受體相互作用蛋白2基因?qū)Y(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制研究

李 艷，徐智媛，程 宇，楊晉輝

昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，云南 昆明 650101

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是臨床較為常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，具有較高的發(fā)病率，據(jù)統(tǒng)計(jì)，2010年我國(guó)新增CRC患者約27萬(wàn)人，死亡患者超過(guò)10萬(wàn)人，近年來(lái)，CRC的發(fā)病率和死亡率均逐年增加，嚴(yán)重威脅著現(xiàn)代人類(lèi)健康，是醫(yī)療界一大難題[1-2]。

CRC的常用治療方法為手術(shù)切除腫瘤結(jié)合放射治療、化療藥物治療和中藥治療，取得了一定的治療效果，但是治療后易復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，尤其易轉(zhuǎn)移到肝臟，導(dǎo)致患者存活時(shí)間不長(zhǎng)，因此，探討CRC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移作用機(jī)制，進(jìn)而尋找控制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的有效方法對(duì)治療CRC具有重要價(jià)值[3-4]。

基質(zhì)裂解蛋白和明膠酶B均能激活降解細(xì)胞外基質(zhì)的膠原酶，引起癌細(xì)胞侵入到周?chē)芙M織，進(jìn)而發(fā)生轉(zhuǎn)移[5-6]。激活素受體相互作用蛋白2(receptor interacting protein 2，RIP2)是具有多重功能的生長(zhǎng)因子和分化因子，研究[7]表明，RIP2基因在腦神經(jīng)瘤細(xì)胞系Neuro-2a細(xì)胞及肝癌細(xì)胞Hepal-6中有特異性表達(dá)，對(duì)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移產(chǎn)生重要影響。但國(guó)內(nèi)外關(guān)于RIP2基因在CRC患者腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用機(jī)制研究較少，本文通過(guò)檢測(cè)RIP2、基質(zhì)裂解蛋白和明膠酶B在CRC患者中的表達(dá)情況，探討RIP2在CRC侵襲、轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1一般資料選取2015年12月至2016年11月來(lái)我院進(jìn)行檢查并確診為CRC的124例患者(共計(jì)140例，排除16例)為研究對(duì)象，男68例，女56例，年齡(52.18±8.34)歲(32～74歲)。取其腫瘤組織作為實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行石蠟切片觀察，并取距腫瘤組織周?chē)? cm處的正常組織作為對(duì)照組，進(jìn)行石蠟切片觀察。納入標(biāo)準(zhǔn)[8]：根據(jù)診斷標(biāo)準(zhǔn)被確認(rèn)為CRC的患者；患者的治療方法為手術(shù)切除。排除標(biāo)準(zhǔn)：手術(shù)前使用過(guò)化療藥物；接受過(guò)放射治療；不同意配合完成該實(shí)驗(yàn)者。

1.2實(shí)驗(yàn)材料人CRC細(xì)胞株HCT116購(gòu)自上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司；RIP2抗體、基質(zhì)裂解蛋白抗體、明膠酶B抗體購(gòu)自北京普利萊(APPLYGEN)基因技術(shù)有限公司；免疫組織化學(xué)試劑盒購(gòu)自華美生物工程有限公司；RPMI 1640完全培養(yǎng)液購(gòu)自上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司；Hyclone胎牛血清、胰蛋白酶購(gòu)自上海哈靈生物科技有限公司；siRNA、Hieff TransTM脂質(zhì)體核酸轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司。

1.3RIP2、基質(zhì)裂解蛋白和明膠酶B的表達(dá)檢測(cè)取CRC組織和正常組織的石蠟切片(厚度5 μm)，常規(guī)二甲苯梯度脫蠟，3% H2O237 ℃滅活10 min，于0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液(pH 6.0)中進(jìn)行抗原修復(fù)，用工作液37 ℃封閉10 min，加入一抗后4 ℃冰箱孵育過(guò)夜，沖洗后加二抗、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈酶卵白素工作液和DAB進(jìn)行顯色，脫水固封后進(jìn)行鏡檢。

