10億PIB/mL苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒懸浮劑的研制

梁雪娜，饒 楠，夏紅英，何海峰

(江西科技師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，江西南昌330013)

關(guān)鍵字：苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒；懸浮劑；配方

苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographacalifornicamultiplenucleopolyhedrovirus，AcMNPV)，曾用商品名奧綠一號(hào)，是一種新型的微生物源低毒殺蟲劑，屬于昆蟲病毒類，其特點(diǎn)是殺蟲譜較廣。毒性為大鼠急性經(jīng)口LD50為5 000 mg/kg，急性經(jīng)皮LD50為4 000 mg/kg。作用機(jī)制是害蟲通過(guò)取食感染昆蟲病毒，而后病毒在害蟲體內(nèi)增殖，陸續(xù)浸染至蟲體全身，最后導(dǎo)致害蟲死亡[1]。AcMNPV主要應(yīng)用于十字花科蔬菜，對(duì)多種鱗翅目害蟲都有較好的防治效果，如甜菜夜蛾、銀紋夜蛾、甘藍(lán)夜蛾、菜青蟲等。此病毒為無(wú)脊椎類動(dòng)物所特有的致死類病毒，所以對(duì)人和其他動(dòng)物來(lái)說(shuō)是相對(duì)比較安全的[2]。另該殺蟲劑具有不易被害蟲產(chǎn)生抗性，低毒、低殘留，不污染環(huán)境等其他優(yōu)點(diǎn)，是生產(chǎn)無(wú)公害蔬菜的首選生物類農(nóng)藥殺蟲劑之一[3]。

目前我國(guó)對(duì)苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒劑型以及其配方的創(chuàng)新了解的還不夠深入，為此，筆者通過(guò)小試實(shí)驗(yàn)對(duì)潤(rùn)濕分散劑、增稠劑、防腐劑、防凍劑等助劑的篩選初步確定了10億PIB/mL苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒懸浮劑的配方。

1 材料與方法

1.1 試劑

原藥：1800億PIB/mL苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒母粉(河南省濟(jì)源白云實(shí)業(yè)有限公司)；潤(rùn)濕劑：TERWET 1004、GY-WS 03/04(北京廣源益農(nóng)化工有限公司)、RP-90(上海桑井化工有限責(zé)任公司)、ST-83(上海桑井化工有限責(zé)任公司)。

分散劑：W2007(改性聚醚磺酸鹽，北京漢莫克化學(xué)技術(shù)有限公司)、3010(磺酸鹽類)，8070(嵌段聚醚)(無(wú)錫頤景豐科技有限公司)、DSC2005，DSC2006(聚羧酸鹽類)(北京漢莫克化學(xué)技術(shù)有限公司)、GL303，GT6S(聚醚類，西安高格生物科技有限公司)；增稠劑：黃原膠、硅酸鎂鋁、膨潤(rùn)土、蔗糖；防凍劑：乙二醇、甘油、聚乙二醇200；防腐劑：苯甲酸鈉(安息香酸)、山梨酸鉀、專用防腐劑S-30(雜環(huán)化合物，廣州方中化工有限公司)；消泡劑：有機(jī)硅消泡劑、GY-X 60(北京廣源益農(nóng)化工有限公司)、消泡劑1501(廣州方中化工有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

BGD-750型多功能砂磨機(jī)(廣東標(biāo)格達(dá)實(shí)驗(yàn)室用品有限公司)，T-25型均質(zhì)機(jī)(IKA)，BSA2202S型電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)，PHS-3E型pH計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)，DNJ-1S型黏度計(jì)(上海安德儀器設(shè)備有限公司)，JC101型熱鼓風(fēng)干燥箱(南通嘉誠(chéng)儀器有限公司)、BCD-215SEBB型冰箱(青島海爾股份有限公司)等。

1.3 懸浮劑制備方法

按照配方稱取一定量原藥、潤(rùn)濕分散劑、防腐劑、防凍劑和水于砂磨容器中先剪切10 min再用砂磨機(jī)進(jìn)行研磨。將物料研磨2 h左右，另在砂磨過(guò)程中根據(jù)具體情況加入適量的消泡劑，待檢測(cè)的粒徑符合要求時(shí)出料加入黃原膠、乙二醇和余量的水?dāng)嚢杈鶆蚣纯蒣4]。工藝流程見圖1。

