黃連素抑制小鼠CXCL-12/CXCR-4/PI3K/AKT/NF-κB通路防治NASH的作用研究

李玲 呂惠卿

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)護(hù)理學(xué)院 杭州 310053 2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院

非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一種與胰島素抵抗和遺傳易感性相關(guān)的代謝性應(yīng)激性肝損傷，疾病譜包括單純性脂肪性肝病、脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）及其相關(guān)肝硬化。據(jù)統(tǒng)計(jì)，美國、歐洲及日本成人中NASH的患病率約為10%～30%[1-3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，NASH不再是良性病變，可發(fā)展為肝纖維化、肝硬化，甚至急性肝衰竭，從而引起一系列并發(fā)癥[4]，也是單純性脂肪肝向肝纖維化進(jìn)展的關(guān)鍵步驟，但其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。加強(qiáng)NASH的發(fā)病機(jī)制及診治研究，對(duì)防治肝纖維化和肝硬化具有重要意義。

趨化因子是具有化學(xué)趨化作用的分泌型小分子多肽，在細(xì)胞的增殖、分化和凋亡的過程中發(fā)揮著重要的作用。肝臟損傷，肝實(shí)質(zhì)炎癥、壞死，肝星狀細(xì)胞激活，細(xì)胞外基質(zhì)沉積被認(rèn)為是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)。Mavier等[5]證實(shí)CXC趨化因子配體-12（CXC chemokine ligand-12，CXCL-12）和CXC趨化因子受體-4（CXC chemokine receptor-4，CXCR-4）軸參與肝臟損傷修復(fù)。研究還證實(shí)，與CXCL-12/CXCR-4軸相關(guān)的磷酸肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蘇氨酸蛋白激酶（acid threonine protein kinase，AKT）信號(hào)通路是維持細(xì)胞正常生理功能的信號(hào)通路之一，阻斷該通路能顯著抑制肝星狀細(xì)胞活化并促進(jìn)其凋亡[6]。核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）作為一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，廣泛存在于全身多種細(xì)胞，參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)及細(xì)胞增殖與凋亡的過程，研究發(fā)現(xiàn)在NAFLD患者及動(dòng)物模型的肝組織中均存在NF-κB的激活[7-9]。

黃連素又稱為小檗堿，是一種從黃連、黃柏和白毛莨等植物中提取的季銨型異喹啉類生物堿。臨床研究發(fā)現(xiàn)，黃連素聯(lián)合益肝靈治療代謝綜合征合并NASH取得了良好的效果[10]。本研究試圖建立NASH小鼠模型，進(jìn)一步研究黃連素對(duì)NASH小鼠CXCL-12/CXCR-4/PI3K/AKT/NF-κB信號(hào)通路的影響以及相關(guān)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 雄性SPF級(jí)ApoE基因敲除小鼠27只，體質(zhì)量18～22g，購于南京動(dòng)物模式研究所[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(蘇)2010-0001]，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物房[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(浙)2013-0184]。飼養(yǎng)條件：每籠 5 只，溫度(22±1)℃，濕度 40%～70%，明暗各 12h，每日更換飲水及飼料，保持通風(fēng)及清潔衛(wèi)生。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為3組，模型組(9只)、黃連素組（10只）和對(duì)照組（8只）。3組小鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。模型組中1只小鼠飼養(yǎng)4周后發(fā)現(xiàn)牙齒嚴(yán)重畸形，故棄去。

1.2 主要試劑 高脂高膽固醇飼料配方為：20%蛋白質(zhì)、50%碳水化合物、21%脂肪和0.21%膽固醇，購于加拿大 Research Diet公司（批號(hào)：D12079B）；黃連素購于Sigma-aldrich（上海）貿(mào)易有限公司（批號(hào)：SLBM9643V）；抗CXCR-4多克隆抗體、抗磷酸化核因子-κB（phosphorylated nuclear factor-κB，pNF-κB）p65多克隆抗體均購于Abcam公司（批號(hào)：GR69382-12、3039S-6）；抗CXCL-12兔多克隆抗體購于Santa Cruz公司（批號(hào)：SC-28876:1113）；抗 PI3K p85兔多克隆抗體、抗AKT兔單克隆抗體、抗磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated protein kinase B，pAKT）兔單克隆抗體、抗NF-κB p65兔單克隆抗體、抗β-actin兔單克隆抗體均購于Cell signaling公司（批號(hào)：4257S-6、2938S-0004、4060S-0016、8242S、4070S-12）；山羊抗兔二抗IgG購于麥約爾生物公司（批號(hào)：HSA0003）；DAB顯色劑、免疫組化兩步試劑盒均購于中杉金橋公司（批號(hào)：K142717D、WK141514）；Trizol試劑購于美國Invitrogen公司（批號(hào)：79407）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于上海Roche公司（批號(hào)：4897030001）。

