上海地區(qū)草莓灰霉病病菌種群抗藥性研究

肖 婷， 成 瑋， 顏偉中， 王建華， 許 媛， 吉沐祥， 楊敬輝

(1.江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇句容 212400； 2.上海市農(nóng)技推廣中心，上海 200000)

上海市草莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展始于20世紀(jì)80年代，近年來，隨著產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，草莓種植面積約為2 000 hm2。隨著品種不斷優(yōu)化、栽培水平持續(xù)提高，草莓供應(yīng)從11月持續(xù)到翌年5月，周期長、效益高，是農(nóng)民增收的重要途徑之一，草莓產(chǎn)業(yè)已經(jīng)成為種植業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整的主要內(nèi)容。上海地區(qū)草莓種植均以塑料大棚種植為主，且長期連作。在每年草莓開花后，大棚均須要蓋外層塑料棚膜，這種封閉的生長條件極利于病害的暴發(fā)流行，其中由灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)引起的草莓灰霉病是設(shè)施大棚草莓開花結(jié)果期的主要病害。這是一種世界性病害，廣泛侵染各種蔬果[1]，現(xiàn)階段，生產(chǎn)上防治灰霉病的主要藥劑種類有苯并咪唑類、甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑、琥珀酸脫氫酶抑制劑類、苯胺基嘧啶類等藥劑[2-3]，但這些殺菌劑如多菌靈(carbendazim，簡稱Car)、嘧菌酯(azoxystrobin，簡稱Azo)、吡唑醚菌酯(pyraclostrobin，簡稱Pyr)、啶酰菌胺(boscalid，簡稱Bos)、嘧霉胺(pyrimethanil，簡稱Pyr)、嘧菌環(huán)胺(cyprodinil，簡稱Cyp)等都是單一作用位點(diǎn)殺菌劑，如果長期、多頻次使用，抗藥性會(huì)快速發(fā)展。關(guān)于灰霉病病菌抗藥性方面的報(bào)道，在國內(nèi)外屢見不鮮[4-10]。

鑒于上海地區(qū)目前尚無系統(tǒng)性研究灰霉病病菌種群對(duì)常用殺菌劑的抗藥性，本研究連續(xù)2年系統(tǒng)檢測(cè)上海地區(qū)主要草莓種植地區(qū)灰霉病病菌種群對(duì)9種常用殺菌劑的抗藥性水平，以期探明上海市不同草莓種植地區(qū)灰霉病病菌種群的多藥劑優(yōu)勢(shì)亞種群，因地制宜地提出抗藥性治理策略。

1 材料與方法

1.1 菌株的采集、分離、鑒定

2016年4月和2017年4月分別在上海市嘉定區(qū)、青浦區(qū)、金山區(qū)、閔行區(qū)、崇明區(qū)等的15個(gè)草莓園區(qū)隨機(jī)采取草莓灰霉病病株，于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)分離，挑單孢培養(yǎng)，鑒定其為灰葡萄孢菌(BotrytiscinereaPers.)。共分離得到319株草莓灰霉病病菌，其中2016年有124株，2017年有195株，所有菌株均采用濾紙片法保存，置于-20 ℃冰箱中，備用。

1.2 供試藥劑

本試驗(yàn)所用殺菌劑信息如表1所示。

99%水楊肟酸(salicylhydroxamic acid，簡稱SHAM)，由Sigma-Aldrich公司生產(chǎn)，溶于甲醇，配制成20 000 mg/L母液。均放于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 多菌靈、咪鮮胺、乙霉威的抗藥性檢測(cè)方法

采用區(qū)分劑量法測(cè)定供試菌株對(duì)多菌靈、咪鮮胺(prochloraz，簡稱Pro)、乙霉威(diethofencarb，簡稱Die)的抗藥性，多菌靈、咪鮮胺、乙霉威的區(qū)分劑量分別設(shè)置為10、5、10 mg/L[11]，培養(yǎng)基采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基(購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司)，以不含藥劑的培養(yǎng)基為對(duì)照，接種后于23 ℃培養(yǎng)3 d后進(jìn)行觀察，平板上正常生長的為抗性菌株，不能正常生長的為敏感菌株。所有抗性菌株均進(jìn)行2次重復(fù)再次確認(rèn)。