圖1 10億PIB/mL苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒懸浮劑工藝流程Fig.1 Flow chart of 1 billion PIB/mL Autographa californica nuclear polyhedrosis virus suspension

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

潤(rùn)濕劑流點(diǎn)法的測(cè)定：準(zhǔn)確配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的潤(rùn)濕劑水溶液，在燒杯中加入已粉碎好的AcMNPV原藥 5.0 g(精確至0.001 g)，此時(shí)應(yīng)將藥匙一起稱量，用膠頭滴管將配制好的潤(rùn)濕劑水溶液滴加到燒杯中，邊滴加邊攪拌，不時(shí)提起直至有液滴開始滴下時(shí)，停止滴加，再次將燒杯和藥匙一起稱量，記錄滴加溶液質(zhì)量(精確至0.001 g)，重復(fù)以上操作3次。這時(shí)用滴加水溶液的質(zhì)量除以病毒原藥的質(zhì)量即可得到潤(rùn)濕劑對(duì)病毒原藥的流點(diǎn)。

2 懸浮劑各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)

2.1 有效成分含量測(cè)定

按血球計(jì)數(shù)板法進(jìn)行測(cè)定[5]。

2.2 懸浮率測(cè)定

按GB/T 14825—2006進(jìn)行。方法提要：取250 mL的懸浮劑溶液于量筒中靜置，之后再除去上部的9/10溶液，對(duì)剩下1/10溶液進(jìn)行烘干稱量，計(jì)算懸浮率[6]。

2.3 pH值測(cè)定

按GB/T 1601—1993進(jìn)行。

2.4 濕篩試驗(yàn)

按GB/T 16150—1995中的“濕篩法”進(jìn)行。

2.5 黏度的測(cè)定

按NY/T 1860.21—2010中方法進(jìn)行。

2.6 低溫穩(wěn)定性試驗(yàn)

按HG/T 2467.2—2003中4.10進(jìn)行。方法提要：取100 mL的試樣于容器中，放置在(0±2) ℃的冰箱中7 d，分別觀察凍結(jié)情況及在室溫靜置融化后其外觀、流動(dòng)性、分散性、粒徑、測(cè)定有效成分含量、懸浮率、篩析等性能指標(biāo)，結(jié)果符合規(guī)定[6]。

2.7 熱貯穩(wěn)定性試驗(yàn)

按HG/T 2467.2—2003中4.11進(jìn)行。方法提要：取30 mL的試樣于容器中，放置在(54±2) ℃的烘箱中14 d，分別測(cè)定有效成分含量、懸浮率、篩析等性能指標(biāo)，結(jié)果符合規(guī)定[6]。熱貯兩周是模擬常溫存年的效果。

3 結(jié)果與討論

3.1 潤(rùn)濕分散劑的篩選

3.1.1 潤(rùn)濕劑流點(diǎn)的測(cè)定 一般的微生物都是疏水性生物體，為了使其在靶標(biāo)上發(fā)揮其作用，必須要使用潤(rùn)濕劑來(lái)降低表面張力。潤(rùn)濕劑在有潤(rùn)濕性的本職能力外，還有對(duì)分散劑具有助懸浮的作用，一般使用量相對(duì)較少。其中在篩選潤(rùn)濕劑中有流點(diǎn)法、Zeta電位法等方法，流點(diǎn)法是較為常用的方法。特點(diǎn)是流點(diǎn)最小的為該制劑最好的潤(rùn)濕劑。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)流點(diǎn)法對(duì)潤(rùn)濕劑進(jìn)行篩選(表1)。

表1 潤(rùn)濕劑流點(diǎn)測(cè)定

由表1可知，TERWET 1004、RP-90和ST-83的流點(diǎn)分別為1.382、1.29和1.31,在5種潤(rùn)濕劑中流點(diǎn)相對(duì)較低，可確定下來(lái)備用。

3.1.2 潤(rùn)濕劑用量的確定 在其他助劑的用量不變的情況下，分別添加不同量的潤(rùn)濕劑來(lái)確定其最佳用量，同時(shí)測(cè)定其粒徑、pH值、懸浮率、析水率等性能指標(biāo)(表2)。

