離子遷移質(zhì)譜技術(shù)及其在脂質(zhì)分析中的應(yīng)用

吳邦富，魏 芳，謝 亞，徐淑玲，呂 昕，陳 洪

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所，農(nóng)業(yè)部油料加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部油料作物生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)室，油料脂質(zhì)化學(xué)與營養(yǎng)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430062)

脂質(zhì)是一類具有高度多樣性的生物分子，包含多種復(fù)雜脂質(zhì)種類，脂質(zhì)數(shù)據(jù)庫(LIPIDMAPS)最新數(shù)據(jù)顯示，確定結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)分子(包括計(jì)算生成)多達(dá)4萬多種，這些脂質(zhì)與其他物質(zhì)共同構(gòu)成生命體最基本的結(jié)構(gòu)、具有能量儲(chǔ)存以及信號(hào)傳導(dǎo)等生物功能的分子網(wǎng)絡(luò)，并與人體的生理健康和代謝狀況息息相關(guān)，是炎癥[1]、癌癥[2-3]及內(nèi)分泌失調(diào)[4]等諸多疾病的潛在生物標(biāo)記物。因此，對(duì)生物樣本的脂質(zhì)進(jìn)行分析具有非常重要的生物學(xué)意義。

但脂質(zhì)結(jié)構(gòu)的多樣性以及同類脂質(zhì)結(jié)構(gòu)的相似性為脂質(zhì)組學(xué)研究中的全脂質(zhì)分析提出了巨大挑戰(zhàn)，傳統(tǒng)的脂質(zhì)分析方法主要分為直接進(jìn)樣(Shotgun mass spectrometry,Shotgun-MS)和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)方法[5-6]，這兩種方法可以針對(duì)不同樣本需求進(jìn)行較高選擇性和靈敏度的脂質(zhì)分析。然而，與蛋白質(zhì)或多肽等分子不同，大部分脂質(zhì)分子的質(zhì)量分布范圍極窄(0～1 000 Da)，相同或相近分子質(zhì)量下存在大量的同分異構(gòu)體，傳統(tǒng)的色譜分離技術(shù)很難對(duì)其進(jìn)行分離。因此，為提高生物樣本中脂質(zhì)鑒定的可信度，需建立一種可對(duì)脂質(zhì)異構(gòu)體進(jìn)行分離的新技術(shù)。

離子遷移質(zhì)譜技術(shù)(Ion mobility mass spectrometry,IM-MS)，或離子淌度質(zhì)譜技術(shù)，是一種將離子遷移譜(Ion mobility spectrometry,IMS)與質(zhì)譜(MS)串聯(lián)的新型二維技術(shù)[7]，與傳統(tǒng)的色譜-質(zhì)譜串聯(lián)技術(shù)不同，它是將IMS置于離子源與質(zhì)量分析器之間，利用電離后離子在遷移譜緩沖氣體或電力場(chǎng)中的遷移速率不同對(duì)離子進(jìn)行篩選或分離，進(jìn)入質(zhì)譜后再按照質(zhì)荷比進(jìn)行分離和鑒定的技術(shù)。與單獨(dú)使用MS相比，IM-MS可以減少氣相離子中的干擾信號(hào)，從而提高譜圖清晰度、峰容量、選擇性和靈敏度。此外，這種新型技術(shù)還可與傳統(tǒng)色譜分離技術(shù)相結(jié)合，提供多一個(gè)維度的分離作用，提高目標(biāo)檢測(cè)物的選擇性和專一性。近年來，該技術(shù)得到了迅猛發(fā)展，已被廣泛用于蛋白質(zhì)[8-10]和代謝物[11-12]等生物大分子的分析中，尤其是在異構(gòu)體物質(zhì)分離、結(jié)構(gòu)表征以及構(gòu)象動(dòng)態(tài)學(xué)方面展現(xiàn)出強(qiáng)大的應(yīng)用潛力[13]。本文介紹了幾種常見的IMS技術(shù)及其結(jié)構(gòu)和原理，對(duì)IM-MS聯(lián)用技術(shù)在脂質(zhì)分析方面的應(yīng)用進(jìn)行綜述，并對(duì)其未來發(fā)展方向進(jìn)行了展望。

