一例致病性大腸桿菌的分離鑒定及診治

戴益民，廖財(cái)智，賴芬菊*

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西南昌330045；2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，江西南昌330045)

長(zhǎng)期以來(lái)，哺乳仔豬腹瀉是養(yǎng)豬生產(chǎn)的一類常見(jiàn)疾病，導(dǎo)致仔豬生長(zhǎng)受阻和仔豬高死亡率的發(fā)生，嚴(yán)重阻礙養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。引起仔豬腹瀉的病原種類多，病因復(fù)雜多樣，可分為傳染性和非傳染性。而傳染性腹瀉以細(xì)菌和病毒感染較為常見(jiàn)，是導(dǎo)致仔豬高發(fā)病率和高死亡率的重要原因[1-3]。仔豬病毒性腹瀉的病原主要包括流行性腹瀉病毒、傳染性胃腸炎病毒和輪狀病毒，傳播范圍廣，傳播速度快，危害也最為嚴(yán)重[4-5]。

仔豬細(xì)菌性腹瀉可導(dǎo)致仔豬成活率下降、生長(zhǎng)緩慢、發(fā)育停滯而成為僵豬，甚至發(fā)生死亡，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)重大的經(jīng)濟(jì)損失[6]。豬場(chǎng)一旦發(fā)生病情，為了防止疾病的進(jìn)一步蔓延，需要對(duì)病原進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的診斷[7]。仔豬細(xì)菌性腹瀉主要包括大腸桿菌性腹瀉、梭菌性腹瀉和沙門菌性腹瀉。產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(ETEC)是大腸桿菌感染引起仔豬腹瀉的主要致病菌，其感染又稱仔豬黃白痢[8-9]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年在死亡的仔豬中約有50%與ETEC有關(guān)。仔豬黃痢多發(fā)于7日齡以內(nèi)仔豬，患病仔豬主要的臨床癥狀表現(xiàn)為排黃白色或黃色水樣糞便。仔豬白痢多發(fā)于10～30日齡仔豬，病豬臨床癥狀表現(xiàn)為糞便呈乳白或灰白色[10]。ETEC主要影響仔豬生長(zhǎng)發(fā)育且降低飼料報(bào)酬而造成較大經(jīng)濟(jì)損失。隨著規(guī)?；B(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，由ETEC引起的仔豬黃白痢有明顯上升趨勢(shì)，仔豬成活率降低，斷奶窩重降低，嚴(yán)重制約了我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展。因此，如何采取有效的措施預(yù)防和控制仔豬黃白痢己成為國(guó)內(nèi)外養(yǎng)豬業(yè)生產(chǎn)的一項(xiàng)重要課題。

近十幾年來(lái)，為防治疾病及促進(jìn)生長(zhǎng)，大量抗菌藥物應(yīng)用于集約化養(yǎng)豬生產(chǎn)中。抗菌藥物長(zhǎng)期、廣泛和不合理使用以及抗菌藥物的選擇壓力等原因使大腸桿菌耐藥菌株不斷增多、耐藥譜不斷擴(kuò)大，合理用藥是目前最適合的方法[11-12]。

2016年3月，江西新余某1 600頭母豬豬場(chǎng)爆發(fā)以20日齡左右哺乳仔豬下痢及高死率為主要臨床表現(xiàn)的疾病，窩發(fā)病率為20%，窩內(nèi)發(fā)病率達(dá)90%，病死率90%～100%。為了探查爆發(fā)原因，獲得最佳的預(yù)防和治療方案，筆者對(duì)5頭嚴(yán)重腹瀉仔豬進(jìn)行了解剖，并用其小腸及其內(nèi)容物樣品分別進(jìn)行進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)、培養(yǎng)特性試驗(yàn)、生化特性鑒定和16S rRNA分子鑒定，共分離得到4株大腸桿菌，其著色、形態(tài)、生化特性和16S rRNA序列均存在細(xì)微差別。藥敏實(shí)驗(yàn)表明，4株大腸桿菌對(duì)所選擇的半數(shù)藥物耐藥，篩選出兩株敏感藥物。以這兩種藥物對(duì)發(fā)病豬只進(jìn)行治療，豬場(chǎng)病情得到有效控制。

1 材料與方法

1.1 樣品

對(duì)5頭嚴(yán)重腹瀉仔豬進(jìn)行剖檢，分別采集豬腸道內(nèi)容物作為樣品進(jìn)行細(xì)菌分離及鑒定。

1.2 試劑與儀器

TSA(胰蛋白胨大豆)、MAC(麥康凱)、營(yíng)養(yǎng)肉湯(NB)、EMB(伊紅美藍(lán))培養(yǎng)基購(gòu)自廣東環(huán)凱有限責(zé)任公司。細(xì)菌生化微量鑒定管購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限公司。Taq DNA聚合酶、dNTP、Trans 5K DNA Marker購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；引物由生工生物工程(上海)有限公司合成；電泳級(jí)瓊脂糖、膠回收試試盒均購(gòu)自鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司。藥敏試紙購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司。Veriti 96孔熱循環(huán)PCR擴(kuò)增儀購(gòu)自ABI公司，JY200C型電泳儀購(gòu)自北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)UVP公司。

