)毒害作用、能與其他多種蛋白融合表達(dá)且不影響兩者的功能、能用于活細(xì)胞檢測(cè)等[15]。在細(xì)胞水平研究細(xì)菌，GFP是一種理想的細(xì)菌標(biāo)記物，只需要熒光顯微鏡便能檢測(cè)到細(xì)菌在細(xì)胞內(nèi)的定殖和轉(zhuǎn)移情況。本研究擬對(duì)鼠傷寒沙門氏菌強(qiáng)毒株SalmonellatyphimuriumATCC 14028s進(jìn)行化學(xué)發(fā)光和綠色熒光的雙標(biāo)記。使其同時(shí)能在動(dòng)物水平和細(xì)胞水平具有較好的可視化，為其后續(xù)的改造改良提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌種與細(xì)胞株 質(zhì)粒p1217由西北農(nóng)林科技大學(xué)王華巖教授惠贈(zèng)；質(zhì)粒pRE112、大腸埃希菌7213和7232由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)孔慶科教授惠贈(zèng)；鼠傷寒沙門氏菌ATCC 14028s(Salmonellatyphimurium)由本實(shí)驗(yàn)室保存；食管癌細(xì)胞TE1和乳腺癌細(xì)胞468(MDA-MB-468)由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑 一步克隆試劑盒pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit、PCR試劑盒TransStart FastPfu Fly DNA Polymerase Kit、內(nèi)切酶BamHI購(gòu)自北京全式金生物公司；質(zhì)粒小提試劑盒、DNA純化回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；RPMI1640購(gòu)自Gibco；氯霉素(Cm)、青鏈霉素、胎牛血清(FBS)、二氨基庚二酸(DAP)、蔗糖購(gòu)自Sigma；Marker 10000購(gòu)自康維試劑。

1.2 方法

1.2.1 自殺質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)GenBank收錄的鼠傷寒沙門氏菌ATCC 14028s的基因組序列，選擇兩個(gè)特定的位點(diǎn)，分別設(shè)計(jì)擴(kuò)增同源臂I1-U、I1-D、I2-U、I2-D的引物Insert1 UP1/UP2、Insert1 DP1/DP2、Insert2 UP1/UP2、Insert2 DP1/DP2；根據(jù)質(zhì)粒p1217和pRE112序列，分別設(shè)計(jì)擴(kuò)增Lux操縱子的引物L(fēng)UX P1/P2，擴(kuò)增綠色熒光蛋白基因gfp的引物GFP P1/P2，擴(kuò)增質(zhì)粒pRE112的引物112 P1/P2，序列及產(chǎn)物理論長(zhǎng)度見(jiàn)表1。用PCR試劑盒，按照使用說(shuō)明書擴(kuò)增各DNA片段，再用DNA純化回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物；用一步克隆試劑盒按順序?qū)1-U、LUX、I1-D以及BamHI酶切-回收的pRE112等4個(gè)片段進(jìn)行重組，或按順序?qū)2-U、GFP、I2-D和112等4個(gè)片段進(jìn)行重組；重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌7232中，在LB+Cm(20 μg/mL)平板進(jìn)行篩選，提取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子中的重組質(zhì)粒pRE112-I1和pRE112-I2進(jìn)行測(cè)序鑒定，序列無(wú)誤則克隆成功。

表1 本研究所用引物Table 1 The primers used in this study

1.2.2 基因插入細(xì)菌基因組 基因插入利用同源重組的原理。首先將構(gòu)建的自殺質(zhì)粒pRE112-I1和pRE112-I2轉(zhuǎn)化到接合轉(zhuǎn)移供體大腸埃希菌7213中，在LB+Cm+DAP(50 μg/mL)平板中篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子；分別將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子7213 pRE112-I1(或7213 pRE112-I2)和S.typhimurium野生株(WT)液體震蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，按照2∶1的比例混合兩種菌液，取500 μL菌液濃縮后涂布于LB平板，37 ℃孵育8 h，刮取菌體，涂布于LB+Cm篩選陽(yáng)性接合子；將陽(yáng)性接合子接種于LB+Cm液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，稀釋50倍，取100 μL涂布于LB+Sucrose(10%)平板，室溫培養(yǎng)；PCR鑒定長(zhǎng)出的菌落是否為基因插入的菌株，陽(yáng)性菌落的PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA測(cè)序以確定插入序列正確。