1 離子遷移譜與離子遷移質(zhì)譜技術(shù)概述

1.1 離子遷移譜的分類、結(jié)構(gòu)及原理

離子遷移譜是根據(jù)離子遷移率不同對(duì)離子進(jìn)行分離的技術(shù)，單獨(dú)的IMS也需配置一個(gè)電離源、分離室以及離子檢測(cè)器[14]。IMS與MS的根本區(qū)別在于MS中對(duì)離子的分離幾乎在真空條件下進(jìn)行，而IMS則根據(jù)離子與緩沖氣體的碰撞頻率或差分電壓實(shí)現(xiàn)離子的分離[14]。IMS根據(jù)其分離原理和結(jié)構(gòu)可分為不同的類型。

1.1.1漂移時(shí)間離子遷移譜漂移時(shí)間離子遷移譜(Drift time ion mobility spectrometry,DTIMS)是分離電離離子最傳統(tǒng)的設(shè)備，其分離室由一系列堆疊的環(huán)形電極組成(圖1A)，沿漂移管軸線產(chǎn)生均勻連續(xù)的電場(chǎng)，樣品離子通過離子門(每50～200 μs開1次)后形成離子群，然后在電場(chǎng)力作用下通過分離室，而中性氣體(主要是氮?dú)狻⒑饣驓鍤?的逆流從檢測(cè)區(qū)的一側(cè)引入，與樣品離子發(fā)生碰撞，不同離子具有不同的碰撞截面(CCS)，受到的碰撞力不同，從而到達(dá)離子檢測(cè)器的時(shí)間(DT)也不同[7]。在整個(gè)分離過程中，樣品中的非電離組分被漂移氣體移出漂移區(qū)。因緩沖氣體密度以及電場(chǎng)強(qiáng)度均為靜態(tài)，且漂移管長度也已知，所以DTIMS可以提供最高精度的離子遷移率測(cè)量，具有很高的分析分辨率。但由于離子氣體擴(kuò)散造成的離子損失較大，因此DTIMS的靈敏度較低[15]。

1.1.2行波離子遷移譜行波離子遷移譜(Travelling wave ion mobility spectrometry,TWIMS)與 DTIMS原理類似，但不同于其恒定電場(chǎng)，TWIMS的電場(chǎng)是與離子運(yùn)行方向平行的交變電場(chǎng)(圖1A)。其分離室由一系列疊層環(huán)離子導(dǎo)軌組成，然后在相鄰環(huán)形電極上施加一個(gè)反相射頻電壓(RF)，除產(chǎn)生使離子軸向運(yùn)動(dòng)的推動(dòng)力外，還會(huì)對(duì)離子產(chǎn)生一種徑向約束力以減少離子擴(kuò)散，提高離子的傳輸效率[15-16]。通過改變移動(dòng)電壓波的速度和大小，可以實(shí)現(xiàn)離子的遷移率分離。

1.1.3場(chǎng)不對(duì)稱離子遷移譜/差分離子遷移譜與前兩種IMS分離原理不同，場(chǎng)不對(duì)稱離子遷移譜(Field asymmetric ion mobility spectrometry,FAIMS)，或稱為差分離子遷移譜(Differential mobility spectrometry,DMS)通常由兩塊平行的平板或同軸的圓筒電極組成(圖1B)，兩電極之間施加非對(duì)稱波形的射頻電壓。離子除了在氣流方向運(yùn)動(dòng)外，還在射頻電場(chǎng)作用下沿著與載氣垂直的方向做上下振蕩運(yùn)動(dòng)。由于高低場(chǎng)離子遷移率系數(shù)的不同，在每個(gè)射頻電場(chǎng)周期內(nèi)，離子均會(huì)在垂直氣流方向上產(chǎn)生一個(gè)位移，經(jīng)過多個(gè)周期后離子會(huì)在上下極板上湮滅。如果在高頻電場(chǎng)上施加匹配的補(bǔ)償電壓(CV)，使離子在垂直氣流方向上的總位移小于其初始位置到極板的距離，則離子可以通過漂移室到達(dá)檢測(cè)端[15,17]。在FAIMS/DMS中，通常以CV表征不同的離子。由于離子在軸向方向上僅受氣流的作用，DMS能夠?qū)崿F(xiàn)正負(fù)離子的同時(shí)分離和檢測(cè)。