鏡檢計(jì)數(shù)方法：隨機(jī)選擇3個(gè)視野(400×)，利用IPP軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以細(xì)胞漿呈現(xiàn)出棕黃色顆粒記為陽(yáng)性，計(jì)算細(xì)胞總個(gè)數(shù)和陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞個(gè)數(shù)，取三次結(jié)果平均值，計(jì)算陽(yáng)性表達(dá)率。陽(yáng)性表達(dá)分級(jí)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[9]：視野內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比例<25%記為0分，陽(yáng)性表達(dá)率為25%～50%記為1分，陽(yáng)性表達(dá)率為50%～75%記為2分，陽(yáng)性表達(dá)率>75%記為3分[9]。

1.4RIP2基因的siRNA轉(zhuǎn)染方法HCT116細(xì)胞株常規(guī)培養(yǎng)，并隨機(jī)分為正常對(duì)照組、陰性對(duì)照組和RIP2抑制組，空白對(duì)照組只加轉(zhuǎn)染試劑，并根據(jù)Hieff TransTM脂質(zhì)體核酸轉(zhuǎn)染試劑盒方法，轉(zhuǎn)染前1 d用質(zhì)量濃度為2.5 g/L的胰蛋白酶消化后，接種于6孔板上，轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度約為2×105個(gè)/孔，分別用200 μl的無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋10 μl轉(zhuǎn)染試劑和各組RNA，靜置10 min后，轉(zhuǎn)染試劑與各組混合，靜置15 min后鋪到6孔板，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2繼續(xù)培養(yǎng)48 h后進(jìn)行檢測(cè)。

1.5劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力取對(duì)數(shù)期HCT116細(xì)胞，質(zhì)量濃度為2.5 g/L的胰蛋白酶消化后計(jì)數(shù)，以4×104ml-1接種在24孔板上，常規(guī)培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后按照1.4方法分組處理，48 h后進(jìn)行劃痕處理，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后鏡檢，計(jì)算HCT116細(xì)胞的遷移距離。

1.6Westernblotting法檢測(cè)RIP2、基質(zhì)裂解蛋白、明膠酶B蛋白的含量轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)進(jìn)行48 h后，提取各組細(xì)胞的總蛋白，根據(jù)Bradford法對(duì)蛋白進(jìn)行定量，分別取30 μg的HCT116細(xì)胞蛋白上樣，采用質(zhì)量濃度為120 g/L的聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行蛋白質(zhì)分離后，轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上，使用質(zhì)量濃度為50 g/L的脫脂牛奶室溫封閉1 h，一抗4 ℃過(guò)夜，二抗室溫1 h后，進(jìn)行顯色和吸光度計(jì)算。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料比較采用秩和檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)和Spearman相關(guān)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1各組RIP2、基質(zhì)裂解蛋白和明膠酶B蛋白的檢測(cè)結(jié)果免疫組化結(jié)果顯示，CRC組織(CRC組)中RIP2、基質(zhì)裂解蛋白和明膠酶B蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率分別為69.35%(86/124)、74.19%(92/124)、61.29%(76/124)；在正常組織中(正常對(duì)照組)RIP2、基質(zhì)裂解蛋白和明膠酶B的陽(yáng)性表達(dá)率分別為30.65%(38/124)、35.48%(44/124)、38.71%(48/124)。秩和檢驗(yàn)結(jié)果顯示，RIP2、基質(zhì)裂解蛋白和明膠酶B在CRC組的表達(dá)率明顯高于正常對(duì)照組(P<0.05)(見(jiàn)表1)。

表1 RIP2、基質(zhì)裂解蛋白和明膠酶B蛋白的表達(dá)Tab 1 Expressions of RIP2, matrix metalloproteinases and Gelatinase B