1.3 主要儀器 化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購于美國Bio-Rad公司；ABI prism 7900 HT fast Real-time PCR system為Biometra公司產(chǎn)品；石蠟切片機(jī)購于德國Leica公司；正置雙目顯微鏡為日本Nikon公司產(chǎn)品；熒光顯微鏡購于日本Olympus公司；熒光定量PCR儀購于AB Applied Biosystem公司。

1.4 動(dòng)物模型建立 模型組和黃連素組小鼠給予高脂高膽固醇飼料喂養(yǎng)，對(duì)照組用普通飼料，各組均連續(xù)喂養(yǎng)12周；黃連素組以高脂高膽固醇飼料喂養(yǎng)6周后，每天予以200mg/（kg·d）的黃連素灌胃，持續(xù)6周[11]；模型組以高脂肪高膽固醇飼料喂養(yǎng)6周后，每天予以同體積蒸餾水灌胃，持續(xù)6周。

1.5 血清指標(biāo)檢測及病理標(biāo)本制作 造模12周后，末次給予飼料后禁食12h，各組小鼠眼底靜脈叢采血，室溫靜置1h后3 000r/min離心15min，分離血清，-20℃保存，采用日立7180全自動(dòng)生化分析儀測定血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase,ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase,AST）、總膽固醇（total cholesterol,TC）、甘油三酯（triglyceride,TG）水平。處死小鼠，完整分離肝臟，測量肝臟濕重，計(jì)算肝指數(shù)，肝指數(shù)=肝臟濕重/體重。由肝左葉固定部位取3mm×3mm大小肝組織用于制備冰凍切片，另取3mm×3mm大小肝組織放入10%多聚甲醛，制備肝臟石蠟切片標(biāo)本，用于病理檢查、免疫組化染色，其他部分在液氮中速凍后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存，用于mRNA檢測。

1.6 其他檢測指標(biāo)

1.6.1 肝臟病理學(xué)檢查 肝組織石蠟切片行HE染色，觀察肝組織炎癥活動(dòng)度和纖維化程度，參照美國國立衛(wèi)生研究院NASH臨床研究網(wǎng)絡(luò)病理工作組評(píng)分系統(tǒng)進(jìn)行NAFLD活動(dòng)度評(píng)分（NAFLD activity score，NAS），NAS的計(jì)算選取可恢復(fù)性組織學(xué)病變指標(biāo)，包括脂肪變0～3分，小葉內(nèi)炎癥0～2分，肝細(xì)胞氣球樣變 0～2 分，總積分值 0～8 分[12-13]。

1.6.2 Real-time PCR檢測肝組織CXCR-4、CXCL-12、PI3K、AKT、NF-κB mRNA 表達(dá) 取肝組織約50mg，以Trizol試劑提取總RNA后，依據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA第一鏈，熒光定量PCR擴(kuò)增目的基因的cDNA片段，PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10min，95℃ 15s，60℃ 1min，共 40 個(gè)循環(huán)，95℃ 15s，60℃ 15s，95℃ 15s。實(shí)驗(yàn)所用引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。見表1。ΔCT1=對(duì)照組目的基因CT值-對(duì)照組內(nèi)參基因CT值，ΔCT2=實(shí)驗(yàn)組目的基因CT值-實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參基因CT值，ΔΔCT=ΔCT2-ΔCT1。代入公式2-ΔΔCT計(jì)算，即得到實(shí)驗(yàn)組mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.6.3 免疫組化檢測肝組織CXCR-4、CXCL-12、AKT、pAKT、NF-κB 及 pNF-κB 蛋白表達(dá) 石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，3%H2O2封閉，高壓修復(fù)，加封閉液后，滴加兔抗鼠多克隆抗體CXCR-4（1:50）、CXCL-12（1:50）、pNF-κB（1:100），兔抗鼠單克隆抗體AKT（1:400）、pAKT（1:50）、NF-κB（1:800），4℃過夜，次日加生物素化羊抗兔IgG，37℃孵育30min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片，光鏡下觀察。

