三溴丙酮酸對MCF-7細胞增殖、侵襲的影響及其機制研究*

李浩，戴世龍，趙宇，許博文，張青松

（1.河北省開灤總醫(yī)院 普外科，河北 唐山 063000；2.華北理工大學(xué) 研究生學(xué)院，河北唐山 063210）

乳腺癌是常見的惡性腫瘤之一，部分患者確診時腫瘤已浸潤、轉(zhuǎn)移，因此尋找有效的治療中、晚期腫瘤的藥物具有重要意義。三溴丙酮酸（3 bromopyruvate, 3-BrPA）是可促進凋亡或自噬的抗腫瘤新藥[1-2]。目前，對其抑制腫瘤增殖及侵襲的機制知之甚少。真核轉(zhuǎn)錄起始因子5A2（eukaryotic translation initiation factor 5A2, eIF5A2）、c-myc基 因及轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白1（metastasis-associated protein 1,MTA1）在腫瘤增殖、侵襲中起重要作用[3]。3-BrPA是否通過該途徑發(fā)揮抗腫瘤作用，尚未見報道。本實驗通過研究3-BrPA對eIF5A2、c-myc基因、MTA1表達的影響，探討其抑制腫瘤增殖、侵襲的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株及儀器 乳腺癌MCF-7細胞株由華北理工大學(xué)中心實驗室保存。

1.1.2 主要儀器 iMark酶標儀、Mini-Protean Tetra System、Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell購 自美國伯樂公司，QuantStudioTM6 Flex Real-Time PCR System（美國life公司），超速低溫離心機（美國Sigma公司），Transwell小室（美國Costar公司）。

1.1.3 主要試劑 3-BrPA（大連美侖生物技術(shù)有限公司），MTT（美國Sigma公司），胎牛血清（澳大利亞Bovogen Biologicals公司），Matrigel基質(zhì)膠（美國BD公司），eIF5A2、MTA1兔抗人單克隆抗體（美國Cell Signaling公司），c-myc兔抗人多克隆抗體（美國Epitomics公司），β-actin鼠抗人單克隆抗體（臺灣Arigo公司）；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）試劑盒、SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）試劑盒購自大連寶生生物技術(shù)有限公司，RT-PCR特異性引物（上海英濰捷基貿(mào)易有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及分組 乳腺癌MCF-7細胞在DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清和1%雙抗），置于37℃、5%二氧化碳CO2恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，2 d或3 d換液1次。待長至80%～90%密度時，按1∶2傳代培養(yǎng)。實驗分為5組：加入等量PBS的對照組，75、100、125和150μmol/L 3-BrPA組（實驗組）。

1.2.2 MTT法 利用MTT法檢測細胞增殖情況。取對數(shù)生長期MCF-7細胞，將細胞按5×104個/孔接種于96孔板。細胞貼壁后，實驗組加入等體積不同濃度的3-BrPA（以PBS稀釋），對照組加入等體積PBS，每組6個復(fù)孔，常規(guī)培養(yǎng)24、48和72 h后加入MTT 15μl/孔，37℃孵育4 h，棄上清，加入二甲基亞砜 150μl/孔，搖床上震蕩10 min，酶標儀檢測490 nm處光密度值（optical density, OD值）。細胞存活率=實驗組OD值/對照組OD值×100%，實驗重復(fù)3次。

1.2.3 Transwell實驗 依據(jù)Transwell實驗，研究3-BrPA對MCF-7細胞侵襲的影響。在上室中均勻加入Matrigel膠，加入100μl以無血清培養(yǎng)基重懸的MCF-7細胞懸液，細胞數(shù)約2×104個/孔；下室加入含20% FBS的DMEM培養(yǎng)基600μl。細胞貼壁后，實驗組分別加入等體積的75、100和150μmol/L 3-BrPA溶液，對照組加入等體積PBS，常規(guī)培養(yǎng)24 h后取出Transwell小室，PBS清洗2遍或3遍，4%多聚甲醛固定10 min，用棉簽輕輕拭去室內(nèi)未侵襲出的細胞，瑞士-吉姆薩染色10 min后PBS清洗3遍，每個小室隨機取3個視野采集圖像，實驗重復(fù)3次。

