阿托伐他汀調(diào)控MMP-9、Cleaved Caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白表達對胃癌細(xì)胞增殖、周期和凋亡的影響

王 玲，周巧直 ，王曉燕，吳云娜，樊愛平

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院 1.藥劑科； 2.消化科，北京 100050； 3.北京衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院； 4.北京大學(xué)人民醫(yī)院藥劑科； 5.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院藥劑科

胃癌是威脅人類健康的第二大惡性腫瘤，具有發(fā)病隱匿、易轉(zhuǎn)移和高復(fù)發(fā)等特點[1]。我國是胃癌的高發(fā)區(qū)，其新發(fā)病例和死亡率分別占全部惡性腫瘤的17%和20%，且發(fā)病呈年輕化趨勢，嚴(yán)重威脅著我國人民的身體健康和生活質(zhì)量[2-3]。阿托伐他汀是一種他汀類藥物，除了有降脂作用外，還具有改善內(nèi)皮功能、抗炎和抗氧化等功效。近年來研究發(fā)現(xiàn)，阿托伐他汀對前列腺癌、膀胱癌和頭頸癌等多種腫瘤的生長具有一定的抑制作用[4-6]，但其對胃癌細(xì)胞生長的影響及其機制的研究未見報道。因此，本研究以SGC-7901細(xì)胞為研究對象，探討阿托伐他汀對胃癌細(xì)胞增殖凋亡的影響，并初步探討其作用機制，為阿托伐他汀在胃癌的治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1主要材料胃癌SGC-7901細(xì)胞購自上海生命科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞研究所，阿托伐他汀購自輝瑞制藥公司，胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)液、青/鏈霉素、DMSO和MTT試劑購自美國Sigma公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒、Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒均購自上海碧云天公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔/鼠IgG(IgG-HRP)抗體、MMP-9抗體、 Bcl-2抗體、Bax抗體、β-actin抗體和Cleaved caspase-3抗體均購自美國Santa Cruz公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)先將凍存的胃癌SGC-7901細(xì)胞水浴溶解，再轉(zhuǎn)移至加入RPMI-1640培養(yǎng)液的離心管中離心，以1 000 r/min離心5 min,棄上清液后加入RPMI-1640培養(yǎng)液(含青/鏈霉素和質(zhì)量濃度為100 g/L胎牛血清)進行培養(yǎng)，培養(yǎng)在體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，以質(zhì)量濃度為2.5 g/L胰蛋白酶消化傳代，每3 d傳代1次。收集對數(shù)生長期的細(xì)胞進行實驗。

1.3MTT法檢測SGC-7901細(xì)胞增殖收集對數(shù)生長期的SGC-7901細(xì)胞，胰蛋白酶消化后，細(xì)胞計數(shù)，按每孔100 μl(細(xì)胞濃度為1×104個/ml)接種到96孔板中培養(yǎng)。隨機分為4組，每組設(shè)置5個復(fù)孔，分別加入終濃度為0、20、60和100 μmol/L阿托伐他汀，各組在培養(yǎng)24、48、72 h后，向每孔加入20 μl濃度為5 g/L 的MTT溶液，培養(yǎng)4 h后，棄培養(yǎng)液，加DMSO 100 μl，反應(yīng)20 min。以不含阿托伐他汀的細(xì)胞作為對照組，以空白孔調(diào)零，在570 nm波長處酶標(biāo)儀檢測各組細(xì)胞的吸光度(A)值，計算細(xì)胞抑制率。公式：抑制率(%)=100%×[ (A對照組-A實驗組)/(A對照組-A空白組)]。

