功能未知基因C6orf120對(duì)大鼠肝臟功能的影響

張 健，張曼卡，馬慧敏，宋心成，何玲玲，李 鑫,

1.北京大學(xué)地壇醫(yī)院教學(xué)醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合中心，北京100015； 2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合中心； 3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院傳染病研究所

肝損傷已被認(rèn)為是全球范圍內(nèi)嚴(yán)重的健康問(wèn)題，可由病毒感染、肝毒性藥物和有毒化學(xué)物質(zhì)引起[1-3]。如果得不到及時(shí)有效的治療，最終會(huì)發(fā)展成肝纖維化、肝癌甚至死亡。但目前臨床上還沒(méi)有針對(duì)急慢性肝損傷的有效治療方法[4]。因此，探究肝損傷的發(fā)病機(jī)制，找到新的治療靶點(diǎn)，為醫(yī)師提供新的有效的治療策略，提高肝損傷患者的生存率十分必要。

C6orf120基因編碼N-糖基化蛋白質(zhì)，其功能很大程度上未知。2009年大連大學(xué)肝臟糖蛋白質(zhì)組差異分析發(fā)現(xiàn)[5]，該蛋白在人類肝組織內(nèi)表達(dá)。我們課題組前期對(duì)該基因的重組蛋白也做了初步的功能研究。我們成功表達(dá)出C6orf120的重組蛋白，利用免疫組織化學(xué)技術(shù)分析結(jié)果顯示，該基因表達(dá)的蛋白在肝組織中大量表達(dá)，在淋巴組織中也有表達(dá)，同時(shí)我們的前期工作證明該基因在肝損傷中發(fā)揮著一定的作用[6-7]?；蚯贸夹g(shù)是驗(yàn)證某一基因功能的金標(biāo)準(zhǔn)，因此，我們制備了C6orf120基因敲除大鼠，初步探索該基因在大鼠肝組織中發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物C6orf120基因敲除大鼠由蘇州賽業(yè)生物科技有限公司采用TALEN基因敲除技術(shù)制備，獲得C6orf120+/-大鼠6只，其中雄性3只，雌性3只，飼養(yǎng)于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)條件為無(wú)特定病原體(SPF)。溫度控制在20～25 ℃，濕度(50±15)%，5只/籠，自由飲食和飲水，玉米芯墊料及飼料、飲用水均經(jīng)過(guò)高溫高壓消毒滅菌處理。野生型(wild type,WT)大鼠全部購(gòu)自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑戊巴比妥鈉(生理鹽水配制成質(zhì)量濃度為40 g/L)購(gòu)自美國(guó)Promega公司；腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和活化型半胱天冬酶-3(Cleaved caspase-3)多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；GAPDH抗體購(gòu)自美國(guó)Santa cruz公司；脫脂牛奶購(gòu)自美國(guó)BD公司；qRT-PCR試劑盒購(gòu)自北京全式金公司；PCR引物購(gòu)自上海生物工程股份有限公司。

1.3主要儀器剪刀、鑷子、止血鉗、持針器購(gòu)自上海醫(yī)療器械有限公司；7500 RT-PCR system購(gòu)自美國(guó)ABI公司；瓊脂糖電泳裝置購(gòu)自Bio-Rad公司；超聲波破碎儀購(gòu)自美國(guó)Branson公司。

1.4方法

1.4.1 動(dòng)物分組：將WT大鼠作為對(duì)照組，C6orf120基因敲除(C6orf120-/-)大鼠作為實(shí)驗(yàn)組，每組8只，適應(yīng)1周開始實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)前禁食12 h。

1.4.2 大鼠子代20 d稱重：幼鼠由大鼠母乳喂養(yǎng)，產(chǎn)后20 d離乳并雌雄分籠。初期，合籠方式為雄性C6orf120+/-大鼠和雌性C6orf120+/-大鼠各1只(F1代)，得到F2代大鼠，得到C6orf120+/+、C6orf120+/-和C6orf120-/-3種基因型大鼠。后期雄性C6orf120-/-大鼠和雌性C6orf120-/-大鼠合籠得到大量純合子大鼠。記錄C6orf120 3種基因型大鼠及WT大鼠子代大鼠出生日期并于20 d時(shí)稱重。

1.4.3 qRT-PCR分析TNF-α的mRNA變化：取0.2～0.3 g肝組織樣品，用TRIzol法提取總RNA。在260 nm波長(zhǎng)下測(cè)定樣品總RNA濃度及純度。將樣本濃度稀釋為500 ng/μl，嚴(yán)格按照逆轉(zhuǎn)錄盒(Takara)標(biāo)準(zhǔn)步驟將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以2 μl cDNA為模板，使用7500 RT-PCR system進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)。 TNF-α和GAPDH 擴(kuò)增條件為 50 ℃ 2 min ， 95 ℃ 10 min ， 95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s ， 95 ℃ 15 s， 60 ℃ 60 s ，95℃ 30 s，60 ℃ 15 s，共 40個(gè)循環(huán)。GAPDH mRNA作為內(nèi)參。TNF-α的上游引物序列：5′-GCGATGTGGAACTGGCAGAGG-3′，下游引物序列：5′-GCCACGAGCAGGAATGAGAAGAG-3′；GAPDH的上游引物序列：5′-ATGGGAAGCTGGTCATCAAC-3′，下游引物序列：5′-GGATGCAGGGATGATGTTCT-3′。