1.3 細(xì)菌的分離培養(yǎng)

無(wú)菌條件下將發(fā)病仔豬的小腸黏膜及小腸內(nèi)容物取樣接種于麥康凱瓊脂平板上劃線，37 ℃培養(yǎng)18～24 h后，從每個(gè)平板上挑取單菌落繼續(xù)在MAC培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)，穩(wěn)定純化三代后，單菌落再接種于TSA培養(yǎng)基中培養(yǎng)增殖，甘油凍存，備用。

1.4 菌株的形態(tài)鑒定

將單菌落分別接種于TSA、MAC和EMB平板上，37 ℃培養(yǎng)18～24 h后，描述細(xì)菌在各培養(yǎng)基上的培養(yǎng)性狀(如菌落大小、形狀、突起、顏色和粘度等)，參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》對(duì)細(xì)菌種類做初步鑒定。

1.5 菌株的生化鑒定

挑取TSA瓊脂平板上純化的疑似大腸桿菌菌株，分別接種于各微量生化試驗(yàn)鑒定管。進(jìn)行分解葡萄糖、乳糖和衛(wèi)茅醇發(fā)酵試驗(yàn)，同時(shí)分別做脫羧酶試驗(yàn)、脲酶試驗(yàn)、尿素酶試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、硫化氫產(chǎn)生、枸櫞酸鹽利用、脫氨等試驗(yàn)。置于培養(yǎng)箱中37 ℃恒溫培養(yǎng)48～72 h，觀察結(jié)果。

1.6 菌株的分子鑒定

刮取少量菌落混勻于200 μL超純水中，煮沸10 min，10 600×g離心10 min，取上清1 μL作為PCR模板。再加入5×PrimeSTAR Buffer 10 μL(含Mg2+)、dNTP mixture(10 mmol/L)4 μL、引物16s-F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和16s-R(5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)，濃度均為50 μmol/L各1 μL、PrimeSTAR HS DNA聚合酶(5 u/μL) 1 μL，加H2O至50 μL；PCR循環(huán)參數(shù)的選擇：98 ℃ 5 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸8 min。以10 g/L瓊脂糖凝膠電泳并觀察PCR產(chǎn)物的大小。對(duì)特異性擴(kuò)增條帶進(jìn)行切膠回收，并交由北京全式金生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

運(yùn)用GenBank核酸數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中BLAST工具軟件，對(duì)測(cè)序成功的序列片段與核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中相關(guān)序列進(jìn)行序列比對(duì)及同源性分析。根據(jù)BLAST搜索和比較的結(jié)果，分析細(xì)菌所屬的種類。并采取MEGA7.0進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析和進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建。距離分析采用鄰位相連法(NJ，neighbor-joining)，用Bootstrap對(duì)系統(tǒng)樹(shù)進(jìn)行1 000次重復(fù)檢驗(yàn)。

1.7 藥敏試驗(yàn)

大腸桿菌在TSA瓊脂平板上37 ℃培養(yǎng)12 h，挑取單個(gè)菌落接種到2 mL含NB培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)16 h，再用滅菌生理鹽水將培養(yǎng)液調(diào)節(jié)渾濁度至0.5麥?zhǔn)媳葷峁堋Ｓ脺缇奘米诱喝∩鲜鼋臃N菌液，均勻涂于平板上，蓋好平皿，在室溫下放置3～5 min待干。用無(wú)菌小鑷子分別取藥敏紙片按要求均勻緊貼于培養(yǎng)基表面。將貼好藥敏片的大腸桿菌平板置于含普通培養(yǎng)箱37 ℃倒置培養(yǎng)18～24 h。用游標(biāo)卡尺準(zhǔn)確量取抑菌圈直徑(mm)，以沒(méi)有肉眼明顯可見(jiàn)物區(qū)域?yàn)橐志吘墶８鶕?jù)美國(guó)臨床試驗(yàn)室國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)(CLSI2008)標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果。

2 結(jié)果分析

2.1 發(fā)病豬的癥狀及剖檢結(jié)果

仔豬疾病爆發(fā)時(shí)主要表現(xiàn)為以仔豬突然有1～2頭排出黃色漿狀稀糞、嘔吐、消瘦，可見(jiàn)部分有神經(jīng)痛、劃水、撞墻、顫抖、迅速死亡，體溫變化不明顯。發(fā)病仔豬70%～80%呈零星散發(fā)、迅速死亡。剖檢喉頭未見(jiàn)出血，氣管內(nèi)有泡沫，肺炎，心肌衰竭，脾臟明顯病變、腸壁水腫，嚴(yán)重充血、水腫、未有鼓氣，腸系膜淋巴結(jié)有彌漫性小點(diǎn)出血，肝、腎有凝固性小壞死灶(圖1)

