基于線粒體Cytb基因和D-loop區(qū)序列的洪澤湖湖鱭遺傳多樣性分析

李大命， 張彤晴， 唐晟凱， 關浩勇， 劉燕山， 穆 歡， 黃越峰， 潘建林

(1.江蘇省淡水水產研究所/江蘇省內陸水域漁業(yè)資源重點實驗室，江蘇南京 210017； 2.南京師范大學生命科學學院，江蘇南京 210046； 3.江蘇省洪澤湖漁業(yè)管理委員會辦公室，江蘇淮安 223300)

刀鱭(Coilianasus)是一種具有重要經濟價值的洄游性中小型魚類，隸屬于鯡形鳀科(Engraulidae)鱭屬(Coilia)。近年來，由于過度捕撈、環(huán)境污染及水利工程建設等因素，刀鱭天然資源趨于枯竭，保護刀鱭資源刻不容緩[1-4]。湖鱭是刀鱭的一種，為湖泊定居型，沒有洄游習性，它已成為我國淡水湖泊漁業(yè)資源的重要組成部分。研究表明，湖鱭和刀鱭在遺傳上沒有顯著差異，屬于同一種類[5-6]。遺傳多樣性是生物多樣性的一個重要方面，決定了物種的進化潛能和對環(huán)境變化的適應能力。掌握物種的遺傳多樣性水平是物種保護須要了解的重要內容，可以為制定針對性的保護和管理策略提供科學依據(jù)。

魚類線粒體DNA是一種閉合、環(huán)狀的雙鏈DNA分子，具有結構簡單、母系遺傳、不發(fā)生重組及進化速度快等特征，使其成為分子群體遺傳學和分子系統(tǒng)學研究的重要分子標記[7]。細胞色素b(cytochrome b，簡稱Cytb)基因的結構和功能在mtDNA的13個蛋白質編碼基因中是被了解得最為清楚的，且其進化速度適中[8-9]。線粒體DNA控制區(qū)(D-loop)為非編碼區(qū)，因缺乏編碼的選擇壓力而比其他線粒體基因的進化速率更快，富含系統(tǒng)發(fā)育信息[10]。因此，Cytb基因和 D-loop區(qū)序已成為魚類種群遺傳結構與遺傳多樣性研究中常用的2個分子標記。

洪澤湖面積為1 597 km2，是江蘇省第二大淡水湖泊，也是我國第四大淡水湖泊，具有漁業(yè)生產、工農業(yè)及生活用水、航運、旅游、泄洪行洪等多種功能[11]。洪澤湖漁業(yè)資源豐富，對湖區(qū)經濟、社會的發(fā)展有重要作用[12]。最近調查發(fā)現(xiàn)，洪澤湖有63種魚類，刀鱭在洪澤湖漁業(yè)產量的占比超過50%[13]。受江湖阻隔、過度捕撈和生境破壞等多種因素的影響，洪澤湖漁業(yè)的可持續(xù)發(fā)展受到嚴重威脅[13]。到目前為止，尚無有關洪澤湖湖鱭遺傳多樣性水平的研究報道。本研究采用Cytb基因和D-loop區(qū)序列作為分子標記，對洪澤湖湖鱭遺傳多樣性開展研究，這不僅有利于豐富洪澤湖魚類的分子生物學數(shù)據(jù)，而且可以為湖鱭種質資源保護及合理利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本收集和處理

于2016年12月在洪澤湖用刺網(wǎng)捕獲湖鱭，隨機取40尾湖鱭樣本。用無水乙醇固定，帶回實驗室并且置于-20 ℃冰箱中保存。

1.2 DNA提取、PCR擴增及測序

取湖鱭肌肉組織用于基因組DNA的提取。采用Takara公司的DNA提取試劑盒提取總DNA，將DNA溶于滅菌超純水，保存于-20 ℃冰箱中備用。

擴增Cytb基因序列的上游引物為L14724(5′-GACTTGAAAAACCACCGTTG-3′)，下游引物為H15634(5′-CTCCGATCTCCGGATTACAAGAC-3′)[14]；擴增D-loop區(qū)序列的上游引物為DF1(5′-CTAACTCCCAAAGCTAGAATTCT-3′)，下游引物為DR2(5′-ATCTTAGCA- TCTTCAGTG-3′)[2]。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

PCR體系均為50 μL，包括2×Taq酶混合液(1.25 UTaq酶，0.2 mmol/L dNTP，1.5 mmol/L Mg2+)25 μL，各1 μL(10 μmol/L)上、下游引物，1 μL DNA模板，22 μL滅菌超純水。PCR反應條件為94 ℃預變性4 min；94 ℃變性40 s，53 ℃ 退火(Cytb)或55 ℃退火(D-loop)50 s，72 ℃延伸 1 min，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃條件下保存。