1.2.3 生長(zhǎng)曲線測(cè)定 接種S.typhimuriumWT、S.typhimuriumLux和S.typhimuriumLux-gfp于2 mL LB中，過(guò)夜培養(yǎng)；分別稀釋100倍接種于15 mL LB中，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)；每1 h測(cè)定一次OD600值，共培養(yǎng)8 h。分別進(jìn)行3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 購(gòu)買體重相近的SPF級(jí)5周齡雌性BalB/C小鼠30只，隨機(jī)均分為10組；在LB中培養(yǎng)接種S.typhimuriumWT和S.typhimuriumLux-gfp至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，分別稀釋至適當(dāng)濃度，取0、103、104、105、106和107CFU的活菌(懸于100 μL 生理鹽水)腹腔注射小鼠；各組小鼠飼養(yǎng)于清潔級(jí)動(dòng)物房，自由采食、飲水，光照12 h，飼養(yǎng)15 d，計(jì)算S.typhimuriumWT和S.typhimuriumLux-gfp對(duì)BalB/C小鼠的LD50。當(dāng)小鼠需要活體成像時(shí)，用45 mg/kg的戊巴比妥鈉腹腔注射以麻醉小鼠，用小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)顯影。

1.2.5 細(xì)胞實(shí)驗(yàn) 食管癌細(xì)胞TE1培養(yǎng)于RPMI1640+10%FBS，乳腺癌細(xì)胞468培養(yǎng)于DMEM+10%FBS，均在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。每種細(xì)胞接種105個(gè)細(xì)胞于6孔板中，S.typhimuriumWT和S.typhimuriumLux-gfp培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用RPMI1640洗滌并調(diào)整濃度，分別用1.5×108個(gè)CFU細(xì)菌與每孔中的細(xì)胞孵育2 h，去除細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS洗滌細(xì)胞，然后添加新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)，并加入100 μg/mL的慶大霉素。

2 結(jié)果與分析

2.1 S. typhimurium Lux-gfp構(gòu)建及其表型

通過(guò)分析S.typhimuriumATCC 14028s的基因組，選擇基因組上的兩處位置(圖1)，這兩處位置的特點(diǎn)是均在兩側(cè)編碼基因的下游區(qū)域，且和兩側(cè)編碼基因均不在同一操縱子內(nèi)部，在理論上避開了啟動(dòng)子區(qū)域，不會(huì)對(duì)相鄰的基因造成極效應(yīng)。首先根據(jù)插入位點(diǎn)的序列設(shè)計(jì)了相應(yīng)同源臂擴(kuò)增引物，根據(jù)p1217和pRE112序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增Lux operon和gfp基因。PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示，各PCR產(chǎn)物條帶與Marker進(jìn)行比較，均符合其理論值大小(表1)。利用一步克隆法將各個(gè)片段依次進(jìn)行無(wú)縫連接，構(gòu)建成重組的自殺質(zhì)粒，經(jīng)測(cè)序鑒定構(gòu)建成功。基于同源重組的原理，用構(gòu)建的重組自殺質(zhì)粒先后在基因組對(duì)應(yīng)的位點(diǎn)插入Lux operon和gfp基因，對(duì)應(yīng)的菌株分別獲得了化學(xué)發(fā)光和綠色熒光的特性。如圖3所示，野生型S.typhimuriumWT不具備化學(xué)發(fā)光和綠色熒光特性；S.typhimuriumLux獲得了化學(xué)發(fā)光特性，S.typhimuriumLux-gfp同時(shí)獲得了化學(xué)發(fā)光和綠色熒光的特性，表明成功構(gòu)建了化學(xué)發(fā)光-綠色熒光標(biāo)記的鼠傷寒沙門氏菌。在體外進(jìn)行了超過(guò)20代的培養(yǎng)，該菌株仍保持穩(wěn)定的基因型和表型特征(數(shù)據(jù)未展示)，這與插入的DNA片段在染色體上穩(wěn)定遺傳是相符的，也是相對(duì)于質(zhì)粒攜帶外源DNA的優(yōu)勢(shì)所在。

圖1 基因組插入位點(diǎn)Fig.1 The insertion sites

圖2 重組自殺質(zhì)粒片段擴(kuò)增Fig.2 The amplification of fragments used to construct suicide plasmid