1.6.4 Western blot檢測肝組織 CXCR-4、CXCL-12、PI3K、AKT、pAKT、NF-κB 及 pNF-κB 蛋白表達(dá) 肝組織總蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后，采用半干電轉(zhuǎn)移將蛋白質(zhì)分子轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，置于含5%牛血清白蛋白的封閉緩沖液中室溫下封閉1.5h，TBST洗膜3次，加入一抗，4℃反應(yīng)過夜。PI3K、AKT、NF-κB、β-actin抗體稀釋比例均為 1:1 000，CXCR-4、CXCL-12、pNF-κBp65抗體稀釋比例均為1:500，pAKT抗體稀釋比例為1:2 000，。次日TBST洗膜3次，加入稀釋比例為1:5 000的二抗。室溫下孵育1h，TBST洗膜3次，ECL試劑盒顯色，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)采集圖像并進(jìn)行分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，檢驗(yàn)數(shù)據(jù)正態(tài)性，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布數(shù)據(jù)組間比較采用秩和檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠體質(zhì)量及血脂、肝功能指標(biāo)比較 12周時(shí)模型組小鼠體質(zhì)量、ALT、AST、TC、TG水平明顯高于對(duì)照組（P＜0.01）；黃連素組小鼠體質(zhì)量低于模型組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），與對(duì)照組比較也無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），黃連素組小鼠的 ALT、AST、TC水平明顯低于模型組（P＜0.05），TG水平雖然低于模型組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組小鼠體質(zhì)量及血脂、肝功能指標(biāo)比較Tab.2 Comparison of body mass,blood lipid and liver function indexes in each group

2.2 各組小鼠肝臟病理學(xué)觀察 HE染色顯示，對(duì)照組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝索由中央靜脈向外周呈放射狀，肝細(xì)胞形態(tài)均勻，細(xì)胞質(zhì)均質(zhì)紅染，細(xì)胞內(nèi)未見脂滴，其余均無異常發(fā)現(xiàn)。隨著造模時(shí)間延長，模型組肝臟脂肪變性程度逐漸加重，肝索紊亂，肝竇變小，肝細(xì)胞體積增大，呈圓形，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有大量圓形空泡，將細(xì)胞核擠到一側(cè)，部分可見氣球樣變性。見圖1。模型組的NAS總分均超過5分，達(dá)到了NASH的診斷標(biāo)準(zhǔn)。三組間比較，脂肪變、氣球樣變、小葉內(nèi)炎癥、NAS總分均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。見表3。進(jìn)一步比較提示，黃連素組氣球樣變、小葉內(nèi)炎癥較模型組減輕，NAS總分也低于模型組（P＜0.05），但脂肪變與模型組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

圖1 各組小鼠肝臟切片病理學(xué)形態(tài)比較（HE染色，400×）Fig.1 Pathological morphological comparison of liver slices in each group(HE staining,400×)

表3 各組小鼠肝脂肪變、氣球樣變、小葉內(nèi)炎癥及NAS比較Tab.3 Liver fat change,balloon-like change,intra-lobular inflammation and NAS comparison in each group

2.3 各組小鼠 CXCR-4、CXCL-12、PI3K、AKT、NF-κB mRNA表達(dá)比較 研究結(jié)果顯示，模型組CXCR-4、CXCL-12、PI3K、AKT、NF-κB mRNA 表達(dá)水平均高于對(duì)照組（P＜0.05）,黃連素組的上述指標(biāo)則明顯低于模型組（P＜0.05）。見表 4。

表4 各組小鼠 CXCR-4、CXCL-12、PI3K、AKT、NF-κB mRNA 表達(dá)比較Tab.4 Comparison of expression of CXCR-4,CXCL-12,PI3K,AKT and NF-κB mRNA in each group

2.4 免疫組化檢測各組小鼠肝組織CXCR-4、CXCL-12、AKT、pNF-κB蛋白表達(dá) 對(duì)照組小鼠肝組織中CXCR-4僅在肝竇內(nèi)皮細(xì)胞弱表達(dá)；模型組CXCR-4在肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、中央靜脈、肝細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜均呈陽性表達(dá)，染色呈棕黃色；黃連素組肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜也呈陽性表達(dá)，染色呈棕黃色，但鏡下觀察可見，陽性表達(dá)細(xì)胞少于模型組。對(duì)照組CXCL-12在肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、中央靜脈周圍有弱表達(dá)；模型組CXCL-12在肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜呈陽性表達(dá)，染色呈棕黃色；黃連素組CXCL-12在肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜也呈陽性表達(dá)，染色呈棕黃色，但鏡下觀察可見，陽性表達(dá)細(xì)胞少于模型組。對(duì)照組pAKT在肝竇內(nèi)皮細(xì)胞弱表達(dá)；模型組pAKT在肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜呈陽性表達(dá)，染色呈棕黃色；而黃連素組pAKT在肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜也呈陽性表達(dá)，染色呈棕黃色，但鏡下觀察可見，陽性表達(dá)細(xì)胞少于模型組。對(duì)照組pNF-κB無陽性表達(dá)；模型組肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核染色呈陽性表達(dá)，染色呈棕黃色；黃連素組pNF-κB在肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核也呈陽性表達(dá)，染色呈棕黃色，但鏡下觀察可見，陽性表達(dá)細(xì)胞少于模型組。見圖2-5。