1.2.4 RT-PCR 采用RT-PCR檢測eIF5A2、c-myc及MTA1基因的表達。實驗組MCF-7細胞以100μmol/L 3-BrPA處理24 h，對照組加入與藥物等體積的PBS，提取細胞總RNA，純度控制在1.8～2.1。按照RT-PCR試劑盒說明書進行操作。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s；60℃退火34 s，共40個循環(huán)。以2%瓊脂糖凝膠電泳行熒光擴增產(chǎn)物驗證。采用2-ΔΔCt法對結(jié)果進行分析，β-actin為內(nèi)參，引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

1.2.5 Western blot檢測 采用 Western blot檢測eIF5A2、c-myc及MTA1蛋白的表達。用藥物處理各組細胞24 h，BCA法定量提取蛋白，與5×上樣緩沖液按4∶1的比例混合均勻后煮沸3～5 min備用。制膠、電泳、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，4℃孵育一抗過夜。TBST漂洗3次，5 min/次，搖床上二抗孵育2 h，TBST漂洗3次，5 min/次。化學(xué)發(fā)光劑顯影，內(nèi)參選用β-actin，采用Image J軟件分析圖像灰度值，每組實驗重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組比較用t檢驗，多組比較用方差分析，方差齊則兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3-BrPA對乳腺癌MCF-7細胞的生長抑制作用

24、48和72 h時，5組MCF-7細胞存活率比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。3-BrPA作用于乳腺癌MCF-7細胞后，細胞存活率降低，并具有劑量和時間依賴性。進一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗，3-BrPA作用24 h時，75和100μmol/L 3-BrPA組細胞存活率與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；藥物處理48 h時，各實驗組較對照組細胞存活率降低（P＜0.05）；150與125μmol/L 3-BrPA組細胞存活率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；3-BrPA作用于細胞72 h時，各實驗組較對照組細胞存活率降低（P＜0.05）；75和100μmol/L 3-BrPA作用于細胞后，其存活率隨藥物作用時間延長而降低（P＜0.05）。見表2和圖1。

表2 各組不同時間點MCF-7細胞存活率比較 （%，±s）

表2 各組不同時間點MCF-7細胞存活率比較 （%，±s）

注：?與對照組比較，P ＜0.05

24 h 48 h 72 h對照組 100.00±0.00 100.00±0.00 100.00±0.00 75μmol/L 3-BrPA組 94.85±6.20 83.00±2.60? 74.58±5.75?100μmol/L 3-BrPA組 82.4±12.59 68.79±6.07? 59.62±12.6?125μmol/L 3-BrPA組 26.38±10.16? 20.75±7.72? 17.83±3.82?150μmol/L 3-BrPA組 16.43±2.91? 12.37±3.18? 12.78±3.50?F值 152.206 394.904 191.023 P值 0.000 0.000 0.000組別

圖1 各組不同時間點MCF-7細胞存活率比較 （±s）

2.2 3-BrPA對MCF-7細胞侵襲的影響

MCF-7細胞經(jīng)3-BrPA處理24 h時，對照組，以及75、100和150μmol/L 3-BrPA組細胞數(shù)分別為（281.67±18.77）、（159.00±24.06）、（76.33±9.07） 和（40.67±11.50）個，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=119.894，P=0.000），各組穿過的細胞數(shù)不同。進一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗，與對照組相比，各實驗組細胞數(shù)降低，且具有劑量依賴性（P＜0.05）。見圖2。

2.3 3-BrPA對eIF5A2、c-myc及MTA1基因表達的影響

RT-PCR結(jié)果表明，標準化對照組基因表達量為（1.000±0.000），則 100μmol/L 3-BrPA 組eIF5A2、c-myc及MTA1基因的相對表達量分別為（0.764±0.088）、（0.735±0.144）和（0.606±0.095）。100μmol/L 3-BrPA作用24 h時的eIF5A2、c-myc及MTA1基因表達水平與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.664、3.186和7.170，P=0.010、0.033 和 0.019），100μmol/L 3-BrPA組較對照組降低。見圖3。

2.4 3-BrPA對eIF5A2、c-myc及MTA1蛋白表達的影響

MCF-7細胞經(jīng)3-BrPA處理24 h后，75和100μmol/L 3-BrPA組、對照組eIF5A2、c-myc及MTA1蛋白表達水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），75和 100μmol/L 3-BrPA 組較對照組降低。進一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗，75μmol/L 3-BrPA組eIF5A2蛋白表達水平與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；100μmol/L 3-BrPA組eIF5A2蛋白表達水平較對照組降低（P＜0.05）；與對照組相比，c-myc和MTA1蛋白表達量經(jīng)3-BrPA處理后均降低，且具有濃度依賴性（P＜0.05），其中MTA1蛋白降低更明顯。見表3和圖4。