1.4.4 Western blotting檢測(cè)TNF-α和Cleaved caspase-3的表達(dá)水平：隨機(jī)處死年齡6～8 周的C6orf120-/-大鼠和WT大鼠各3只，留取大鼠的肝組織。取0.3～0.4 g肝組織樣本于無(wú)菌EP管中，加入RIPA組織細(xì)胞快速裂解液和蛋白酶抑制劑，勻漿并用超聲震蕩裂解10 min，冰上裂解30 min；離心并吸取上清以獲得總蛋白。蛋白變性后加到SDS-聚丙烯酰胺凝膠(體積百分比為12%)上進(jìn)行電泳分離，將蛋白轉(zhuǎn)移到膜上后用質(zhì)量濃度為50 g/L的脫脂牛奶封閉1 h，在4 ℃條件下將硝酸纖維素膜與一抗孵育過(guò)夜，次日孵育二抗1 h，在曝光儀中，Tanon發(fā)光液顯影，曝光。

2 結(jié)果

2.1C6orf120-/-大鼠的生長(zhǎng)發(fā)育情況將F1大鼠進(jìn)行合籠繁育，觀察子代大鼠在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中外觀和行為活動(dòng)的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，C6orf120-/-大鼠和WT大鼠在外觀和行為活動(dòng)上無(wú)明顯差異。另外，我們對(duì)20 d的C6orf120-/-大鼠和WT大鼠進(jìn)行稱重，WT大鼠的體質(zhì)量為(54.83±1.389)g，C6orf120-/-大鼠的體質(zhì)量為(42.70±1.789)g，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0001)(見(jiàn)圖1)。

圖1 不同C6orf120基因型大鼠體質(zhì)量的比較Fig 1 Comparison of body weight of different C6orf120 genotype rats

2.2基因C6orf120可能參與大鼠肝臟的炎癥反應(yīng)肝臟的損傷多與炎癥反應(yīng)緊密相關(guān)。我們課題組前期對(duì)該基因的重組蛋白也做了初步的功能研究[7]，利用免疫組織化學(xué)技術(shù)分析顯示，該基因表達(dá)的蛋白在肝組織中大量表達(dá)，且在刀豆蛋白A(CON A)介導(dǎo)的免疫性肝損傷中發(fā)揮著重要作用?；駽6orf120在一定程度上可以抑制肝損傷過(guò)程中炎癥因子的表達(dá)。為了研究該基因在大鼠肝臟炎癥反應(yīng)中的作用，我們首先在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)肝組織中TNF-α表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與WT大鼠相比，C6orf120-/-大鼠肝組織中TNF-α表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.008 3)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證，我們?cè)诘鞍姿綄?duì)肝組織中TNF-α進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，與WT大鼠相比，C6orf120-/-大鼠肝組織中TNF-α的表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0172)(見(jiàn)圖2)。

圖2 TNF-α在大鼠肝組織中的表達(dá)水平 A：大鼠肝組織中TNF-α在mRNA水平的變化；B：大鼠肝組織中TNF-α表達(dá)水平的

2.3基因C6orf120缺失會(huì)促進(jìn)肝組織中Cleavedcaspase-3的表達(dá)Caspase-3蛋白是半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶家族的成員，認(rèn)為caspase-3是細(xì)胞凋亡過(guò)程中最主要的終末剪切酶，也是細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)細(xì)胞殺傷機(jī)制的重要組成部分，caspase-3在細(xì)胞凋亡過(guò)程中起著不可替代的作用。為了驗(yàn)證該基因是否參與大鼠肝細(xì)胞凋亡過(guò)程，我們?cè)诘鞍姿綄?duì)肝組織中Cleaved caspase-3進(jìn)行檢測(cè)，Western blotting結(jié)果表明，與WT大鼠相比，C6orf120-/-大鼠肝組織中Cleaved caspase-3的表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0301)(見(jiàn)圖3)。

圖3 蛋白Cleaved caspase-3在大鼠肝組織中的表達(dá)水平及灰度分析Fig 3 The expression of Cleaved caspase-3 in the liver tissues and Plots of pixel intensity

3 討論

我們以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，基因C6orf120的缺失會(huì)導(dǎo)致20 d大鼠體質(zhì)量減輕，但是對(duì)于其外觀及行為活動(dòng)并沒(méi)有明顯的影響。C6orf120-/-大鼠肝組織中TNF-α及Cleaved caspase-3的表達(dá)水平明顯升高。