1.1.4俘獲離子遷移譜俘獲離子遷移譜(Trapped ion mobility spectrometry,TIMS)的工作原理與傳統(tǒng)離子遷移譜相反。TIMS是利用非均勻電場(chǎng)使離子在流動(dòng)的氣體中保持靜止?fàn)顟B(tài)，此時(shí)離子受到的氣體漂移力作用被電場(chǎng)力抵消，而離子群依據(jù)其尺寸與電荷的比值大小分離[18]。TIMS的通道類似漏斗(圖1C)，主要由漏斗型入口、遷移率分析區(qū)以及漏斗型出口三部分構(gòu)成。帶電離子首先通過漏斗型入口富集后隨氣流注入遷移率分析區(qū)(第一步：離子注入)。離子遷移率分析區(qū)由一系列施加RF電壓的電極組成，沿軸線方向分布著隨距離增大而增大的電場(chǎng)。注入的不同離子在尺寸和所帶電荷上存在差異，因此受到的氣流漂移力也不同，當(dāng)電場(chǎng)力增至與離子所受漂移力相同時(shí)，則離子在該區(qū)域停止，故不同離子會(huì)停留在不同的軸向位置(第二步：分離)。當(dāng)調(diào)節(jié)電場(chǎng)力減小時(shí)，離子群會(huì)根據(jù)各自尺寸與電荷之比從大到小依次從出口釋放，到達(dá)檢測(cè)器(第三步：釋放)[15]。雖然TIMS的工作原理與傳統(tǒng)DTIMS相反，但其物理原理相同。因此，前述的CCS同樣適用于TIMS[18]。

圖1 4種常見的離子遷移譜結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Schematics of 4 common kinds of ion mobility spectrometry A：DTIMS and TWIMS; B：FAIMS/DMS; C：TIMS

1.2 離子遷移質(zhì)譜技術(shù)

盡管單獨(dú)的IMS可以提供關(guān)于分析物尺寸、形狀以及電荷等用于鑒定目標(biāo)物的有用信息，但對(duì)于精準(zhǔn)判斷分析物的信息(如離子的質(zhì)量、結(jié)構(gòu)等)仍很難得到。MS也是一種利用電場(chǎng)分離離子的技術(shù)，具有靈敏度高、樣品用量少、分析速度快、分離和鑒定同時(shí)進(jìn)行等優(yōu)點(diǎn)。電噴霧電離、基質(zhì)輔助激光解吸電離和大氣壓化學(xué)電離等軟電離技術(shù)的出現(xiàn)，使得生物大分子的MS分析成為可能，并開發(fā)出一種新的質(zhì)譜——生物質(zhì)譜，且在生命科學(xué)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[19]。IM-MS技術(shù)結(jié)合了二者的優(yōu)點(diǎn)，且IMS的分離原理與傳統(tǒng)色譜完全不同，因此IM-MS可以很好地與色譜技術(shù)聯(lián)用，進(jìn)一步提高分析物的檢測(cè)靈敏度以及線性范圍[20]。另外，由于分析物離子在進(jìn)入質(zhì)譜質(zhì)量分析器之前首先在IMS中得到了一定的分離，一些雜質(zhì)離子被緩沖氣體吹出分離室或打到電極板上，因此MS分析的信噪比及峰容量得到了提高[21-22]。Arthur等[22]使用場(chǎng)不對(duì)稱離子遷移譜與液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(LC-FAIMS-MS)分析尿液樣本中代謝物時(shí)，由于背景信號(hào)的減少，其峰容積比LC-MS提高了3倍。同時(shí)，雜質(zhì)離子的減少也簡化了MS譜圖，降低了后期解譜和數(shù)據(jù)處理的復(fù)雜性。