由表2可知RP-90用量在2%時(shí)各項(xiàng)性能指標(biāo)都較其他潤(rùn)濕劑優(yōu)良，因此確定RP-90作為潤(rùn)濕劑。

表2 潤(rùn)濕劑用量篩選

3.2 分散劑的篩選

分散劑主要是通過(guò)靜電斥力、空間位阻、溶劑化作用等來(lái)防止樣品出現(xiàn)絮凝、粒徑長(zhǎng)大、貯存結(jié)塊等問(wèn)題。同時(shí)能夠保證農(nóng)藥活性成分在高速剪切和砂磨的過(guò)程中分解和失效，也能使原藥在水介質(zhì)中有良好的分散效果。通過(guò)對(duì)單一或者復(fù)配對(duì)常用分散劑進(jìn)行篩選，并針對(duì)濕法粉碎后的懸浮液的性能測(cè)試結(jié)果來(lái)確定合適的分散劑種類及其用量(表3)。

表3 分散劑篩選

由表3可知，不同的分散劑由于本身性質(zhì)的不同其最后的性能指標(biāo)測(cè)試結(jié)果也不一樣。結(jié)果顯示，分散劑DSC2005和DSC2006在砂磨過(guò)程中出現(xiàn)嚴(yán)重膏化現(xiàn)象，說(shuō)明不適合做此類原藥的分散劑。GL-303和GT-6s，3010和8070分別復(fù)配時(shí)，性能都較好但考慮到GL-303和GT-6s產(chǎn)品價(jià)格較后者高故選用3010用量3%和8070用量2%復(fù)配時(shí)樣品的分散性較好，懸浮率達(dá)93.6%，貯存穩(wěn)定性也都較好。通過(guò)上述結(jié)果再一次證實(shí)了與使用傳統(tǒng)的單一助劑相比，采用復(fù)配助劑的相加效應(yīng)能使制劑的分散性更加符合相應(yīng)的要求。

3.3 增稠劑的篩選

在多組分非均相粗分散體系的懸浮劑中分散介質(zhì)的粘度對(duì)制劑的懸浮率也有一定的影響。適量的增稠劑能起到增加農(nóng)藥對(duì)靶標(biāo)的粘附力和沉積量,減少由于雨水沖刷、刮風(fēng)引起植株葉片相互碰撞和摩擦造成的藥劑流失,降低農(nóng)藥對(duì)環(huán)境的污染,達(dá)到控制污染源的作用。根據(jù)Stocks公式可知當(dāng)增稠劑的用量使用過(guò)大，會(huì)使制劑的黏度太大，導(dǎo)致制備的制劑不易傾倒；黏度太低，制劑在放置過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)分層現(xiàn)象，制劑不穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)以黃原膠、硅酸鎂鋁和膨潤(rùn)土作為篩選對(duì)象，最終篩選以黃原膠、硅酸鎂鋁作為增稠劑,用量分別為0.1%、2%，其懸浮率為93.6%，析水率為0。

3.4 防凍劑的篩選

懸浮劑是一種將農(nóng)藥原藥粉分散懸浮于水介質(zhì)中的農(nóng)藥劑型，為了使制劑在寒冷和炎熱的環(huán)境中仍保持良好的藥效，這時(shí)需要加入一定量的防凍劑，以此來(lái)提高制劑在低溫、熱貯中的穩(wěn)定性。本實(shí)驗(yàn)選用乙二醇作為防凍劑，其用量為5%。