圖3 化學(xué)發(fā)光-紫外熒光檢測(cè)Fig.3 The detection of chemiluminiscence and ultraviolet fluorescence

2.2 穩(wěn)定遺傳的S. typhimurium Lux-gfp生長(zhǎng)特性和毒力

為了確定在S.typhimurium基因組中插入一段序列后對(duì)細(xì)菌的影響，對(duì)構(gòu)建菌株進(jìn)行了生長(zhǎng)曲線測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖4。結(jié)果表明，在基因組上2個(gè)獨(dú)立位點(diǎn)先后插入兩段基因序列，并未對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)造成顯著影響；繼續(xù)測(cè)定S.typhimuriumWT和S.typhimuriumLux-gfp對(duì)5周齡BalB/C小鼠的半數(shù)致死量，均小于2×103CFU，表明S.typhimuriumWT和S.typhimuriumLux-gfp毒力均極強(qiáng)。

鼠傷寒沙門氏菌常作為疫苗載體遞呈內(nèi)源性和外源性的抗原進(jìn)行免疫，或者作為基因治療載體針對(duì)某些疾病進(jìn)行治療等，這往往依賴其生長(zhǎng)迅速，操作簡(jiǎn)單，以及強(qiáng)毒力使其在宿主體內(nèi)進(jìn)行適當(dāng)?shù)母腥九c定殖等特征。測(cè)定了S.typhimuriumWT、Lux和Lux-gfp的生長(zhǎng)曲線，各菌間均無(wú)顯著性差異，結(jié)果表明Lux operon和gfp基因的插入并未顯著影響其快速的生長(zhǎng)和極強(qiáng)的毒力，所以S.typhimuriumLux-gfp作為親本株進(jìn)行各種基因工程改造，在研究細(xì)菌的生命活動(dòng)、細(xì)菌與宿主的相互作用、減毒活疫苗載體研發(fā)等領(lǐng)域比S.typhimuriumWT更具優(yōu)勢(shì)。

圖4 生長(zhǎng)曲線測(cè)定Fig.4 The growth of S. typhimurium WT, Lux and Lux-gfp

2.3 S. typhimurium Lux-gfp在細(xì)胞內(nèi)的熒光信號(hào)

在S.typhimurium基因組中插入gfp基因，使得該菌具備綠色熒光的特性，在平板上生長(zhǎng)的菌落，紫外熒光明顯(圖3)，進(jìn)一步檢測(cè)在細(xì)胞水平下該菌的熒光情況。鼠傷寒沙門氏菌是胞內(nèi)侵襲菌，能入侵到細(xì)胞內(nèi)部。用S.typhimuriumLux-gfp感染食管癌細(xì)胞TE1和乳腺癌細(xì)胞468約15 h后在熒光顯微鏡下觀察，結(jié)果如圖5所示，感染了S.typhimuriumLux-gfp的細(xì)胞內(nèi)部有明顯的綠色熒光。被S.typhimuriumLux-gfp感染的細(xì)胞形態(tài)均有變圓趨勢(shì)，易漂浮死亡，這可能是由于該菌株毒力強(qiáng)，對(duì)細(xì)胞殺傷力大造成的。若要作為疫苗載體或者基因治療載體，則應(yīng)該使其毒力弱化，減小對(duì)正常細(xì)胞的殺傷作用；或使進(jìn)入細(xì)胞的細(xì)菌裂解以釋放基因治療藥物等，這樣才能更好地發(fā)揮作為載體的作用。