2 離子遷移質(zhì)譜技術(shù)在脂質(zhì)分析中的應(yīng)用

對(duì)實(shí)際樣本中復(fù)雜脂質(zhì)分子進(jìn)行全面的定性定量分析是脂質(zhì)組學(xué)研究中最重要和最基礎(chǔ)的內(nèi)容。目前，最常見的脂質(zhì)定性定量分析方法主要有兩種：①將簡單前處理的分析樣品直接進(jìn)行質(zhì)譜分析(Shotgun-MS)；②對(duì)前處理好的樣品先進(jìn)行色譜分離再進(jìn)行質(zhì)譜分析(LC-MS)。這兩種方法已被廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物[23-25]、微生物[26]及人[27-28]等各種樣本中的脂質(zhì)分析，并且在脂質(zhì)鑒定過程中通常會(huì)與串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(MS/MS)聯(lián)用，如碰撞誘導(dǎo)解離或高能碰撞解離，從而可以根據(jù)碰撞后不同模式下產(chǎn)生的特征離子碎片判斷每種待測(cè)脂質(zhì)的酰基鏈和頭部基團(tuán)。Shotgun方法具有前處理簡單、分析時(shí)間短和掃描模式豐富靈活等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用較為廣泛。但由于其存在離子化抑制效應(yīng)且不同類別脂質(zhì)的含量差異較大，導(dǎo)致低豐度脂質(zhì)很難檢測(cè)。液相色譜根據(jù)脂質(zhì)的疏水性或極性可以實(shí)現(xiàn)較好的脂質(zhì)分離效果[29-30]，但其分離時(shí)間較長，一般需數(shù)十分鐘，甚至數(shù)小時(shí)，并且對(duì)某些脂質(zhì)的分離效果差，易出現(xiàn)共洗脫。IM-MS分離時(shí)間極短(ms)，與傳統(tǒng)脂質(zhì)分析方法聯(lián)用(圖2)，不僅可以大大縮減脂質(zhì)分離時(shí)間，且對(duì)一些結(jié)構(gòu)相似的同分異構(gòu)體脂質(zhì)有非常好的分離效果。IM-MS在脂質(zhì)分析方面的應(yīng)用主要包括提高脂質(zhì)分析選擇性和分辨率以及分離鑒定同分異構(gòu)體兩個(gè)方面。

圖2 IMS與傳統(tǒng)脂質(zhì)分析方法聯(lián)用的工作流程圖Fig.2 Workflow of IMS combined with traditional lipidomic approaches

2.1 提高脂質(zhì)分析的選擇性與分辨率

在傳統(tǒng)脂質(zhì)鑒定流程中，主要通過將測(cè)定的脂質(zhì)分子質(zhì)量數(shù)與數(shù)據(jù)庫中標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量數(shù)或標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行匹配實(shí)現(xiàn)脂質(zhì)分子的確定，脂質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)信息則通過二級(jí)特征離子碎片信息判斷。但生物樣品復(fù)雜的基質(zhì)以及脂質(zhì)分子種類繁多成為限制這些技術(shù)應(yīng)用的主要障礙。因此需更多與脂質(zhì)分子物理化學(xué)性質(zhì)相關(guān)的參數(shù)作為鑒定不同脂質(zhì)分子的參考指標(biāo)。

2.1.1DT值或CCS值脂質(zhì)離子的CCS值代表脂質(zhì)離子與緩沖氣體之間可以發(fā)生碰撞的有效面積[31]。在DTIMS、TWIMS和TIMS儀器中，CCS值常被用作分離脂質(zhì)離子的參數(shù)，該值與脂質(zhì)離子自身的尺寸、形狀及所帶電荷緊密相關(guān)，可看作是脂質(zhì)離子固有的物理化學(xué)特性，與實(shí)驗(yàn)條件及設(shè)備差異無關(guān)[32]。在傳統(tǒng)帶有均勻電場(chǎng)的DTIMS中，可直接由DT值計(jì)算得到CCS值；而在TWIMS等儀器中，則通過已知CCS值標(biāo)準(zhǔn)品的DT值計(jì)算得到CCS值[33]。一些較先進(jìn)的儀器能夠自動(dòng)完成計(jì)算過程并直接顯示測(cè)定物質(zhì)的CCS 值[34-35]。