3.5 防腐劑的選擇

由于AcMNPV的殺蟲劑活性成分為活性病毒粒子，該病毒粒子在pH 6～8的酸度范圍內(nèi)穩(wěn)定，當(dāng)環(huán)境的酸堿度超過(guò)此范圍時(shí)，病毒的活性會(huì)受到影響，從而影響制劑藥效的發(fā)揮[7]。懸浮劑以水為分散介質(zhì)，長(zhǎng)時(shí)間放置極易發(fā)生霉變和滋生細(xì)菌，從而影響制劑的藥效。因此需要添加合適的防腐劑來(lái)控制懸浮劑的穩(wěn)定性和壽命。常用的防腐劑主要有苯甲酸鈉、山梨酸鉀、農(nóng)藥專用防腐劑S-30等。S-30，因其對(duì)革蘭氏陽(yáng)性或陰性菌，霉菌及酵母菌都有較強(qiáng)的殺傷力，極少用量下就會(huì)有很好的防腐效果[8]，實(shí)驗(yàn)也證明了其防腐效果，用量在0.1%時(shí)制劑存放一個(gè)月也未見霉菌滋生，而常用防腐劑苯甲酸鈉用量0.3%時(shí)放置一個(gè)月即出現(xiàn)霉變，發(fā)臭等現(xiàn)象。

3.6 消泡劑的篩選

因?yàn)橹苿┲兴玫闹鷦┲写蠖喽紴楸砻婊钚詣?，所以在懸浮劑的研磨和高速剪切的過(guò)程中會(huì)將大量的空氣帶入，這時(shí)就會(huì)產(chǎn)生許多的泡沫，不僅會(huì)影響砂磨的效果而且還會(huì)影響制劑的藥效，有時(shí)還會(huì)給產(chǎn)品的包裝造成不便[9]。而且當(dāng)用量使用過(guò)大時(shí)，反而會(huì)影響制劑的穩(wěn)定性。在本實(shí)驗(yàn)中經(jīng)過(guò)對(duì)有機(jī)硅消泡劑、GY-X 60和消泡劑1501的篩選，最終確定 GY-X 60作為本實(shí)驗(yàn)的消泡劑，其用量少，消泡效果明顯，用量為0.2%。

3.7 配方篩選結(jié)果

通過(guò)對(duì)10億PIB/mL苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒懸浮劑不同配方的篩選，得到較佳的配方。結(jié)果見表4。

表4 配方篩選

3.8 性能指標(biāo)及測(cè)定結(jié)果

3.8.1 性能指標(biāo) 見表5。

表5 苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒性能指標(biāo)

3.8.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 穩(wěn)定性試驗(yàn)是為了模擬實(shí)際生產(chǎn)中制劑的儲(chǔ)存條件而進(jìn)行的指標(biāo)測(cè)試。根據(jù)表4的最佳配方，對(duì)10億PIB/mL苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒懸浮劑進(jìn)行低溫、熱貯穩(wěn)定性試驗(yàn)，結(jié)果顯示全部合格(表6)。

表6 10億PIB/mL苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒懸浮劑穩(wěn)定性測(cè)試結(jié)果

4 結(jié)論

微生物殺蟲劑的低毒、不產(chǎn)生抗藥性和將其研制成以水為介質(zhì)的懸浮劑不僅可以避免加工過(guò)程引起的粉塵飛揚(yáng)而且還減少了對(duì)環(huán)境的污染，符合綠色創(chuàng)新生產(chǎn)的要求。本產(chǎn)品具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)常用增稠劑在研磨過(guò)程中加入會(huì)增加研磨難度，降低研磨效率，經(jīng)過(guò)多次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)研磨結(jié)束后加入與防凍劑、防腐劑和余量的水調(diào)配好的增稠劑，混合均勻后效果與研磨過(guò)程中加入效果相同，但大大縮短了研磨時(shí)間，提高研磨效率，產(chǎn)品的外觀性能提高。(2)由苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒的作用機(jī)制可知，本實(shí)驗(yàn)制備的懸浮劑較化學(xué)類殺蟲劑相比，因具有專一性強(qiáng)，感染效率高，所以有使用量少的優(yōu)勢(shì)，另對(duì)環(huán)境無(wú)污染。(3)與現(xiàn)有的同種生物殺蟲劑相比較，長(zhǎng)時(shí)間放置粒徑無(wú)增大，并且無(wú)沉淀、無(wú)析水、無(wú)特殊異味出現(xiàn)。另本實(shí)驗(yàn)制得的懸浮劑，粒徑在5 μm以下，粒子分布較均勻，在低溫、熱貯后其分散性仍良好，懸浮率高，且其他各項(xiàng)指標(biāo)也均符合規(guī)定，使用安全，具有良好的市場(chǎng)前景。