2.5 各組小鼠肝組織 CXCR-4、CXCL-12、AKT、pAKT、NF-κB、pNF-κB 蛋白表達(dá)比較 Western blot結(jié)果表明，模型組CXCR-4、CXCL-12蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組（均 P＜0.05），pAKT 和 pNF-κB 蛋白表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組（均P＜0.01）；黃連素組CXCR-4、CXCL-12、pAKT蛋白表達(dá)水平低于模型組（均P＜0.05），而pNF-κB蛋白表達(dá)水平顯著低于模型組（P＜0.01）。見圖 6-12。

圖2 各組小鼠CXCR-4表達(dá)比較（400×）Fig.2 Comparison of CXCR-4 expression in each group(400×)

3 討論

CXCL-12/CXCR-4生物軸在介導(dǎo)炎癥及免疫反應(yīng)、維持胚胎發(fā)育、調(diào)控造血、誘導(dǎo)血管生成、腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等多種生理和病理過程中發(fā)揮著重要作用[14-15］。其通路主要包括PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)途徑、絲裂素活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）途徑和兩面神激酶/信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子（Janus kinase/signal transducers and activators of transcription，JAK/STAT）途徑。在慢性肝疾病中，肝星狀細(xì)胞的激活與轉(zhuǎn)化是肝纖維化形成的關(guān)鍵，而PI3K/AKT信號(hào)通路是肝星狀細(xì)胞活化過程中非常重要的部分，阻斷該通路能顯著抑制肝星狀細(xì)胞活化并促進(jìn)其凋亡[6]。姚鵬等[16]采用絲裂霉素誘導(dǎo)肝干細(xì)胞凋亡，以PI3K/AKT信號(hào)通路特異性抑制劑LY294002干預(yù)可抑制肝干細(xì)胞凋亡。蔡鳳桃等[17]應(yīng)用不同濃度眼鏡蛇蛇毒和LY294002可以降低pAKT表達(dá)水平，促進(jìn)肝纖維化。

圖3 各組小鼠CXCL-12表達(dá)比較（400×）Fig.3 Comparison of CXCL-12 expression in each group(400×)

圖4 各組小鼠pAKT表達(dá)比較（400×）Fig.4 Comparison of pAKT expression in each group(400×)

圖5 各組小鼠pNF-κB表達(dá)比較（免疫組化，400×）Fig.5 Comparison of pNF-κB expression in each group(immunohistochemistry,400×)

圖6 各組小鼠肝組織CXCR-4蛋白表達(dá)比較Fig.6 Comparison of the expression of CXCR-4 protein in liver tissues in each group

圖7 各組小鼠肝組織CXCL-12蛋白表達(dá)比較Fig.7 Comparison of the expression of CXCL-12 protein in liver tissues in each group

圖8 各組小鼠肝組織PI3K蛋白表達(dá)比較Fig.8 Comparison of the expression of PI3K protein in liver tissues in each group

圖9各組小鼠肝組織AKT蛋白表達(dá)比較Fig.9 Comparison of the expression of AKT protein in liver tissues in each group

圖10 各組小鼠肝組織pAKT蛋白表達(dá)比較Fig.10 Comparison of the expression of pAKT protein in liver tissues in each group

圖11各組小鼠肝組織NF-κB蛋白表達(dá)比較Fig.11 Comparison of the expression of NF-κB protein in liver tissues in each group

圖12 各組小鼠肝組織pNF-κB蛋白表達(dá)比較Fig.12 Comparison of the expression of pNF-κB protein in liver tissues in each group