2.4 S. typhimurium Lux-gfp在活體小動(dòng)物上的化學(xué)發(fā)光信號(hào)

在S.typhimurium基因組中插入Lux operon，使得該菌有化學(xué)發(fā)光的特性，在平板上生長(zhǎng)的菌落具有良好的化學(xué)發(fā)光能力(圖3)，化學(xué)發(fā)光特性可用作小動(dòng)物活體成像，所以進(jìn)一步在BalB/C小鼠體內(nèi)進(jìn)行化學(xué)發(fā)光的檢測(cè)。高劑量攻毒(107CFU)的小鼠，全身感染，2 d死亡，化學(xué)發(fā)光成像如圖6所示。未攻毒的對(duì)照組小鼠，同時(shí)間的化學(xué)發(fā)光成像如圖6所示。結(jié)果表明，構(gòu)建的菌株S.typhimuriumLux-gfp在含有正常皮毛的BalB/C小鼠體內(nèi)的化學(xué)發(fā)光信號(hào)能被檢測(cè)到，那么在裸鼠的效果將更明顯?；瘜W(xué)發(fā)光信號(hào)可由小動(dòng)物成像系統(tǒng)采集信號(hào)，也可以用普通的化學(xué)發(fā)光顯影儀采集信號(hào)，對(duì)儀器的要求不高，大部分實(shí)驗(yàn)室均能完成。所以，菌株S.typhimuriumLux-gfp在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中提供了易操作的可視化手段。

圖5 S. typhimurium Lux-gfp感染TE1和468細(xì)胞Fig.5 The infection of S. typhimurium Lux-gfp in cancer cells: TE1 and 468

圖6 S. typhimurium Lux-gfp感染小鼠Fig.6 The infection of S. typhimurium Lux-gfp in BalB/C mouse

3 討 論

使細(xì)菌帶有化學(xué)發(fā)光特性的操縱子Lux op-eron和綠色熒光基因gfp被廣泛應(yīng)用于微生物學(xué)和分子生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。通常是由質(zhì)粒作為載體攜帶Lux operon或gfp基因進(jìn)入細(xì)菌表達(dá)，這樣則會(huì)由于外源質(zhì)粒的引入同時(shí)代入1～2種抗生素抗性基因，這是作為疫苗載體或治療載體的細(xì)菌應(yīng)盡量避免的；質(zhì)粒具有不穩(wěn)定性，可能會(huì)丟失；而且由于質(zhì)粒不相容性，這些質(zhì)粒的存在將增加該菌株表達(dá)外源目的蛋白或核酸質(zhì)粒的選擇難度。因此，本研究直接將Lux operon或gfp基因通過(guò)同源重組的方式插入S.typhimuriumATCC 14028s基因組中，這樣不引入任何外源抗性基因，又能保證兩種標(biāo)記能得到穩(wěn)定的表達(dá)，其在體外傳代20代以上均十分穩(wěn)定(數(shù)據(jù)未展示)，而且還避免了引入質(zhì)粒帶來(lái)的其他問(wèn)題。在基因組中插入的外源基因相對(duì)質(zhì)粒攜帶的缺點(diǎn)在于目的基因的單拷貝，其表達(dá)量受到極大的限制。本研究結(jié)果表明，這種單拷貝的標(biāo)記基因表達(dá)量能使其表現(xiàn)型達(dá)到被檢測(cè)的水平，既在紫外光和化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀器檢測(cè)到該菌的菌落具有紫外發(fā)光和化學(xué)發(fā)光特性，同時(shí)該菌感染癌細(xì)胞后，在細(xì)胞水平也能檢測(cè)到綠色熒光信號(hào)，在感染的小鼠體內(nèi)也能檢測(cè)到化學(xué)發(fā)光信號(hào)。細(xì)菌基因組插入一段序列后可能會(huì)帶來(lái)極效應(yīng)，即對(duì)插入位點(diǎn)下游基因的表達(dá)造成影響，所以插入Lux operon或gfp基因的位點(diǎn)均選擇在兩端基因相隔較遠(yuǎn)，且同時(shí)在兩端基因的下游區(qū)域，這樣理論上不會(huì)影響到上下游基因的啟動(dòng)子，不會(huì)對(duì)其表達(dá)造成影響。此外，還檢測(cè)了雙信號(hào)菌株的生長(zhǎng)曲線和毒力，與親本株比較無(wú)顯著性差異，側(cè)面說(shuō)明了Lux operon或gfp基因的插入并未造成極效應(yīng)。

在基因組中穩(wěn)定標(biāo)記化學(xué)發(fā)光-綠色熒光信號(hào)的基因是完全可行的，本研究構(gòu)建的化學(xué)發(fā)光-綠色熒光穩(wěn)定標(biāo)記的鼠傷寒沙門氏菌將為后期改造其作為弱毒活疫苗載體或抗腫瘤載體的研究提供可視化手段，同時(shí)為相關(guān)的細(xì)菌信號(hào)檢測(cè)研究提供理論參考。