表1 試驗(yàn)所用殺菌劑的詳細(xì)信息

1.4 嘧菌酯、吡唑醚菌酯、環(huán)酰菌胺的抗藥性檢測(cè)方法

采用區(qū)分劑量法測(cè)定供試菌株對(duì)嘧菌酯、吡唑醚菌酯、環(huán)酰菌胺的抗藥性，嘧菌酯和吡唑醚菌酯的區(qū)分劑量均設(shè)置為10 mg/L[12]，環(huán)酰菌胺的區(qū)分劑量設(shè)置為5 mg/L，培養(yǎng)基采用1%麥芽浸粉瓊脂(MEA)培養(yǎng)基，包含氯霉素麥芽提取物瓊脂(購自青島海博生物技術(shù)有限公司)和瓊脂粉，以不含藥劑的培養(yǎng)基為對(duì)照。為防止旁路氧化[13]，嘧菌酯和吡唑醚菌酯及其對(duì)照培養(yǎng)基中均含有100 mg/L SHAM，于23 ℃培養(yǎng)3 d后進(jìn)行觀察，平板上正常生長的為抗性菌株，不能正常生長的為敏感菌株。所有抗性菌株均進(jìn)行2次重復(fù)再次確認(rèn)。

1.5 啶酰菌胺的抗藥性檢測(cè)方法

采用區(qū)分劑量法測(cè)定供試菌株對(duì)啶酰菌胺抗藥性的濃度為1 mg/L[14]，采用酵母浸出粉胨葡萄糖(YBA)培養(yǎng)基(10 g酵母粉，10 g蛋白胨，20 g醋酸鈉，15 g瓊脂，蒸餾水定容至 1 000 mL)制作藥皿。設(shè)不加藥劑的培養(yǎng)基為空白對(duì)照，于 23 ℃ 培養(yǎng)2 d后進(jìn)行觀察，平板上病菌孢子正常萌發(fā)、菌絲正常生長的確定為抗性菌株，不能正常生長的確定為敏感菌株。所有抗性菌株均進(jìn)行2次重復(fù)再次確認(rèn)。

1.6 嘧霉胺、嘧菌環(huán)胺的抗藥性檢測(cè)方法

采用區(qū)分劑量法測(cè)定供試菌株對(duì)嘧霉胺、嘧菌環(huán)胺的抗藥性，兩者的區(qū)分劑量均設(shè)置為5 mg/L，采用察氏瓊脂(CZA)培養(yǎng)基(2.00 g NaNO3，1.00 g K2HPO4，0.50 g KCl，0.50 g MgSO4，0.01 g FeSO4，30.00 g蔗糖，20.00 g瓊脂，蒸餾水定容至 1 000.00 mL)制作藥皿。設(shè)不加藥劑的培養(yǎng)基為空白對(duì)照，于 23 ℃ 培養(yǎng)2 d后進(jìn)行觀察，平板上病菌孢子正常萌發(fā)、菌絲正常生長的確定為抗性菌株，不能正常生長的確定為敏感菌株。所有抗性菌株均進(jìn)行2次重復(fù)再次確認(rèn)。

1.7 數(shù)據(jù)分析

統(tǒng)計(jì)不同地區(qū)不同藥劑抗性菌株的數(shù)量，分析其抗性水平。不同采樣點(diǎn)菌株抗性頻率的計(jì)算公式：抗性頻率=抗性菌株數(shù)量/測(cè)試菌株數(shù)量×100%。

統(tǒng)計(jì)并分析抗性菌株的多重抗藥性表型。

2 結(jié)果與分析

2.1 上海市不同地區(qū)草莓灰霉病病菌種群對(duì)藥劑的抗藥性檢測(cè)結(jié)果

為準(zhǔn)確快速區(qū)分灰霉病病菌對(duì)9種藥劑的抗藥性，以含有藥劑平板上灰霉孢子正常萌發(fā)生長的菌株判定為抗性菌株，不能正常萌發(fā)生長的菌株判定為敏感菌株。由圖1可知，2016年和2017年采集的灰霉病病菌菌株中未檢測(cè)到對(duì)咪鮮胺和環(huán)酰菌胺產(chǎn)生抗性的菌株，所有供試菌株對(duì)咪鮮胺和環(huán)酰菌胺均表現(xiàn)為敏感，而對(duì)多菌靈、嘧菌酯、吡唑醚菌酯、乙霉威等的抗性頻率較高。2016年對(duì)多菌靈產(chǎn)生抗性的菌株高達(dá)81.55%，其次為嘧菌酯、吡唑醚菌酯、乙霉威，其抗性頻率分別為76.14%、74.06%、58.72%。與2016年相比，2017年所采集的菌株對(duì)多菌靈、嘧菌酯、吡唑醚菌酯、乙霉威的抗性頻率均有所下降，分別為60.87%、57.15%、56.46%、42.67%。

