光化學(xué)法對(duì)豚鼠膜外半規(guī)管微循環(huán)的影響

呂凡 王利一 黃魏寧 宋海濤 龔霞 劉旭暉

光化學(xué)法是用四碘四氯熒光素二鈉(rose bengal, RB, 分子式C20H2O5Cl4I4Na2)體循環(huán)注射結(jié)合540±40 nm的綠光照射，使受照射區(qū)域產(chǎn)生單分子氧和自由基破壞血管內(nèi)皮，激活血小板導(dǎo)致局部微血栓形成，進(jìn)而導(dǎo)致缺血[1,2]。目前光化學(xué)法是最常用的微循環(huán)缺血造模方式，常用于大腦微循環(huán)缺血研究；在內(nèi)耳領(lǐng)域，張學(xué)淵等[3]指出光化學(xué)反應(yīng)導(dǎo)致血栓形成的過程與病理狀態(tài)下內(nèi)皮細(xì)胞受損、基底膜暴露激活血小板致血栓形成的過程基本一致；鐘貞等[4]運(yùn)用此項(xiàng)技術(shù)誘導(dǎo)豚鼠耳蝸缺血并進(jìn)行了溶栓治療。我們?cè)谇捌谘芯恐袑⒐饣瘜W(xué)法作用于豚鼠前庭系統(tǒng)，冰水試驗(yàn)顯示豚鼠眼震頻率下降[5]。本研究試圖用光化學(xué)法誘導(dǎo)豚鼠急性半規(guī)管缺血障礙，通過組織病理學(xué)觀察，探討光化學(xué)法是否能夠?qū)﹄嗍蟀胍?guī)管微循環(huán)產(chǎn)生形態(tài)學(xué)影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康白色紅目豚鼠24只，雄性，體重250～350 g，由北京協(xié)和醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供，耳廓反射靈敏。隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組12耳，對(duì)照組12耳，均以左側(cè)為實(shí)驗(yàn)耳。

1.2主要的試驗(yàn)儀器 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保溫手術(shù)臺(tái)(北京半導(dǎo)體設(shè)備一廠)；鹵素?zé)衾涔庠?町田制作所，日本)；光導(dǎo)纖維(直徑3 mm, Olympus, 日本)；濾光片(清華大學(xué)光電系540±40 nm)。

1.3光化學(xué)法誘導(dǎo)內(nèi)耳缺血 兩組豚鼠均用10%水合氯醛150 mg/kg進(jìn)行腹腔注射麻醉，取耳后徑路，沿左耳后乳突正中作1 cm長(zhǎng)切口，暴露左側(cè)聽泡，磨去部分顳骨，暴露上鼓室；剪斷砧骨，磨去鐙骨前后腳，僅保留鐙骨足板，注意保持鼓膜的完整；清理術(shù)區(qū)，充分止血。將波長(zhǎng)為540±40 nm的濾光片經(jīng)水軟化后，置于上鼓室顳骨內(nèi)側(cè)壁內(nèi)，其下緣與圓窗上緣平齊；然后，行頸部正中切口2 cm，分離皮下軟組織、肌肉和筋膜，找到氣管；在氣管旁分離左側(cè)頸外靜脈，用直徑1 mm的黑色導(dǎo)管行靜脈插管，實(shí)驗(yàn)組以20 mg/kg的劑量注射2%四碘四氯熒光素二鈉，注射時(shí)注意染料的避光；對(duì)照組注射生理鹽水0.5 ml，注射完后開啟150 W的鹵素?zé)衾涔庠?，將連接好的光導(dǎo)纖維，經(jīng)濾光后形成波長(zhǎng)為540±40 nm、光強(qiáng)為500～600 mW/cm2的綠色光束，垂直照射，其末端與被照射部位相距0.5 cm，持續(xù)30 min。光照結(jié)束后取出光纖管和頸靜脈導(dǎo)管，結(jié)扎左側(cè)頸外靜脈，用骨蠟填封耳后骨缺損，縫合組織創(chuàng)面。