2.2RIP2蛋白表達(dá)與CRC轉(zhuǎn)移的關(guān)系RIP2蛋白的表達(dá)與CRC細(xì)胞的浸潤(rùn)深度和淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移情況具有相關(guān)性，RIP2蛋白表達(dá)陽(yáng)性的CRC細(xì)胞浸潤(rùn)深度更大，且淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移率更高(P<0.05)，但RIP2蛋白表達(dá)與其他生物學(xué)特征無(wú)相關(guān)性(P>0.05)(見(jiàn)表2)。

表2 CRC組織RIP2蛋白表達(dá)與病理參數(shù)的關(guān)系Tab 2 Relationship between RIP2 protein expression and pathological parameters in CRC tissues 比例/%

2.3RIP2-siRNA轉(zhuǎn)染后RIP2、基質(zhì)裂解蛋白和明膠酶B蛋白的表達(dá)結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組和正常對(duì)照組相比，RIP2-siRNA轉(zhuǎn)染組的RIP2蛋白表達(dá)量明顯降低(P<0.05)；與陰性對(duì)照組相比，正常對(duì)照組RIP2蛋白的表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)圖1)。

與陰性對(duì)照組和正常對(duì)照組相比，RIP2-siRNA轉(zhuǎn)染能夠顯著降低基質(zhì)裂解蛋白、明膠酶B蛋白的表達(dá)(P<0.05)；與陰性對(duì)照組相比，正常對(duì)照組基質(zhì)裂解蛋白和明膠酶B蛋白的表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)圖2)。

圖1 RIP2-siRNA轉(zhuǎn)染后RIP2蛋白的表達(dá)Fig 1 Expression of RIP2 after the transfection of RIP2-siRNA

圖2 RIP2-siRNA轉(zhuǎn)染后基質(zhì)裂解蛋白、明膠酶B蛋白的表達(dá)Fig 2 Expression of matrilysin and Gelatinase B after RIP2-siRNA transfection

2.4RIP2的表達(dá)與基質(zhì)裂解蛋白、明膠酶B蛋白的相關(guān)性相關(guān)性分析結(jié)果表明，CRC組織中RIP2蛋白的表達(dá)與基質(zhì)裂解蛋白(r=0.412，P<0.01)和明膠酶B蛋白(r=0.408，P<0.01)的表達(dá)均呈正相關(guān)，且基質(zhì)裂解蛋白與明膠酶B蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.432，P<0.01)。

2.5RIP2表達(dá)抑制后HCT116細(xì)胞遷移距離結(jié)果劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與陰性對(duì)照組和正常對(duì)照組相比，RIP2-siRNA轉(zhuǎn)染能夠顯著降低HCT116細(xì)胞的遷移距離(P<0.05)，與陰性對(duì)照組相比，正常對(duì)照組HCT116細(xì)胞的遷移距離差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)圖3)。

圖3 RIP2-siRNA轉(zhuǎn)染后HCT116細(xì)胞遷移能力變化 A：陰性對(duì)照組；B：正常對(duì)照組；C：RIP2-siRNA組Fig 3 The change of metastatic capability of HCT116 after the transfection of RIP2-siRNA A: negative control group; B: normal control group; C: RIP2-siRNA group

3 討論

CRC是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，發(fā)病率較高，居胃腸道腫瘤的第2位，且早期癥狀不明顯，不易被發(fā)現(xiàn)。目前，手術(shù)切除腫瘤組織是治療CRC最常用的方法，但易出現(xiàn)復(fù)發(fā)或腫瘤組織轉(zhuǎn)移的情況，治療結(jié)果難以達(dá)到預(yù)期效果。因此，研究CRC的發(fā)病機(jī)制，探索抑制CRC轉(zhuǎn)移的方法至關(guān)重要。