肝臟是人和動(dòng)物主要代謝的場(chǎng)所，時(shí)刻進(jìn)行著重要的化學(xué)反應(yīng)。同時(shí)，肝臟也是動(dòng)物體內(nèi)重要的合成器官和解毒場(chǎng)所[8]。肝臟是消化系統(tǒng)的重要組成部分，在人體的消化過(guò)程中還扮演著分泌膽汁、去氧化、存儲(chǔ)糖原等角色。更為重要的是肝臟是人體內(nèi)重要的藥物轉(zhuǎn)化與代謝的器官[9]，因此它也是很容易受損傷的臟器之一[10-12]。急性肝損傷多是由于病毒、細(xì)菌的感染，或者藥物濫用引起的急性肝細(xì)胞損傷，如果得不到及時(shí)的治療，很快就會(huì)發(fā)展成急性肝衰竭[13]。在我國(guó)每年因肝病死亡人數(shù)高達(dá)150萬(wàn)[14]。目前對(duì)于肝損傷還沒(méi)有比較有效的治療方法，臨床上主要以內(nèi)科治療為主。因此，探究肝損傷的發(fā)病機(jī)制，找到新的治療靶點(diǎn)，為醫(yī)師提供新的有效的治療策略，提高肝損傷患者的生存率十分必要。

C6orf120-/-大鼠在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中體質(zhì)量低于WT大鼠，提示該基因可能對(duì)大鼠的生長(zhǎng)發(fā)育有一定的影響，其機(jī)制可能與脂代謝相關(guān)。多個(gè)其他基因敲除動(dòng)物中也發(fā)現(xiàn)了體質(zhì)量與野生型有差異的現(xiàn)象[15-16]，由于影響體質(zhì)量的因素較多，其機(jī)制還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

C6orf120基因編碼N-糖基化蛋白質(zhì)，其功能很大程度上未知。我們的前期研究[6]結(jié)果表明，C6orf120蛋白在肝組織中大量表達(dá)。在功能上該基因與肝損傷具有密切的聯(lián)系[17-19]。腫瘤壞死因子可分為TNF-α和TNF-β兩種，前者來(lái)自單核巨噬細(xì)胞，后者由活化T細(xì)胞產(chǎn)生，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的作用[20]。TNF-α與機(jī)體炎癥、免疫反應(yīng)密切相關(guān)，且與疾病的活動(dòng)性有關(guān)。大量TNF-α持續(xù)高表達(dá)會(huì)導(dǎo)致病變惡化，因此，在疾病的發(fā)展過(guò)程中具有重要作用[21]。實(shí)驗(yàn)性肝損傷動(dòng)物常表現(xiàn)為 TNF-α升高，并與肝細(xì)胞壞死程度密切相關(guān)。在本實(shí)驗(yàn)中，與WT大鼠相比，TNF-α在C6orf120-/-大鼠肝組織中表達(dá)水平明顯升高，說(shuō)明基因C6orf120可能參與大鼠肝臟的炎癥反應(yīng)，提示該基因具有抑制炎癥反應(yīng)，保護(hù)機(jī)體正常功能的作用。

肝損傷的發(fā)生與肝細(xì)胞的凋亡有關(guān)，目前廣泛認(rèn)為外界刺激或細(xì)胞內(nèi)在因素均可激活Caspase 級(jí)聯(lián)反應(yīng)引起凋亡[22-24]。上游的 Caspase 能依次激活下游的 Caspase ，形成Caspase 級(jí)聯(lián)反應(yīng)，將凋亡信號(hào)一級(jí)級(jí)傳至底物，Caspase-3 則是這個(gè)過(guò)程的執(zhí)行者[25-26]?；罨腃aspase-3 可以切割不同底物，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，因此Caspase-3與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[27-28]。 在本實(shí)驗(yàn)中，Cleaved caspase-3的表達(dá)水平在C6orf120-/-大鼠肝組織中明顯升高，說(shuō)明基因C6orf120可能參與細(xì)胞的凋亡過(guò)程，抑制肝細(xì)胞的凋亡，對(duì)肝細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用。另有文獻(xiàn)[29]報(bào)道，TNF-α可與肝細(xì)胞膜上的TNFR1結(jié)合并形成TNFR-TRADD-FADD 復(fù)合物，該復(fù)合物可上調(diào) Caspase 3 基因表達(dá)，進(jìn)一步激活蛋白酶家族的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡途徑。在本課題中，我們發(fā)現(xiàn)，基因C6orf120敲除會(huì)使大鼠肝組織中TNF-α和Cleaved caspase-3的表達(dá)水平明顯升高，可能與TNFR-TRADD-FADD 復(fù)合物形成有關(guān)。還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上所述，本研究提示C6orf120基因敲除對(duì)大鼠生長(zhǎng)發(fā)育具有一定影響，該基因的缺失會(huì)促進(jìn)細(xì)胞因子TNF-α和Cleaved caspase-3的表達(dá)，提示該基因可能對(duì)肝損傷具有一定的保護(hù)作用。