圖1 腹瀉仔豬糞便、發(fā)病狀態(tài)及剖檢圖Fig.1 Feces,disease status and necropsy of diarrhea piglets

圖2 分離細(xì)菌在TSA(左)、MAC(中)和EMB(右)培養(yǎng)基上的形態(tài)Fig.2 Escherichia coli on the TSA(left),MAC(middle) and EMB(right) medium

2.2 分離細(xì)菌的形態(tài)學(xué)特征

將無(wú)菌采集病料在TSA平板上劃線分離培養(yǎng)，37 ℃、18 h即能長(zhǎng)出圓形凸起、光滑、濕潤(rùn)、半透明的灰白色菌落。在MAC平板上過(guò)夜培養(yǎng)后，長(zhǎng)出中等大小、圓形、表面光滑、濕潤(rùn)、邊緣整齊的亮紅色小菌落。在EMB瓊脂上形成帶有金屬光澤的黑色菌落(圖2)。根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》上面有關(guān)大腸桿菌在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基和麥康凱培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)特性可以初步判定其為大腸桿菌，將其分別命名為大腸桿菌JX-2016-1～4。

表1 JX-2016-1-4各項(xiàng)生化特性

“?”產(chǎn)酸產(chǎn)氣；Θ為產(chǎn)氣；“+”為陽(yáng)性；“—”為陰性

“?”Acid and gas producing,Θgas producing,“+”posive,“—”negative

2.3 菌株的生化特征

M：DL5000；1：陰性對(duì)照；3-6：分別對(duì)應(yīng)JX-2016-1～4M：DL5000；2：Negative control,3-6：strain JX-2016-1-4圖3 大腸桿菌JX-2016-1-4 PCR特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 The PCR product of JX-2016-1-4 strains

將分離到的JX-2016-1～4分別接種于10種微量生化管中，放置37 ℃恒溫箱過(guò)夜培養(yǎng)后觀察結(jié)果。JX-2016-1～4可分解葡萄糖，不能分解衛(wèi)茅醇，V-P(葡萄糖蛋白胨水)為陰性，不能利用枸櫞酸鹽，不分解含硫氨基酸產(chǎn)硫化氫，不含有苯丙氨酸脫氨酶。但JX-2016-1～4在乳糖發(fā)酵試驗(yàn)、賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)、鳥氨酸脫羧酶試驗(yàn)和脲酶試驗(yàn)中結(jié)果不盡相同。具體生化特性見(jiàn)表1。根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》中關(guān)于大腸桿菌的描述，可以確定JX-2016-1～4均為大腸桿菌。

2.4 菌株的16S rRNA的擴(kuò)增

根據(jù)細(xì)菌16S rRNA兩端的保守序列設(shè)計(jì)引物，對(duì)分離到的JX-20161～4進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增。取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察。發(fā)現(xiàn)JX-2016-1～4均能擴(kuò)增得到1 500 bp的特異性條帶，符合預(yù)期大小，陰性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物(圖3)。

2.5 菌株的16S rRNA的序列同源性分析

大腸桿菌JX-2016-1～4的16S rRNA基因測(cè)序顯示片段大小為1 500 bp，與GenBank中的多株大腸桿菌16S rRNA基因序列同源性達(dá)99%，進(jìn)一步確定其均為大腸桿菌。采用NJ法選取同源性在99%以上的菌株序列并下載其他種的大腸桿菌序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖4)。進(jìn)化樹(shù)分析表明，菌株JX-2016-1與菌株JX-2016-2同源性為100%，位于獨(dú)立的一小支，與菌株JX-2016-3處于一大的進(jìn)化分支上；菌株JX-2016-3與菌株IAI39處于同一進(jìn)化分支上。菌株JX-2016-4處于一獨(dú)立的進(jìn)化分支上。

圖4 大腸桿菌JX-2016-1～4分子進(jìn)化樹(shù)分析Fig.4 The phylogeny tree of 16S rRNA genes of JX-2016-1-4 strains

2.6 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)分離到的4株大腸桿菌菌株JX-2016-1～4進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，根據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(CLSI)制定的抗菌藥物敏感性標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果。從表2結(jié)果中，筆者發(fā)現(xiàn)這四個(gè)菌株耐藥性較強(qiáng)，對(duì)多西環(huán)素、恩諾沙星、新霉素、慶大霉素、環(huán)丙沙星、青霉素、阿莫西林、氨芐西林、氟苯尼考、復(fù)方新諾明、林可霉素均不敏感，對(duì)丁胺卡那中度敏感或耐藥，對(duì)頭孢噻肟、頭孢曲松敏感或中度敏感。