PCR產物純化后送生工生物工程(上海)股份有限公司進行雙向測序，測序引物與擴增引物相同。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用ClustalX1.83軟件[15]對獲得的Cytb基因和D-loop區(qū)序列進行多重比較，并人工校對。采用Mega 5.1軟件[16]分析序列堿基組成和變異位點，利用Kimura雙參數(shù)(Kimura-2-parameter)模型計算單倍型之間的遺傳距離，采用鄰接法(neighbour-joining method，簡稱NJ)構建系統(tǒng)進化樹。利用DnaSP 5.0軟件[17]獲得群體序列遺傳多樣性參數(shù)，包括單倍型數(shù)(N)、單倍型多樣性(h)、核苷酸多樣性(π)、平均核苷酸差異數(shù)(K)。采用Tajima’sD和Fu’sFs中性檢驗，同時結合核苷酸不配對分布分析檢驗湖鱭種群歷史動態(tài)。

2 結果與分析

2.1 Cytb基因和D-loop區(qū)序列堿基組成

本研究獲得40條1 141 bp的Cytb基因序列，共檢出14個變異位點，其中有9個簡約信息位點、5個單一信息位點，沒有插入和缺失位點。4種堿基的平均含量分別為A(27.8%)、T(30.6%)、G(14.5%)、C(27.1%)，A+T的含量(58.4%)明顯高于G+C的含量(41.6%)(表1)。在第2、第3位點，堿基G的含量最低，表現(xiàn)出明顯的堿基組成偏向性。

表1 Cytb基因序列堿基組成

本研究獲得40條D-loop區(qū)序列，其長度為1 214～1 290 bp，其中26條長度為1 252 bp，占比65.0%；12條長度為1 290 bp，占比30.0%；1條長度為1 328 bp，占比2.5%；1條長度為1 214 bp，占比2.5%。經比對發(fā)現(xiàn)，D-loop區(qū)序列有4處長度為38 bp的插入或缺失序列。4種堿基的平均含量分別為A(33.3%)、T(33.5%)、G(14.2%)、C(19.0%)，A+T含量(66.8%)明顯高于G+C含量(33.2%)，表現(xiàn)出明顯的堿基組成偏倚性。D-loop區(qū)序列共檢出54個變異位點，其中27個簡約信息位點，27個單一信息位點。

2.2 種群遺傳多樣性參數(shù)

40條Cytb基因序列共定義13個單倍型(Hb1～Hb13)，單倍型Hb6的數(shù)量最多(19個)，占比47.5%；單倍型Hb4和Hb8各有4個，均占比10.0%；單倍型Hb1、Hb3、Hb10各有2個，均占比5.0%；單倍型Hb2、Hb5、Hb7、Hb9、Hb11、Hb12、Hb13的數(shù)量均為1個，占比2.5%。單倍型多樣性為0.762±0.067，核苷酸多樣性為0.002 70±0.000 28，平均核苷酸差異數(shù)為 2.073。40條D-loop區(qū)序列共定義17個單倍型(Hd1～Hd17)，單倍型Hd11數(shù)量最多(21個)，占比52.5%；單倍型Hd3、Hd8、Hd16的數(shù)量均為2個，均占比5.0%；單倍型Hd2、Hd4～Hd7、Hd9～Hd15、Hd17的數(shù)量均為1個，均占比2.5%；單倍型多樣性為0.727±0.078，核苷酸多樣性為 0.006 10±0.001 00，平均核苷酸差異數(shù)為7.378。整體來看，洪澤湖湖鱭種群遺傳多樣性呈現(xiàn)出高單倍型多樣性和低核苷酸多樣性的特征。

2.3 單倍型系統(tǒng)樹

基于Kimura雙參數(shù)模型估算湖鱭單倍型之間的遺傳距離，結果表明，Cytb基因單倍型之間的遺傳距離在0.001～0.004 之間，D-loop區(qū)序列單倍型之間的遺傳距離在0.001～0.018之間。

以鳳鱭(Coiliamystus，GenBank登錄號為KF056322.1)為外群，采用NJ法構建單倍型系統(tǒng)進化樹，結果表明，Cytb基因D-loop區(qū)序列單倍型聚為一支(圖1、圖2)。

表2 洪澤湖湖鱭種群的遺傳多樣性參數(shù)

2.4 種群歷史動態(tài)

基于Cytb基因和D-loop區(qū)序列的中性檢驗結果(表3)表明，Tajima’sD和Fu’sFs中性檢驗產生的D和Fs均為負值，其中僅Cytb基因中性檢驗產生的Fs值統(tǒng)計有極顯著差異(P<0.01)，說明Cytb基因序列進化顯著偏離中性進化。Cytb基因序列核苷酸不配對分布呈單峰類型(圖3)，而 D-loop 區(qū)序列核苷酸不配對分布成多峰型(圖4)。因此綜合來看，洪澤湖湖鱭可能經歷了近期種群擴張事件。