不同脂質(zhì)離子因其碳鏈長度、雙鍵數(shù)以及空間構(gòu)象不同而具有不同的DT值或CCS值。2009年，Kim等[36]利用TWIMS串聯(lián)正交加速飛行時(shí)間質(zhì)譜(oa-TOFMS)測(cè)定了氮?dú)鈿夥障沦|(zhì)量數(shù)范圍為400～1 000 Da的磷脂酰膽堿(Phosphatidylcholine,PC)的質(zhì)荷比(m/z)與DT之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)飽和PC的m/z與DT之間存在線性關(guān)系，且PC?；溕系牟伙柡玩I會(huì)導(dǎo)致DT值減小5%，每增加1個(gè)不飽和鍵，DT值會(huì)減少1%。Zhang等[37]在脂肪酸(Fatty acids,FAs)的CCS測(cè)定中也發(fā)現(xiàn)了類似規(guī)律，他們利用一個(gè)內(nèi)嵌有漂移管的電噴霧飛行時(shí)間質(zhì)譜(ESI-IM-QTOF)測(cè)定了18種FAs的CCS值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在飽和脂肪酸中,其CCS值與m/z呈線性關(guān)系。而雙鍵的增加則會(huì)減小FAs的CCS值，但影響比酰基鏈長度要小。其原因?yàn)殡p鍵的存在會(huì)使?；溤陔妶?chǎng)中呈彎曲結(jié)構(gòu)，從而使CCS值減小。同時(shí)他們還發(fā)現(xiàn)順式脂肪酸異構(gòu)體的CCS值小于同種反式異構(gòu)體。除碳鏈長度和雙鍵數(shù)外，脂質(zhì)離子的空間構(gòu)象對(duì)其CCS值也有非常大的影響，不同種類的脂質(zhì)離子之間CCS值差異更大。Paglia等[38]將TWIMS與兩種傳統(tǒng)脂質(zhì)鑒定方法(LC-MS和Shotgun-MS)相結(jié)合，提高了脂質(zhì)鑒定的分辨率和可信度。該方法通過測(cè)定人大腦中13類共244種脂質(zhì)的CCS值，發(fā)現(xiàn)在以脂質(zhì)m/z為橫坐標(biāo)，CCS為縱坐標(biāo)的坐標(biāo)體系中，不同類別和亞類的脂質(zhì)均分布在不同區(qū)域，可以實(shí)現(xiàn)很好地區(qū)分，且同亞類脂質(zhì)的CCS與其m/z之間也呈線性關(guān)系。同時(shí)，研究結(jié)果也表明脂質(zhì)的CCS值具有高度可重復(fù)性，不受實(shí)驗(yàn)室和儀器的影響(RSD<3%)。

為驗(yàn)證所測(cè)CCS值的準(zhǔn)確性，很多研究者利用脂質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物測(cè)得或利用計(jì)算機(jī)建模計(jì)算生成CCS值，建立了脂質(zhì)CCS標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫[38-39]。Zhou等[40]利用基于機(jī)器學(xué)習(xí)的預(yù)測(cè)模式對(duì)脂質(zhì)分子的CCS值進(jìn)行準(zhǔn)確預(yù)測(cè)，并建立了巨大的脂質(zhì)CCS值數(shù)據(jù)庫(LipidCCS)。首先采用大量脂質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)得的CCS值建立預(yù)測(cè)模型，同時(shí)使用生物信息學(xué)手段優(yōu)化結(jié)構(gòu)分子描述符，使該系統(tǒng)在不同實(shí)驗(yàn)室、不同儀器條件下測(cè)得的數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)的CCS值中位相對(duì)誤差在1%以下。LipidCCS數(shù)據(jù)庫包含有15 646種脂質(zhì)共63 434個(gè)CCS值，并提供了免費(fèi)的網(wǎng)絡(luò)端口，從而為基于IM-MS的大規(guī)模脂質(zhì)組學(xué)研究提供了重要的分析手段。利用這些脂質(zhì)CCS數(shù)據(jù)庫與實(shí)驗(yàn)測(cè)得的CCS進(jìn)行匹配后評(píng)分，可減少假陽性和假陰性的判斷。