1.4流式細(xì)胞儀檢測SGC-7901細(xì)胞周期和凋亡取1.3中經(jīng)0、20、60和100 μmol/L的阿托伐他汀作用48 h的SGC-7901細(xì)胞，以磷酸緩沖液洗滌后，經(jīng)胰蛋白酶消化，制備細(xì)胞懸液。調(diào)整細(xì)胞濃度為6×104個/ml。分別收集兩份體積為1 ml的各組細(xì)胞懸液，磷酸緩沖液洗滌后，1份中先加入70%乙醇(預(yù)冷)固定細(xì)胞過夜，以1 000 r/min離心5 min,棄上清液，以磷酸緩沖液洗滌后，加入PI染液1 ml，避光下處理30 min后，上流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞周期的變化。另1份離心后，先加入Binding Buffer緩沖液500 μl，再加入5 μl PI和5 μl Annexin V-FITC，避光反應(yīng)15 min后，上流式細(xì)胞儀檢測檢測各組細(xì)胞的凋亡率。其中，每組實驗均重復(fù)3次。

1.5Westernblotting檢測MMP-9、CleavedCaspase-3、Bcl-2和Bax蛋白表達收集1.3中阿托伐他汀作用48 h的各組SGC-7901細(xì)胞，以磷酸緩沖液洗滌后，加入細(xì)胞裂解液提取各組細(xì)胞總蛋白，并以試劑盒定量總蛋白濃度。將5×Loading buffer與總蛋白混勻后，沸水浴變性。取變性蛋白80 μg上樣至SDS-PAGE凝膠中電泳。分離完畢后，取出凝膠，按照濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)印，接著取出PVDF膜置于TBST(含質(zhì)量濃度為50 g/L脫脂奶粉)封閉液中處理2 h，加入500倍稀釋的一抗(MMP-9、Cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax和β-actin抗體)和2 000倍稀釋的IgG-HRP二抗，充分反應(yīng)后，以化學(xué)發(fā)光劑ECL顯影，Image軟件計算各目的蛋白的相對表達量。

2 結(jié)果

2.1阿托伐他汀對胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖的影響不同濃度的阿托伐他汀(20、60和100 μmol/L)處理胃癌SGC-7901細(xì)胞24、48和72 h后，均對SGC-7901細(xì)胞生長產(chǎn)生了抑制作用，并隨著阿托伐他汀濃度的增加及作用時間的延長，其抑制效果越明顯。同時間點，不同濃度組間細(xì)胞抑制率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；同一濃度，不同作用時間點細(xì)胞抑制率差異也均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(見表1)。

表1 阿托伐他汀對胃癌SGC-7901細(xì)胞抑制率的影響Tab 1 Effect of Atorvastatin on the inhibitory rate of SGC-7901 cells in gastric cancer %

注：同時間，a：與20 μmol/L比較，t24h-60=7.888，P=0.000；t48h-60=5.361，P=0.002；t72h-60=3.289，P=0.017；t24h-100=13.373，P=0.000；t48h-100=12.569，P=0.000；t72h-100=7.111，P=0.000；同時間，b：與60 μmol/L比較，t24h=5.485，P=0.002；t48h=7.209，P=0.000；t72h=3.822，P=0.009；同濃度，c：與24 h比較，t20-48h=7.588，P=0.000；t20-72h=11.694，P=0.000；t60-48h=2.256，P=0.065；t60-72h=5.927，P=0.001；t100-48h=1.711，P=0.138；t100-72h=3.975，P=0.007； 同濃度，d：與48 h比較，t20=4.106，P=0.006；t60=3.671，P=0.010；t100=2.265，P=0.064。

2.2阿托伐他汀對胃癌SGC-7901細(xì)胞周期的影響經(jīng)不同濃度阿托伐他汀(0、20、60和100 μmol/L)處理胃癌SGC-7901細(xì)胞48 h后，流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞的周期變化(見表2)。隨著阿托伐他汀濃度的增加，G0/G1期細(xì)胞所占比例逐漸升高，S期和G2/M期細(xì)胞比例逐漸降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表2 阿托伐他汀對胃癌SGC-7901細(xì)胞周期的影響Tab 2 The effect of Atorvastatin on the cell cycle of gastric cancer SGC-7901 %