1.4組織病理學(xué)觀察 手術(shù)完成后兩組各取4耳立即作膜半規(guī)管分離鋪片觀察，其余8耳5天后取術(shù)側(cè)顳骨作石蠟切片觀察。

膜半規(guī)管分離鋪片：打開上鼓室的外壁和上壁，用鉆針在外半規(guī)管凸和上半規(guī)管凸處鉆孔，同時(shí)在蝸窗后下方的后半規(guī)管凸處鉆孔。用血管鉗咬開孔周骨壁以充分暴露三個(gè)膜壺腹，用微細(xì)分離針將三個(gè)壺腹嵴基部的神經(jīng)和血管從骨壁上截?cái)啵谷齻€(gè)膜壺腹游離；用鉆針在半規(guī)管單腳和總腳處鉆孔并在半規(guī)管進(jìn)入橢圓囊的入口處截?cái)嗄ば园胍?guī)管，輕輕抽出整個(gè)膜外半規(guī)管。將取下的膜半規(guī)管在載玻片上的HE染液滴中染色10分鐘，將膜外半規(guī)管鋪放在載玻片上的甘油中，在放大16～25倍的解剖顯微鏡下觀察。

壺腹嵴石蠟切片：將顳骨組織用10%福爾馬林溶液固定24小時(shí)以上, 將顳骨組織浸入5%硝酸溶液中脫鈣5小時(shí)，流水沖洗3小時(shí)后排出組織氣泡，進(jìn)行脫水，浸蠟，包埋，切片。將切片進(jìn)行HE染色、脫水、透明、封固，光學(xué)顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1兩組動(dòng)物一般情況 術(shù)后24小時(shí)實(shí)驗(yàn)組豚鼠在靜止時(shí)均出現(xiàn)向左側(cè)頻繁和細(xì)小的晃頭動(dòng)作，有細(xì)小的肌肉震顫；活動(dòng)時(shí)肌肉震顫更加明顯，晃頭加劇，步調(diào)協(xié)調(diào)性差，軀體呈"C"形，向左側(cè)轉(zhuǎn)圈運(yùn)動(dòng)，易出現(xiàn)左側(cè)翻滾，不能主動(dòng)飲水，需要人工輔助方可飲水、進(jìn)食；而對(duì)照組僅有2只出現(xiàn)頭部的輕度搖擺，步調(diào)協(xié)調(diào)性正常，無轉(zhuǎn)圈樣運(yùn)動(dòng)。隨天數(shù)的增加，實(shí)驗(yàn)組豚鼠肌肉震顫逐漸減輕，步調(diào)漸趨協(xié)調(diào)，爬行弧度漸小，翻滾次數(shù)減少, 在5天內(nèi)逐漸趨向正常。對(duì)照組有兩只出現(xiàn)靜止時(shí)向左側(cè)晃頭活動(dòng)和輕度肌肉震顫，2天內(nèi)即消失，未出現(xiàn)上述其它變化。

2.2膜外半規(guī)管分離鋪片觀察結(jié)果 膜外半規(guī)管分離鋪片HE染色示，實(shí)驗(yàn)組術(shù)后有1耳(圖 1a)出現(xiàn)大范圍的毛細(xì)血管網(wǎng)萎縮、閉塞，膜外半規(guī)管和壺腹嵴缺血狀態(tài)嚴(yán)重，另外3耳(圖1b)缺血狀態(tài)較輕，在膜外半規(guī)管中段有2～3 mm的無血流區(qū)，周圍有少量毛細(xì)血管收縮，但無大片的毛細(xì)血管萎縮閉塞現(xiàn)象。對(duì)照組膜外半規(guī)管毛細(xì)血管網(wǎng)無明顯改變(圖2)。

2.3壺腹嵴石蠟切片觀察結(jié)果 石蠟切片示，實(shí)驗(yàn)組壺腹嵴毛細(xì)血管網(wǎng)均有不同程度的萎縮、閉塞，部分毛細(xì)胞變性、壞死，主要表現(xiàn)為：細(xì)胞腫脹，細(xì)胞界限模糊，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量的白色空泡區(qū)，纖毛融合、倒伏甚至缺失；膜半規(guī)管形態(tài)異常，扭曲變形，網(wǎng)狀纖維萎縮，毛細(xì)血管閉塞，僅見少量紅血球。對(duì)照組壺腹嵴細(xì)胞界限清晰，纖毛清晰可見；壺腹嵴和半規(guī)管血流豐富，半規(guī)管管腔基本呈圓形，網(wǎng)狀纖維無萎縮。兩組均未見到廣泛的纖維化和骨化，橢圓囊、球囊毛細(xì)胞無明顯異常(圖3～6)。