圖2 3-BrPA作用24 h時各組MCF-7細胞侵襲情況 （×200）

圖3 對照組與100μmol/L 3-BrPA組eIF5A2、c-myc及MTA1基因相對表達量比較 （±s）

表3 各組eIF5A2、c-myc及MTA1蛋白表達水平比較 （±s）

表3 各組eIF5A2、c-myc及MTA1蛋白表達水平比較 （±s）

注：?與對照組比較，P ＜0.05

eIF5A2 c-myc MTA1對照組 0.971±0.102 1.029±0.112 1.549±0.045 75μmol/L 3-BrPA組 0.821±0.057 0.687±0.057? 1.049±0.125?100μmol/L 3-BrPA組 0.628±0.083? 0.516±0.069? 0.368±0.044?F值 12.976 29.749 160.834 P值 0.007 0.001 0.000組別

圖4 各組eIF5A2、c-myc及MTA1蛋白的表達 （±s）

3 討論

乳腺癌發(fā)病率居女性腫瘤之首，且近10年仍有上升趨勢[4]。部分患者被確診為乳腺癌時，已發(fā)生浸潤及遠處轉(zhuǎn)移，此時化療具有重要意義。3-BrPA是近年發(fā)現(xiàn)的一種新型有效的抗腫瘤藥物，目前處于研究階段，尚未進入臨床應(yīng)用。以往的研究主要集中在對腫瘤糖代謝及凋亡方面的研究[5]，關(guān)于其抑制腫瘤增殖及侵襲的機制知之甚少。

eIF5A2在胃腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、非小細胞性肺癌及食管癌等實體腫瘤中均有過表達[6]。eIF5A2過表達與患者生存期的縮短呈正相關(guān)，并且會增加腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移，促進腫瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。降低eIF5A2基因的表達，腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化受到抑制。有研究表明，eIF5A2可通過c-myc調(diào)節(jié)MTA1的表達，來降低腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的能力[7-8]。有研究表明，eIF5A2-c-myc/MTA1軸在腫瘤的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、增殖、遷移及侵襲中可能起重要作用[3]。MTA1為eIF5A2的下游靶點，下調(diào)MTA1的表達后，胰腺癌SW1900細胞的增殖、遷移及侵襲作用受抑制，細胞凋亡率增加[9]。MENG等[10]研究提示，下調(diào)eIF5A2基因以降低CyclinD1、CyclinD3的表達，可抑制胰腺癌MKN28細胞的增殖；亦可通過eIF5A2抑制c-myc、MTA1的表達及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化途徑，降低其侵襲和遷移能力。XU等[11]通過miR-9靶向作用于非小細胞肺癌細胞eIF5A2基因后，細胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化受抑制，增殖和遷移能力也降低。MENG等[8]通過siRNA抑制eIF5A2基因，可明顯抑制胃癌細胞的增殖、遷移及侵襲能力。

有研究表明，3-BrPA可以抑制MCF-7細胞增殖，使細胞周期阻滯在S期及G2/M期，并促進其凋亡，該過程可能與降低Bcl-2、c-myc及突變型P53的表達有關(guān)[12]。依據(jù)MTT和Transwell結(jié)果，3-BrAP作用于乳腺癌MCF-7細胞，其增殖和侵襲能力降低；RTPCR和Western blot結(jié)果表明，3-BrPA作用于乳腺癌MCF-7細胞24 h，eIF5A2、c-myc、MTA1基因和蛋白表達水平降低，其中MTA1基因和蛋白降低更為明顯。

綜上所述，3-BrPA可以抑制乳腺癌MCF-7細胞的增殖和侵襲，其機制可能與降低eIF5A2、c-myc、MTA1基因和蛋白的表達有關(guān)，但具體作用機制有待進一步深入研究。目前，3-BrPA尚處于臨床前研究階段，細胞實驗和動物體內(nèi)實驗效果均比較理想。由于3-BrPA在溶劑中的化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，見光易分解。因此，解決藥物成藥問題是其進入臨床應(yīng)用的關(guān)鍵，也是下一步的研究重點。