2.2 上海市不同地區(qū)草莓灰霉病病菌種群對(duì)藥劑的抗藥性分布

2016年測(cè)定采自嘉定區(qū)(30株)、青浦區(qū)(52株)、金山區(qū)(42株)等3個(gè)地區(qū)的灰霉病病菌菌株對(duì)9種藥劑的敏感性，抗性菌株共計(jì)110株，嘉定區(qū)、青浦區(qū)、金山區(qū)的抗性菌株占比分別為80%、92.31%、88.1%，上述3地的草莓灰霉病抗性菌株群體已成為田間主導(dǎo)種群。2017年測(cè)定采自閔行區(qū)(24株)、嘉定區(qū)(45株)、青浦區(qū)(70株)、崇明區(qū)(56株)等4個(gè)地區(qū)的灰霉病病菌菌株對(duì)9種藥劑的敏感性，抗性菌株共計(jì)133株，閔興區(qū)、嘉定區(qū)、青浦區(qū)、崇明區(qū)的抗性菌株占比分別為20.83%、100.00%、78.57%、56.36%。由圖2可知，2017年嘉定區(qū)供試菌株除了對(duì)乙霉威的抗性頻率比2016年略低以外，對(duì)其余供試藥劑的抗性頻率均呈明顯上升趨勢(shì)，且抗性頻率均高于50%，該地區(qū)田間主導(dǎo)種群為抗性菌株群體；青浦區(qū)的灰霉病病菌菌株群體與2016年的檢測(cè)結(jié)果趨勢(shì)相當(dāng)，抗性頻率略有下降，但抗性菌株群體依然是主導(dǎo)種群，而崇明區(qū)抗性菌株群體與敏感菌株群體的比例相當(dāng)，須指出的是閔行區(qū)田間灰霉病病菌群體依然以敏感菌株為主導(dǎo)。

2.3 上海地區(qū)草莓灰霉病病菌種群多重抗藥性表型分析

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，重點(diǎn)選取了多菌靈(Car)、啶酰菌胺(Bos)、嘧菌酯(Azo)、嘧霉胺(Pyr)等分析多重抗藥性。由圖3可知，2016年和2017年243株抗性菌株的抗藥性表型共有9種。其中，單抗菌株有3種類型，分別為AzoR、CarR、PyrR，分別有9、16、1株，共26株，占總抗性菌株的比例為10.70%；雙抗菌株有3種類型，分別為CarRPyrR、CarRAzoR、CarRBosR，分別有1、64、2株，共67株，占總抗性菌株的比例為27.57%；三抗菌株有2種類型，分別為CarRAzoRPyrR、CarRBosRAzoR，分別有51、53株，共104株，占總抗性菌株的比例為42.80%；四抗菌株類型為CarRBosRAzoRPyrR，有46株，占總抗性菌株的比例為18.93%。2016年多重抗藥性表型以雙抗類型(CarRAzoR)和三抗類型(CarRAzoRPyrR、CarRBosRAzoR)為優(yōu)勢(shì)亞種群，分別占2016年測(cè)定菌株總數(shù)的25.45%、20.91%、25.45%，而四抗類型占13.64%。與2016年相比，2017年的多重抗藥性表型略有變化，單抗類型AzoR、PyrR、雙抗類型CarRBosR及三抗類型CarRBosRAzoR所占比例略有下降，而其他優(yōu)勢(shì)亞種群所占比例均有所上升，CarRAzoR、CarRAzoRPyrR、CarRBosRAzoRPyrR所占比例分別為27.07%、21.05%、23.31%，其中四抗類型菌株數(shù)量上升最多，所占比例由2016年的13.64%上升至2017年的23.31%。上海地區(qū)草莓灰霉病病菌的多重抗藥性表型以CarRAzoR、CarRAzoRPyrR、CarRBosRAzoR、CarRBosRAzoRPyrR為優(yōu)勢(shì)亞種群，呈現(xiàn)出單抗類型比例減少多抗類型比例上升的演變趨勢(shì)。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)于2016年和2017年分別在上海市嘉定區(qū)、青浦區(qū)、金山區(qū)、閔行區(qū)、崇明區(qū)等采集319株草莓灰霉病病菌菌株，測(cè)定了菌株對(duì)多菌靈、乙霉威、咪鮮胺、吡唑醚菌酯、嘧菌酯、環(huán)酰菌胺、啶酰菌胺、嘧霉胺、嘧菌環(huán)胺等的抗藥性。采集的所有菌株均對(duì)咪鮮胺、環(huán)酰菌胺表現(xiàn)為敏感，未檢測(cè)到抗性菌株，但對(duì)多菌靈的抗藥性穩(wěn)居榜首，這與文獻(xiàn)報(bào)道中，江蘇省南京市、鎮(zhèn)江市草莓灰霉病病菌對(duì)多菌靈產(chǎn)生了很高的抗藥性[15]相一致。從2年的結(jié)果來看，嘉定區(qū)灰霉病病菌菌株對(duì)嘧菌酯和吡唑醚菌酯的抗性頻率呈上升趨勢(shì)，抗性頻率由2016年的70%上升至2017年的 97.78%，抗性菌株已經(jīng)成為優(yōu)勢(shì)種群?；矢\(yùn)紅等在2013年也曾報(bào)道了浙江省灰霉菌對(duì)嘧菌酯的抗藥性也呈現(xiàn)此種趨勢(shì)[10]。嘧霉胺和嘧菌環(huán)胺的抗藥頻率目前處于抗性發(fā)展階段，趙虎等在南京、鎮(zhèn)江等地區(qū)采集的菌種中檢測(cè)到的草莓灰霉病病菌對(duì)嘧霉胺抗藥性高達(dá)83%[15]，2016年徐州市草莓灰霉病病菌對(duì)嘧霉胺的抗藥性也高達(dá)53.76%[16]?？梢姴葺颐共?duì)嘧霉胺的抗性問題也應(yīng)引起高度重視。