3 討論

前庭迷路缺血或梗死以及內(nèi)耳微循環(huán)障礙被認(rèn)為是引起血管性眩暈的主要原因之一。動(dòng)物模型研究發(fā)現(xiàn)迷路動(dòng)脈血流中斷5分鐘可引起內(nèi)耳終器的點(diǎn)狀變性，迷路動(dòng)脈主干完全梗阻能引起膜迷路的嚴(yán)重變性，而分支的微小栓塞則導(dǎo)致局限性的點(diǎn)片狀壞死，嚴(yán)重受損時(shí)膜迷路能形成廣泛的纖維化和骨化[6,7]；從一般的變性到嚴(yán)重的纖維化、骨化，內(nèi)耳終器的病理改變?nèi)Q于內(nèi)耳血管受損的機(jī)制、嚴(yán)重程度以及持續(xù)時(shí)間[8～10]。臨床上椎-基底動(dòng)脈供血不足或閉塞及腦干梗死等腦血管疾病導(dǎo)致的眩暈和平衡功能障礙不是因其最終影響到腦干、大腦、小腦、前庭神經(jīng)核等神經(jīng)中樞，而是在疾病發(fā)展過程中使支配內(nèi)耳的內(nèi)聽動(dòng)脈血流量減少，從而影響前庭平衡器官血供所致。 Millikan等[11]指出血小板纖維素栓子堵塞微血管造成前庭迷路缺血引發(fā)的眩暈較嚴(yán)重，常伴惡心、嘔吐、眼球震顫、共濟(jì)失調(diào)，并且因頭部活動(dòng)而加重；癥狀可持續(xù)幾天到幾周，逐步緩解；恢復(fù)功能后仍可遺留偶發(fā)、短暫的眩暈發(fā)作和單側(cè)前庭功能異常，但國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)缺乏有關(guān)前庭系統(tǒng)特別是針對(duì)膜半規(guī)管微循環(huán)缺血的動(dòng)物模型研究作為支持。光化學(xué)法是最常用的大腦微循環(huán)缺血造模方式，也曾多次成功應(yīng)用于耳蝸微循環(huán)缺血研究，本研究試圖以光化學(xué)法誘導(dǎo)豚鼠膜外半規(guī)管缺血，以期獲得半規(guī)管微循環(huán)缺血模型的初步數(shù)據(jù)。

圖1 實(shí)驗(yàn)組膜外半規(guī)管分離鋪片(×200倍) 1a毛細(xì)血管網(wǎng)大面積萎縮、閉塞;1b毛細(xì)血管網(wǎng)中段明顯萎縮、閉塞。 圖2 對(duì)照組膜外半規(guī)管分離鋪片(×200倍) 2a、2b均顯示膜半規(guī)管毛細(xì)血管網(wǎng)無明顯改變。

圖3 實(shí)驗(yàn)組膜半規(guī)管形態(tài)(×200倍) 可見異常,扭曲變形,網(wǎng)狀纖維萎縮,毛細(xì)血管閉縮,僅見少量紅血球。 圖4 對(duì)照組膜半規(guī)管形態(tài)(×200倍) 管腔基本呈圓形,網(wǎng)狀纖維無萎縮,血管充盈清晰可見。 圖5 實(shí)驗(yàn)組壺腹嵴(×200倍) 可見毛細(xì)血管網(wǎng)均有不同程度的萎縮、閉塞,部分毛細(xì)胞變性、壞死,主要表現(xiàn)為:細(xì)胞腫脹,細(xì)胞界限模糊,細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量的白色空泡區(qū),纖毛融合、倒伏甚至缺失。 圖6 對(duì)照組壺腹嵴(×200倍) 結(jié)構(gòu)清晰,毛細(xì)胞、纖毛均正常。