3 結論與討論

遺傳多樣性即基因多樣性，是指種內不同群體間或一個群體內不同個體的遺傳變異的總和。它不僅是生物多樣性的重要組成部分，也是物種多樣性和生態(tài)系統(tǒng)多樣性的基礎，更是生命進化和物種進化的基礎。一個物種的遺傳多樣性與其適應能力、生存能力、進化潛力等密切相關[18-19]。物種的遺傳變異越豐富，對環(huán)境變化的適應能力越強，反之，更容易受到環(huán)境變化的影響[9]。單倍型多樣性和核苷酸多樣性是衡量物種遺傳多樣性的2個常用參數(shù)。本研究采用線粒體Cytb基因和D-loop區(qū)序列作為分子標記，分析洪澤湖湖鱭的遺傳多樣性。結果表明，基于Cytb基因的湖鱭單倍型遺傳多樣性和核苷酸多樣性分別為0.762±0.067、0.001 82±0.000 28，平均堿基差異數(shù)為2.073；基于D-loop區(qū)的湖鱭單倍型遺傳多樣性和核苷酸多樣性分別為0.727±0.078、0.006 10±0.001 00，平均堿基差異數(shù)為7.378，顯示出較高的遺傳多樣性。與基于Cytb基因序列相比，基于D-loop區(qū)序列湖鱭種群的遺傳多樣性相對較高，這是因為魚類線粒體D-loop區(qū)序列受到的選擇壓力較小、進化速率快，而Cytb基因作為線粒體編碼基因，其進化速度相對較慢[7]。已有文獻報道，基于Cytb基因的洞庭湖(h：0.643 3，π：0.002 6)、鄱陽湖(h：0.950 0，π：0.003 4)、太湖(h：0.857 0，π：0.002 1)和巢湖(h：0.901 5，π：0.002)湖鱭的遺傳多樣性水平[20]?？梢缘贸?，洪澤湖湖鱭種群的遺傳多樣性水平高于洞庭湖湖鱭種群，低于鄱陽湖、太湖、巢湖湖鱭種群。因此，洪澤湖湖鱭種群的遺傳多樣性水平有待進一步提高。與湖鱭相比，基于Ctyb基因的刀鱭遺傳多樣性高于湖鱭[8]。同樣，基于D-loop區(qū)序列的刀鱭遺傳多樣性也高于湖鱭[2-4]。這是因為湖鱭是刀鱭的陸封型群體，由于奠基者效應等因素的影響，其遺傳多樣性水平應低于刀鱭[8]。

表3 湖鱭種群的中性檢測結果

整體來看，基于Cytb基因和D-loop區(qū)序列的洪澤湖湖鱭遺傳多樣性呈現(xiàn)出高單倍型多樣性和低核苷酸多樣性的特征。有研究者根據(jù)單倍型多樣性和核苷酸多樣性標準，將魚類進化情景分為4種類型(低h和低π、高h和低π、低h和高π、低h和低π)[21]。可以看出，洪澤湖湖鱭遺傳多樣性屬于第2種類型。湖鱭種群的遺傳多樣性現(xiàn)狀被認為可能是小的有效種群經過一段時間的穩(wěn)定后發(fā)生了擴張，種群快速增長有利于提高對新突變的保持力從而導致核苷酸多樣性降低。已有文獻報道，湖鱭多個地理種群的遺傳多樣性水平均具備這一特征[20]。從種群歷史動態(tài)來看，Tajima’sD和Fu’sFs中性檢驗產生的D和Fs均為負值，且Cytb基因的Fs值統(tǒng)計結果具有顯著性差異，表明DNA進化偏離了中性選擇[22-23]。同時，Cytb基因序列岐點分布圖呈現(xiàn)為單峰型，表明洪澤湖湖鱭近期經歷了種群擴張[24]。

基于Kimura雙參數(shù)模型Cytb基因單倍型之間的遺傳距離在0.001～0.004之間，D-loop區(qū)單倍型之間的遺傳距離在0.001～0.018之間。整體來看，單倍型之間的遺傳距離較小，說明洪澤湖湖鱭個體之間的基因交流不受限制。這是因為湖鱭運動能力較強，個體間基因交流不存在地理隔離限制。從單倍型組成來看，13個Cytb基因單倍型中有19個優(yōu)勢單倍型Hb6，占比47.5%，17個D-loop區(qū)單倍型中有21個優(yōu)勢單倍型Hd11，占比52.5%，大多數(shù)僅有1個單倍型。由此可以看出，洪澤湖湖鱭單倍型組成具有不均勻性。一方面優(yōu)勢單倍型的個體適應能力強，擁有更大的繁殖群體，而低頻率的單倍型則因環(huán)境適應能力差，擁有的繁殖群體較小，更容易對整個種群的遺傳多樣性造成不利影響。因此，須要持續(xù)加強對湖鱭種質資源的保護力度，通過控制捕撈強度、改善水體生態(tài)環(huán)境以及加強資源動態(tài)變化監(jiān)測等措施增加湖鱭資源量，提高其遺傳多樣性水平，改善種群遺傳結構，從而有利于湖鱭資源的可持續(xù)發(fā)展。