近年來(lái)，關(guān)于抑制CRC細(xì)胞侵襲或轉(zhuǎn)移的研究較多，有研究[10]發(fā)現(xiàn)，Gab2基因能夠通過(guò)調(diào)控EMT以增強(qiáng)CRC細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移能力；CDKL1和Sam68也能夠促進(jìn)CRC細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移能力，對(duì)CRC的發(fā)生和發(fā)展有重要影響；CTHRC1能夠顯著增加HT29細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的水平[11]。而B(niǎo)細(xì)胞白血病/淋巴瘤6B(BCL6B)能夠通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號(hào)通路有效抑制CRC LoVo細(xì)胞的增殖和遷移[12]，由此可見(jiàn)，CRC細(xì)胞的遷移受多種基因共同影響，既有上調(diào)作用又有抑制作用，所以，探索關(guān)鍵基因是解決問(wèn)題的關(guān)鍵。

激活素RIP2是多重功能的生長(zhǎng)因子和分化因子，在癌細(xì)胞中表達(dá)異常，并具有抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的相關(guān)報(bào)道[13]，但RIP2在CRC患者腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用機(jī)制研究鮮見(jiàn)報(bào)道，因此，本文通過(guò)研究RIP2在HCT116細(xì)胞的表達(dá)和對(duì)細(xì)胞遷移的影響，結(jié)合其表達(dá)與癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中最常見(jiàn)、最關(guān)鍵的激酶基質(zhì)金屬蛋白酶-2(基質(zhì)裂解蛋白)和基質(zhì)金屬蛋白酶9(明膠酶B)的關(guān)系，探索RIP2影響CRC HCT116細(xì)胞的作用機(jī)制。

結(jié)果表明，RIP2的表達(dá)與腫瘤細(xì)胞發(fā)展具有相關(guān)性，與正常對(duì)照組相比，RIP2蛋白的表達(dá)在HCT116細(xì)胞中顯著增加，且RIP2的表達(dá)量與腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)程度和淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移情況具有相關(guān)性，腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)程度越高，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移越嚴(yán)重，則RIP2蛋白的表達(dá)程度越高，即RIP2在腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著積極作用。

在RIP2高表達(dá)的CRC組中，腫瘤細(xì)胞遷移的促進(jìn)因子基質(zhì)金屬蛋白酶基質(zhì)裂解蛋白和明膠酶B蛋白的表達(dá)也高于正常對(duì)照組，且RIP2在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)與基質(zhì)裂解蛋白和明膠酶B蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，由此推斷，RIP2能夠通過(guò)上調(diào)基質(zhì)裂解蛋白和明膠酶B蛋白的表達(dá)，進(jìn)而共同促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。為增加實(shí)驗(yàn)的可信度，本研究利用RNAi技術(shù)，選擇性抑制HCT116細(xì)胞內(nèi)RIP2的表達(dá)，結(jié)果顯示，RIP2的表達(dá)被抑制后，HCT116細(xì)胞的劃痕明顯，細(xì)胞遷移距離縮短，表明HCT116細(xì)胞的遷移能力明顯減弱，而且HCT116細(xì)胞內(nèi)基質(zhì)裂解蛋白和明膠酶B蛋白的表達(dá)量也顯著降低，由此進(jìn)一步斷定，CRC細(xì)胞HCT116內(nèi)RIP2能夠通過(guò)調(diào)節(jié)基質(zhì)裂解蛋白和明膠酶B蛋白表達(dá)參與腫瘤細(xì)胞的遷移，即RIP2通過(guò)上調(diào)基質(zhì)裂解蛋白和明膠酶B蛋白的表達(dá)，促進(jìn)了CRC HCT116細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移。

綜上所述，RIP2能夠通過(guò)上調(diào)基質(zhì)裂解蛋白和明膠酶B蛋白的表達(dá)，提高CRC腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力，研究需進(jìn)一步探索抑制RIP2的表達(dá)或阻斷其調(diào)節(jié)基質(zhì)裂解蛋白和明膠酶B蛋白表達(dá)的過(guò)程，達(dá)到抑制CRC細(xì)胞遷移的目的。