根據(jù)豚鼠內(nèi)耳解剖的特點(diǎn)，豚鼠前庭感受器位于鼓室內(nèi)壁上后部，可以設(shè)想一個(gè)以橢圓窗后緣頂點(diǎn)為圓心，半徑為5 mm的向上的扇形區(qū)域(耳蝸不在其內(nèi))，該區(qū)域可涵蓋橢圓囊區(qū)、球囊區(qū)、三個(gè)半規(guī)管骨突和壺腹嵴區(qū)[12]。本實(shí)驗(yàn)中光照前充分暴露該區(qū)域，清除表面積血后將濾光片置于其上，然后進(jìn)行光照。光照區(qū)外半規(guī)管受光照最直接，因而本研究選擇外半規(guī)管作為光照區(qū)域；在調(diào)配、注射光敏劑時(shí)應(yīng)注意避光，在進(jìn)行光照時(shí)注意對(duì)受照區(qū)的監(jiān)控，防止偏移；注意手術(shù)時(shí)間(前期工作中因?yàn)槭中g(shù)時(shí)間過長(zhǎng)，術(shù)中豚鼠死亡8只)，如果手術(shù)時(shí)間超過3小時(shí)，豚鼠術(shù)后生存率會(huì)受很大影響。另外，抽取膜外半規(guī)管須在顯微鏡下精細(xì)操作，否則極易將其離斷。

光鏡下，正常膜半規(guī)管表面有毛細(xì)血管呈弧形，沿半規(guī)管平行狀縱軸走行，毛細(xì)血管并非為直線樣，而是有許多曲折，血管之間缺乏溝通。本實(shí)驗(yàn)?zāi)ぐ胍?guī)管分離鋪片顯示：實(shí)驗(yàn)組術(shù)后有1耳出現(xiàn)大范圍的膜半規(guī)管毛細(xì)血管網(wǎng)萎縮、閉塞；另外3耳在膜半規(guī)管近中段有2～3 mm的無血流區(qū)，周圍有部分毛細(xì)血管收縮，但無大片的毛細(xì)血管萎縮閉塞現(xiàn)象。推測(cè)半規(guī)管是呈3個(gè)相互垂直、彎曲成2/3個(gè)環(huán)形的中空骨管，而在前庭窗上部的外半規(guī)管骨突是最為表淺的部位，術(shù)中所受光照較半規(guī)管其他區(qū)域更強(qiáng)，因而出現(xiàn)更為明顯的缺血表現(xiàn)。石蠟切片顯示膜外半規(guī)管橫斷面，實(shí)驗(yàn)組膜外半規(guī)管形態(tài)異常，扭曲變形，網(wǎng)狀纖維萎縮，毛細(xì)血管閉縮，僅見少量紅血球，說明缺血狀態(tài)依然存在；壺腹嵴下毛細(xì)血管網(wǎng)均有不同程度的萎縮、閉塞，壺腹嵴部分毛細(xì)胞變性、壞死，缺失；對(duì)照組壺腹嵴細(xì)胞界限清晰，纖毛清晰可見，壺腹嵴血流豐富。說明實(shí)驗(yàn)組豚鼠外半規(guī)管局部缺血條件下，短期內(nèi)壺腹嵴毛細(xì)胞的結(jié)構(gòu)沒有明顯的改善。實(shí)驗(yàn)組未見到明顯的纖維化和骨化，推測(cè)可能觀察時(shí)間較短，纖維化和骨化尚未形成。前期研究中冰水試驗(yàn)顯示實(shí)驗(yàn)組眼震頻率較對(duì)照組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而振幅和持續(xù)時(shí)間上的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[3]，本實(shí)驗(yàn)觀察也發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組豚鼠術(shù)后出現(xiàn)了明顯的晃頭動(dòng)作和肌肉震顫，步調(diào)協(xié)調(diào)性變差，說明實(shí)驗(yàn)組豚鼠出現(xiàn)了一定程度的前庭功能障礙。

文中結(jié)果顯示，兩組均未見到橢圓囊和球囊的毛細(xì)胞明顯異常，說明光化學(xué)法對(duì)這兩處前庭感受器不敏感，可能是因?yàn)槠湮恢幂^深，光照不夠充分，尚需進(jìn)行進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，光化學(xué)法可以作用于豚鼠壺腹嵴、外半規(guī)管，破壞其局部微循環(huán)，激發(fā)急性缺血狀態(tài)，能在一定程度上模擬病理狀態(tài)下的急性外半規(guī)管缺血；具有方法簡(jiǎn)便、效果明顯、重復(fù)率高的特點(diǎn)，可以為進(jìn)一步研究急性血管性眩暈發(fā)病機(jī)理提供參考。