注：a：與0 μmol/L組相比，tG0/G1-20=9.037，P=0.000；tS-20=6.960，P=0.000；tG2/M-20=5.212，P=0.001；tG0/G1-60=13.007，P=0.000；tS-60=9.469，P=0.000；tG2/M-60=8.279，P=0.000；tG0/G1-100=17.170，P=0.000；tS-100=12.721，P=0.000；tG2/M-100=10.615，P=0.000；b：與20 μmol/L組相比，tG0/G1-60=3.970，P=0.000；tS-60=2.509，P=0.037；tG2/M-60=3.068，P=0.015；tG0/G1-100=8.133，P=0.000；tS-100=5.761，P=0.000；tG2/M-100=5.403，P=0.001； c：與60 μmol/L組相比，tG0/G1=4.163，P=0.003；tS=3.253，P=0.012；tG2/M=2.336，P=0.048。

2.3阿托伐他汀對胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響經(jīng)不同濃度阿托伐他汀(0、20、60和100 μmol/L)處理胃癌SGC-7901細(xì)胞48 h后，流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞的凋亡情況(見圖1和表3)。與0 μmol/L組相比，20 μmol/L組、60 μmol/L組和100 μmol/L組細(xì)胞的凋亡率均顯著升高(P<0.05)，且SGC-7901細(xì)胞的凋亡率呈濃度依賴性增加(P<0.05)。

注：1: 0 μmol/L; 2: 20 μmol/L; 3: 60 μmol/L; 4: 100 μmol/L

注：a：與0 μmol/L比較，t20=3.490，P=0.008；t60=6.072，P=0.000；t100=10.396，P=0.000；b：與20 μmol/L比較，t60=2.582，P=0.033；t100=6.906，P=0.000；c：與60 μmol/L比較，t=4.324，P=0.003。

2.4阿托伐他汀對胃癌SGC-7901細(xì)胞中MMP-9、CleavedCaspase-3、Bcl-2和Bax蛋白表達的影響Western blotting進一步探討阿托伐他汀處理后胃癌SGC-7901細(xì)胞中MMP-9、Cleaved Caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白的表達情況(見圖2和表4)。結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度阿托伐他汀干擾后，細(xì)胞中MMP-9和Bcl-2蛋白的表達均隨阿托伐他汀濃度的增加而下降，而Cleaved Caspase-3和Bax蛋白的表達則呈濃度依賴性上升，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

他汀類藥物是一類常用的調(diào)脂藥，通過阻斷與細(xì)胞周期及代謝凋亡密切相關(guān)的甲羥戊酸代謝途徑影響細(xì)胞的增殖、分化和凋亡，進而發(fā)揮抗腫瘤的作用[7]。

表4 阿托伐他汀對MMP-9、Cleaved Caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白表達的影響Tab 4 The effect of Atorvastatin on the expressions of MMP-9, Cleaved Caspase-3, Bcl-2 and Bax proteins

注：a：與0 μmol/L比較，t20-1=5.945，P=0.000；t20-2=3.538，P=0.008；t20-3=5.970，P=0.000；t20-4=3.770，P=0.006；t60-1=13.212，P=0.000；t60-2=9.254，P=0.000；t60-3=12.792，P=0.000；t60-4=6.875，P=0.000；t100-1=17.175，P=0.000；t100-2=13.336，P=0.000；t100-3=15.351，P=0.000；t100-4=10.201，P=0.000；b： 與20 μmol/L比較，t60-1=7.266，P=0.000；t60-2=5.716，P=0.000；t60-3=6.822，P=0.000；t60-4=3.105，P=0.015；t100-1=11.230，P=0.000；t100-2=9.798，P=0.000；t100-3=9.381，P=0.000；t100-4=6.431，P=0.000；c： 與60 μmol/L比較，t1=3.964，P=0.004；t2=4.083，P=0.004；t3=2.558，P=0.034；t4=3.327，P=0.010。