2.1.2CV值在FAIMS或DMS儀器中，CV值常被用作脂質(zhì)分離和判別的指標(biāo)。如Shvartsburg等[41]在2011年首次將DMS應(yīng)用于脂質(zhì)分離，利用CV值對(duì)不同種類脂質(zhì)(磷脂、溶血磷脂、甘油酯、半乳糖脂和鞘脂等)進(jìn)行了很好的區(qū)分。此外，在CV值差異不明顯時(shí)，還可以通過改變一些外部條件從而實(shí)現(xiàn)更好的脂質(zhì)分離效果。因此，當(dāng)一些公司研發(fā)的商業(yè)DMS(如ABSciex研發(fā)的SelexION系列)在常規(guī)設(shè)置無法實(shí)現(xiàn)很好的離子分離效果時(shí)，可以通過在載氣中添加揮發(fā)性的化學(xué)修飾劑(如異丙醇等)，以進(jìn)一步增大分析離子之間CV值的差異，提高分析離子的選擇性和峰強(qiáng)度[42-44]。2014年，Ekroos等[45]將DMS與Shotgun-MS技術(shù)串聯(lián)分離鑒定磷脂，選擇正丙醇、2-丙醇、正丁醇、正庚烷和氯仿5種化學(xué)修飾劑測(cè)試磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸和磷脂酰甘油的分離效果。發(fā)現(xiàn)在同一質(zhì)譜條件下，當(dāng)不使用修飾劑時(shí)，只有PC可從這些磷脂中分離。而使用正丙醇或異丙醇作為化學(xué)修飾劑時(shí)，檢測(cè)的分辨率最高。脂質(zhì)離子自身的質(zhì)荷比對(duì)其CV值也有一定影響，故相同類別不同亞類的脂質(zhì)也可以根據(jù)最優(yōu)CV值進(jìn)行分離。一般而言，碳鏈長度越長，最優(yōu)CV值越大，而雙鍵的存在則會(huì)降低脂質(zhì)的CV值，這與CCS值的變化趨勢(shì)一致。此外，由于帶電離子在DMS中會(huì)受到垂直運(yùn)行方向的電場(chǎng)力作用，而不同離子的CV值存在差異，只有特異性的脂質(zhì)離子才能在最優(yōu)CV值下通過DMS到達(dá)檢測(cè)器，因此DMS的背景噪音非常小，信噪比很高，其檢測(cè)靈敏度相對(duì)更高[46-47]。

2.2 分離鑒定脂質(zhì)異構(gòu)體

脂質(zhì)異構(gòu)體的分離鑒定是脂質(zhì)分析中最大的挑戰(zhàn)之一，相同質(zhì)量數(shù)的脂質(zhì)分子可能屬于不同的脂質(zhì)種類(如PC32∶2和PS36∶1)，也可能是雙鍵位置不同或?；溛恢卯悩?gòu)(sn-1和sn-2)或空間結(jié)構(gòu)異構(gòu)(順反異構(gòu)體和手性異構(gòu)體)的同類脂質(zhì)分子[48]。當(dāng)這些同分異構(gòu)體存在于復(fù)雜生物樣本中時(shí)，在不借助分離手段或者其他前處理的情況下，即使用高分辨質(zhì)譜也無法對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確分析。LC-MS方法在一定程度上可以用于一些脂質(zhì)異構(gòu)體標(biāo)準(zhǔn)品，如?；溛恢卯悩?gòu)或含雙鍵的順反異構(gòu)體的分離鑒定，但對(duì)于復(fù)雜基質(zhì)樣本中同分異構(gòu)體的精準(zhǔn)判斷卻存在困難，許多同分異構(gòu)體會(huì)共洗脫或產(chǎn)生相似的圖譜。其他方法如低能碰撞誘導(dǎo)解離[49]、有機(jī)物離子的電子碰撞激發(fā)[50]、臭氧誘導(dǎo)解離[51-52]和PB衍生反應(yīng)[53]等也能對(duì)異構(gòu)體脂質(zhì)進(jìn)行鑒定，但需對(duì)質(zhì)譜進(jìn)行改造或者采用復(fù)雜的樣品前處理過程。IM-MS技術(shù)可根據(jù)異構(gòu)體的結(jié)構(gòu)和形狀進(jìn)行分離，將其與傳統(tǒng)色譜分離手段相結(jié)合，提高了分離選擇性，從而為脂質(zhì)異構(gòu)體的分離提供了一個(gè)新的維度。