表2 JX-2016-1～4藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.7 反饋豬場(chǎng)進(jìn)行治療

通過(guò)菌株的藥敏試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)分離到的4株大腸桿菌JX-2016-1～4均對(duì)頭孢噻肟、頭孢曲松敏感或中度敏感，指導(dǎo)豬場(chǎng)運(yùn)用這兩種藥物治療發(fā)病豬群，病情得到有效的控制。

3 結(jié)論與討論

本次江西新余某豬場(chǎng)爆發(fā)了以哺乳仔豬腹瀉為特征的消化道疾病。為了做到有的放矢地預(yù)防和治療，建立正確的診斷，本研究采集了5份腹瀉仔豬小腸內(nèi)容物樣品，分別對(duì)其進(jìn)行細(xì)菌分離純化、培養(yǎng)特性試驗(yàn)、生化試驗(yàn)和16S rRNA測(cè)序，共鑒定出4株大腸桿菌，命名為JX-2016-1～4。4株大腸桿菌的生化特性存在細(xì)微差別。16S rRNA測(cè)序結(jié)果和進(jìn)化樹(shù)分析表明這JX-2016-1、JX-2016-2處于同一進(jìn)化小分支上，同源性非常高。JX-2016-1、JX-2016-2與JX-2016-3處于同一進(jìn)化大分支上，與IAI39菌株同源。IAI39菌株是Touchon等[13]于2009年從一腎盂腎炎的患者尿液中分離得到的一株高致病性大腸桿菌。本實(shí)驗(yàn)中臨床解剖結(jié)果表明發(fā)病豬只腎臟有出血點(diǎn)和壞死癥狀。JX-2016-4菌株獨(dú)處于一進(jìn)化分支上，與引起慢性腸炎的黏附侵襲性大腸桿菌O83H1 str.NRG 857[14]、引起腹瀉的O157 H7 str.Sakai[15]和引起腹瀉的UMN026[13]處于一大的進(jìn)化分支上。由此可以看出該豬場(chǎng)可能是多種大腸桿菌混合感染。

近年來(lái)大腸桿菌的多重耐藥問(wèn)題愈加嚴(yán)重，大腸桿菌可以通過(guò)多種機(jī)制對(duì)多種抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性而造成治療失敗，長(zhǎng)期危害養(yǎng)豬業(yè)。在出現(xiàn)病情后該場(chǎng)也使用了一些常規(guī)治療藥物但效果均不明顯。本研究對(duì)所分離到的4株大腸桿菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，篩選出敏感抗菌藥物，豬場(chǎng)按推薦藥物治療和保健后預(yù)防和治療明顯，降低了仔豬的用藥成本及死亡率。因此，隨著當(dāng)前細(xì)菌特別是大腸桿菌耐藥性的不斷增強(qiáng)，仔豬的藥物使用更應(yīng)該在實(shí)驗(yàn)室的指導(dǎo)下合理的用藥。

大腸桿菌為條件性病原菌，造成消化道疾病的原因與豬自身的免疫能力、養(yǎng)殖條件、管理措施有關(guān)。此次該豬場(chǎng)爆發(fā)消化道疾病主要存在3個(gè)誘因：一是部分欄內(nèi)飲水中細(xì)菌總數(shù)嚴(yán)重超標(biāo)：達(dá)到了5 000 CFU/mL(國(guó)家飲水標(biāo)準(zhǔn)每mL飲水不超過(guò)100 CFU)；其次與氣溫有關(guān)，由于前期氣溫驟降，降低了仔豬的抗病力，使得大腸桿菌成為致?。蛔詈笤诓幻鞑∫虻那闆r濫用抗生素誘導(dǎo)產(chǎn)生了具有極強(qiáng)耐藥性的幾株致病菌。

盡管本次樣品均用流行性腹瀉病毒、傳染性胃腸炎病毒和輪狀病毒特異性引物進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)均未擴(kuò)增出目的條帶(文中未列出)，但仍不排除存在仔豬腹瀉病毒與大腸桿菌的混合感染。疫情發(fā)生后，豬場(chǎng)進(jìn)行了全場(chǎng)隔離消，豬舍通風(fēng)換氣，暫停藍(lán)耳病、口蹄疫的免疫接種等措施，在一定程度上遏制了疫情的惡性發(fā)展。

綜上，在明確病因之后，通過(guò)使用敏感藥物控制病情的同時(shí)，還提醒豬場(chǎng)管理人員改善畜養(yǎng)環(huán)境，加強(qiáng)保溫和斷奶前后仔豬的飼養(yǎng)管理及飲水的定期消毒，可有效減少仔豬細(xì)菌性腹瀉病的發(fā)生和傳播。