1: 0 μmol/L; 2: 20 μmol/L; 3: 60 μmol/L; 4: 100 μmol/L

阿托伐他汀是他汀類藥物中應(yīng)用最廣泛的一種，近年來阿托伐他汀的抗腫瘤作用也越來越多引起關(guān)注。據(jù)報道，阿托伐他汀能夠通過將細(xì)胞阻滯于G0/G1期及抑制COX-2蛋白表達抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖[8]；還可以通過調(diào)控PI3K/ATK/mTOR信號通路抑制白血病HL-60細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[9]。還有研究[10-11]發(fā)現(xiàn)，阿托伐他汀能夠呈劑量依賴性抑制結(jié)腸癌HCT-116、SW-480及Caco-2細(xì)胞的生長；通過抑制RhoA活性抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖。近年來發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物對胃癌有一定的預(yù)防作用，而其對胃癌細(xì)胞生長的影響未見報道[12]。因此，研究阿托伐他汀對胃癌細(xì)胞生長的影響，對胃癌的治療具有重要意義。本研究，以不同濃度阿托伐他汀(20、60和100 μmol/L)處理胃癌SGC-7901細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，阿托伐他汀能夠呈時間-濃度依賴性抑制SGC-7901細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞G0/G1期阻滯并促進細(xì)胞凋亡。提示，阿托伐他汀的抗胃癌作用可能與誘導(dǎo)G0/G1期細(xì)胞阻滯有關(guān)。

基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是水解基質(zhì)和質(zhì)膜中各種彈性蛋白酶和膠原酶的一類蛋白裂解酶，在降解血管基底膜、重塑外基質(zhì)，促進腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移等方面發(fā)揮著重要作用。MMP-9是MMPs家族中研究較多的成員，其在胃癌組織中的表達明顯高于鄰近健康組織，與腫瘤節(jié)點轉(zhuǎn)移分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等有著密切關(guān)系[13]。Bcl-2家族在細(xì)胞凋亡的線粒體途徑中發(fā)揮著重要作用，Bcl-2和Bax是該家族中的重要成員，分別發(fā)揮抑癌基因和促癌基因的作用，兩者通過形成異源二聚體調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性，Bcl-2/Bax值決定了細(xì)胞生長或凋亡。Bcl-2表達增加和Bax表達下降可能是胃癌細(xì)胞凋亡受到抑制的重要原因[14]。半胱氨酸蛋白酶(Caspase)系列級聯(lián)切割過程是細(xì)胞凋亡的重要執(zhí)行過程，切割激活Caspase-3酶原后，活化的Caspase-3發(fā)揮調(diào)控作用，引起細(xì)胞凋亡。Caspase-3表達水平有可能是晚期胃癌治療和生存不良反應(yīng)的一個重要預(yù)測指標(biāo)[15]。有研究[16]指出，他汀類藥物可能通過調(diào)控MMP-9、Caspase-3、Bcl-2和Bax等基因發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。為了進一步觀察阿托伐他汀抗胃癌的分子機制，本研究采用Western blotting檢測阿托伐他汀處理48 h后的SGC-7901細(xì)胞中MMP-9、Cleaved Caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白的表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞中MMP-9和Bcl-2蛋白的表達均隨阿托伐他汀濃度的增加而下降，而Cleaved Caspase-3和Bax蛋白的表達則呈濃度依賴性上升。提示，阿托伐他汀可能通過上調(diào)Cleaved Caspase-3和Bax蛋白和下調(diào)MMP-9和Bcl-2蛋白的表達發(fā)揮抗胃癌的作用。

綜上所述，阿托伐他汀能夠抑制胃癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其作用機制可能與誘導(dǎo)細(xì)胞G0/G1期阻滯、上調(diào)Cleaved Caspase-3和Bax蛋白和下調(diào)MMP-9和Bcl-2蛋白有關(guān)。有研究[17-18]指出，阿托伐他汀與塞來昔布、吡格列酮等藥物聯(lián)用可以增強其抗腫瘤作用，后期還需對阿托伐他汀與其他藥物聯(lián)用抗胃癌作用進行研究，以期為胃癌的治療提供了新的方向，為胃癌以阿托伐他汀為基礎(chǔ)臨床治療奠定理論基礎(chǔ)。