2.2.1雙鍵位置及空間異構(gòu)體脂肪酸是所有脂質(zhì)的基本組成單元，其鏈上雙鍵位置不同可以形成不同的異構(gòu)體。DTIMS-MS可以根據(jù)單不飽和脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品內(nèi)部雙鍵“紐結(jié)(Kink)”結(jié)構(gòu)的CCS值差異對(duì)其異構(gòu)體進(jìn)行區(qū)分和鑒定[54]。Groessl等[55]于2015年首次證明了使用高分辨DTIMS-MS對(duì)雙鍵位置異構(gòu)體脂質(zhì)進(jìn)行分離的可行性，考察了不同離子加合物(H+、Na+、K+)對(duì)PC18∶1(6Z)/18∶1(6Z)、PC18∶1(9Z)/18∶1(9Z)以及PC18∶1(9E)/18∶1(9E)CCS值的影響。結(jié)果表明Na+加合物的CCS值差異最大，并成功應(yīng)用于復(fù)雜生物樣本(牛心臟、豬腦和酵母)中PC 18∶1(9Z)/18∶1(9Z)的鑒定。Kyle等[54]也發(fā)現(xiàn)由于單不飽和脂肪酸中呈順式方向的雙鍵會(huì)使主鏈比反式方向更彎曲，從而具有更小的CCS值，據(jù)此分離了順反異構(gòu)體單不飽和脂肪酸。另外，在順式單不飽和脂肪酸中，當(dāng)雙鍵位置遠(yuǎn)離羧基端時(shí)，也會(huì)使整個(gè)脂肪酸鏈更彎曲，導(dǎo)致更小的空間構(gòu)象。同樣地，在甘油磷脂的異構(gòu)體鑒定中，Wojcik等[56]發(fā)現(xiàn)當(dāng)PC?；溕系膯蝹€(gè)雙鍵位置越靠近其頭部基團(tuán)時(shí)，整個(gè)PC分子的空間構(gòu)象也會(huì)變大。DMS/FAIMS-MS也在雙鍵位置異構(gòu)體鑒定中有著重要的應(yīng)用。Bowman等[57]利用高電場(chǎng)FAIMS-MS成功對(duì)甘油酯和甘油磷脂的雙鍵位置異構(gòu)體進(jìn)行分離和鑒定。本實(shí)驗(yàn)室使用DMS-Q TOF MS對(duì)C17∶1雙鍵順反異構(gòu)體(C17∶1(10Z)和C17∶1(10E))進(jìn)行了分離，發(fā)現(xiàn)當(dāng)分離電壓(SV)為3 200 V時(shí)，兩種異構(gòu)體不能分離；當(dāng)SV為3 900 V時(shí)，在CV值為最優(yōu)(8 V和11 V)時(shí)，兩種異構(gòu)體的分離效果很好。說明在適宜參數(shù)下，DMS-MS也可以對(duì)雙鍵位置異構(gòu)體進(jìn)行準(zhǔn)確地判別。

2.2.2sn位置異構(gòu)體另一類脂質(zhì)異構(gòu)體是由于脂肪酸位于脂質(zhì)骨架分子的不同位置(sn-1、sn-2、sn-3)所致，統(tǒng)稱為位置異構(gòu)體。Kyle等[54]采用DTIMS對(duì)不同脂肪酸位置異構(gòu)的PC(如PC16∶0/18∶0和 PC18∶0/16∶0)進(jìn)行分離，發(fā)現(xiàn)當(dāng)較長的?；溸B接在sn-1位時(shí)，整個(gè)PC分子的構(gòu)象大于連接在sn-2位。但雙鍵的存在會(huì)使?；湷叽鐪p小(如18∶1<16∶0)，所以含雙鍵?；溸B接在sn-1時(shí)，其分子尺寸會(huì)小于該位置為飽和脂肪酸的脂質(zhì)分子。Groessl等[55]使用Ag+與PC 16∶0/18∶1和PC18∶1/16∶0形成加合物，成功將其在高分辨DTIMS-MS中分離鑒定，并采用該方法在豬腦提取物樣本中發(fā)現(xiàn)存在88%的PC 16∶0/18∶1和12%的PC18∶1/16∶0。DMS-MS同樣也在位置異構(gòu)體鑒定中展現(xiàn)出巨大的潛力。Maccarone等[58]利用DMS-ESI MS在不同CV值下分離了Ag+與PC 16∶0/18∶1和PC18∶1/16∶0的加合物，可對(duì)PC的sn位置異構(gòu)體相對(duì)含量進(jìn)行準(zhǔn)確定量，結(jié)果與傳統(tǒng)磷脂酶水解法一致，并將其應(yīng)用于雞蛋黃、牛腎、牛腦中PC異構(gòu)體的測(cè)定。ala等[59]利用類似的方法，以1-丁醇或1-丙醇為化學(xué)修飾劑，用DMS成功分離了含不飽和脂肪酰基鏈的甘油三酯位置異構(gòu)體。與傳統(tǒng)的銀離子法或反相高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法相比，優(yōu)化的DMS-MS方法可在1 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)所有異構(gòu)體的分離，大大提高了分析通量。利用該方法測(cè)定了豬脂肪組織提取物中OSO/SOO、SOS/SSO、POP/OPP和OPO/OOP 4對(duì)不同甘油三酯位置異構(gòu)體的相對(duì)含量，結(jié)果與傳統(tǒng)方法一致。