現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)NAFLD與NF-κB有密切聯(lián)系，在NAFLD患者及動(dòng)物模型的肝組織中均存在NF-κB的激活[7-9]，NF-κB信號(hào)通路的激活能促進(jìn)炎性細(xì)胞因子的表達(dá),參與肝臟的炎性反應(yīng)、纖維化與凋亡[18]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CXCL-12/CXCR-4/PI3K/AKT/NF-κB通路各基因在模型組小鼠的肝臟中表達(dá)顯著高于對(duì)照組，而PI3K和NF-κB蛋白質(zhì)水平雖有升高，但與對(duì)照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明可能存在基因翻譯過程中的修飾或降解，也可能在通路的下行傳導(dǎo)過程中更能發(fā)揮作用的是活化的PI3K和NF-κB。PI3K/AKT的活化能抑制細(xì)胞凋亡、保護(hù)組織和器官，其中AKT的磷酸化是該通路的中心環(huán)節(jié)[19]。而NF-κB的活化促進(jìn)活性氧簇（reactive oxygen species,ROS）及炎癥因子的分泌，ROS參與的氧化應(yīng)激及脂質(zhì)過氧化，可以活化庫普弗細(xì)胞及肝星狀細(xì)胞，可見NF-κB活化后介導(dǎo)的氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)之間存在相互作用，共同加速NAFLD的進(jìn)展[20]。因此筆者推測，CXCL-12/CXCR-4/PI3K/AKT/NF-κB通路的激活可能在NASH發(fā)病中起到推波助瀾的作用。

以往的研究顯示，黃連素具有抗炎、調(diào)脂、改善胰島素抵抗的作用，還能抑制細(xì)胞凋亡，可用于腹瀉和消化性潰瘍的治療[21]。其他研究則發(fā)現(xiàn)，黃連素可降低高血脂大鼠的血脂水平，抑制肝臟脂質(zhì)過氧化過程，減少肝臟損傷[22]。臨床調(diào)查顯示，黃連素主要成分小檗堿的補(bǔ)充劑可降低2型糖尿病患者的ALT和AST水平[23-24]。歐意桃等[25]的研究也發(fā)現(xiàn)黃連素能降低ALT和AST的水平。張輝等[26]臨床研究發(fā)現(xiàn)甘草酸二銨腸溶膠囊聯(lián)合黃連素可抑制白細(xì)胞介素-6的分泌，從而改善NASH患者肝功能及脂代謝。本研究也證實(shí)，黃連素組小鼠體質(zhì)量、TC、ALT、AST指標(biāo)及NAS評(píng)分均低于模型組，說明黃連素可作為治療NASH的藥物，能有效治療NAFLD。黃連素能夠通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路激活，抑制高糖導(dǎo)致的腎臟系膜細(xì)胞增殖[27]。黃連素還可顯著下調(diào)HepG2細(xì)胞中pAKT的表達(dá)，表明其可抑制AKT通路激活[28]。Pazhang等[29]在對(duì)乳腺癌凋亡的研究中發(fā)現(xiàn)，黃連素可抑制NF-κB的表達(dá)。黃連素還能通過NF-κB信號(hào)通路減少肝癌細(xì)胞腫瘤壞死因子誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)上調(diào)[30]。

為進(jìn)一步探討黃連素治療NASH的作用機(jī)制，本研究采用了Real-time PCR、免疫組化和Western blot等方法，從細(xì)胞、基因和蛋白水平觀察黃連素對(duì)CXCL-12/CXCR-4/PI3K/AKT/NF-κB通路的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃連素能下調(diào) CXCL-12、CXCR-4、PI3K、AKT、NF-κB mRNA 的表達(dá)，抑制 pAKT、pNF-κB 蛋白的活化，減少 CXCL-12、CXCR-4、pAKT、pNF-κB蛋白的表達(dá)，說明黃連素主要通過CXCL-12/CXCR-4/PI3K/AKT/NF-κB通路抗炎、抗凋亡、抗肝細(xì)胞纖維化而治療NASH。但本研究的不足之處主要有：（1）本實(shí)驗(yàn)免疫組化結(jié)果僅為肉眼觀察所得，未作半定量檢測和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；（2）由于造模的周期較短，未能建立NASH向纖維化發(fā)展的模型，因此，肝星狀細(xì)胞活化后轉(zhuǎn)化生長因子-β、膠原纖維等纖維化的指標(biāo)未能得到驗(yàn)證，黃連素抗纖維化的作用通路尚待驗(yàn)證；（3）黃連素通過抑制CXCL-12/CXCR-4/PI3K/AKT/NF-κB通路的激活治療NASH的作用還缺乏體外實(shí)驗(yàn)和臨床研究驗(yàn)證，以上可為日后深入研究此通路的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)和尋找阻斷此通路的類似藥物提供了新的研究方向。