不同地區(qū)由于管理水平和用藥選擇壓力不同，抗性分布并不均勻，閔行區(qū)和崇明區(qū)相對(duì)于嘉定區(qū)、青浦區(qū)、金山區(qū)抗性頻率明顯較低。在閔行區(qū)采集的菌株對(duì)所有供試藥劑以敏感菌株為主，由此可見，此地區(qū)草莓灰霉病病菌以敏感種群為主導(dǎo)，抗性菌株所占比例較小，但生產(chǎn)中仍要注意藥劑的使用次數(shù)和輪換交替用藥的原則，保持田間菌株的敏感性，延長各種藥劑的使用壽命。

通過1年的田間指導(dǎo)用藥、藥劑的合理使用培訓(xùn)等，2017年在青浦區(qū)采集到的菌株對(duì)多菌靈、乙霉威、吡唑醚菌酯、嘧菌酯等的抗藥性均有所下降，但抗性頻率仍處于70%左右，田間依然以抗性群體為優(yōu)勢(shì)群體，而草莓灰霉病病菌菌株對(duì)啶酰菌胺、嘧霉胺、嘧菌環(huán)胺等的抗藥性處于平穩(wěn)期，2年的檢測(cè)結(jié)果相差不大。由此可見，上海地區(qū)草莓產(chǎn)區(qū)的灰霉病病菌對(duì)多菌靈、嘧菌酯、吡唑醚菌酯、乙霉威等呈抗性的種群為主導(dǎo)種群。

藥劑間交互抗藥性分析結(jié)果表明，大部分灰霉病病菌菌株對(duì)多菌靈和乙霉威具有負(fù)交互抗性，因此對(duì)多菌靈產(chǎn)生抗性的菌株多數(shù)對(duì)乙霉威敏感，而對(duì)多菌靈敏感的菌株，即使從來沒有使用過乙霉威，但其仍對(duì)乙霉威表現(xiàn)抗藥性，但本研究發(fā)現(xiàn)乙霉威與多菌靈雙抗菌株在2016年高達(dá)35%，另有報(bào)道乙霉威在研究區(qū)田間的高抗群體達(dá)10%[15]，而作為多菌靈+乙霉威抗藥性治理的黃金搭檔也不能幸免抗藥性的產(chǎn)生，自20世紀(jì)90年代初，世界各國陸續(xù)檢測(cè)到對(duì)多菌靈、腐霉利、乙霉威均具抗性的多抗灰霉菌株，即BenRDicRNpcR[17-19]；而菌株對(duì)吡唑醚菌酯和嘧菌酯具有嚴(yán)重的正交互抗性，檢測(cè)結(jié)果中灰霉病病菌對(duì)嘧菌酯和吡唑醚菌酯的抗性頻率基本相同；菌株對(duì)嘧霉胺和嘧菌環(huán)胺也有一定的交互抗性。另外，菌株雖然對(duì)啶酰菌胺也產(chǎn)生了抗藥性，但抗性水平均處于低抗水平，2016年和2017年抗性水平比較平穩(wěn)，相差不大，因此實(shí)際生產(chǎn)中加大藥劑使用量，仍然可以較好地防控灰霉病的危害。供試9種藥劑，沒有檢測(cè)出對(duì)咪鮮胺和環(huán)酰菌胺產(chǎn)生抗性的菌株，這2種藥劑對(duì)草莓灰霉病病菌依然有很好的防效。

從藥劑的多重抗藥性表型分布來看，從2016年到2017年，單抗菌株逐漸向雙抗菌株發(fā)展，三抗菌株逐漸向四抗菌株發(fā)展，田間草莓灰霉病病菌的多重抗藥性表型以CarRAzoR、CarRAzoRPyrR、CarRBosRAzoR、CarRBosRAzoRPyrR等為優(yōu)勢(shì)亞種群，由此可見，該地區(qū)病菌對(duì)藥劑的多重抗藥性處于發(fā)展階段，具有明顯的發(fā)展趨勢(shì)，而且隨著藥劑的使用，單抗類型比例減小，逐漸向多抗類型演變。因此，在生產(chǎn)過程中要注意不同種類藥劑的輪用、混用，避免抗藥性的快速發(fā)展。