2.2.3手性異構(gòu)體脂質(zhì)分子內(nèi)部手性中心的判斷，即手性異構(gòu)體脂質(zhì)的分離鑒定屬于脂質(zhì)異構(gòu)體鑒定中的難題。研究報(bào)道[60]，將手性助劑(如2-丁醇的對(duì)映異構(gòu)體)摻入DTIMS-MS裝置漂移氣體中時(shí)，一些氨基酸、葡萄糖等的手性異構(gòu)體可以實(shí)現(xiàn)一定的分離。2013年，Ahonen等[61]對(duì)激素類固醇手性異構(gòu)體(α-雌二醇/β-雌二醇、3α-雄酮/3β-雄酮和17α-睪酮/17β-睪酮)進(jìn)行衍生化處理后，用TWIMS-MS對(duì)其進(jìn)行了分離。由于原始的固醇異構(gòu)體之間的CCS值非常接近，很難直接分離，而與對(duì)甲磺?；惽杷狨パ苌磻?yīng)后，異構(gòu)體間的CCS值差異增大，且離子與漂移氣體間相互作用的強(qiáng)度增加，從而改善了其在IMS中的分離效果。Kyle等[54]使用DTIMS-MS在正離子模式下對(duì)神經(jīng)酰胺手性異構(gòu)體Cer(d18∶1/18∶0(2S-OH) )和Cer(d18∶1/18∶0(2R-OH))的鈉加合物進(jìn)行分離。當(dāng)鈉離子結(jié)合到R構(gòu)型的Cer時(shí)，2-OH基團(tuán)會(huì)遠(yuǎn)離長?；?，使兩條?；溇o密且結(jié)構(gòu)緊湊；而在S構(gòu)型的Cer中2-OH基團(tuán)會(huì)靠近長酰基鏈，從而導(dǎo)致兩條酰基鏈互相之間排斥，形成更大的結(jié)構(gòu)。這兩種不同結(jié)構(gòu)會(huì)使二者CCS的差異增大，從而實(shí)現(xiàn)兩種手性異構(gòu)體的分離。

3 總結(jié)與展望

IMS作為一種分離手段，已被越來越多地應(yīng)用于脂質(zhì)組學(xué)研究中，尤其是隨著一些數(shù)據(jù)處理軟件的開發(fā)，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)IM-MS提供的關(guān)于脂質(zhì)離子信息的自動(dòng)處理，從而為大規(guī)模脂質(zhì)組學(xué)研究帶來了新的契機(jī)。將IMS與傳統(tǒng)基于MS的脂質(zhì)分析方法相結(jié)合，首先為脂質(zhì)鑒定提供了更多關(guān)于分子結(jié)構(gòu)和構(gòu)象方面的信息(CCS值、DT值、CV值)，有效地提高了脂質(zhì)，尤其是異構(gòu)體脂質(zhì)的分離效果，同時(shí)排除了假陽性和假陰性干擾；其次，減少了背景噪音的干擾，提高了信噪比，使脂質(zhì)離子的譜圖更加清晰，為解譜工作帶來了很大便利；最后，相對(duì)于傳統(tǒng)分離手段，IMS可在ms時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)離子的分離，可與MS技術(shù)實(shí)現(xiàn)完美結(jié)合，且不影響樣品分析時(shí)間，從而提高樣品的分析通量。

近年來，各種分析儀器的快速發(fā)展以及新分析方法的不斷開發(fā)和涌現(xiàn)為脂質(zhì)組學(xué)的研究提供了新的發(fā)展方向。使用單獨(dú)的某一種技術(shù)很難實(shí)現(xiàn)復(fù)雜生物樣本中所有脂質(zhì)的分離和鑒定，未來的脂質(zhì)組學(xué)研究一定是基于各種技術(shù)和儀器的聯(lián)用。新的快速分離分析手段也將日益得到研究者的重視，IM-MS技術(shù)就是這一背景下的產(chǎn)物，相信這一技術(shù)在未來的脂質(zhì)組學(xué)研究中將扮演更加重要的角色。