藥用石斛育種方法研究進展

宿慶連，易懋升，周曉云，張志勝

（1.廣州花卉研究中心，廣東 廣州 510360；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院，廣東 廣州 510642）

石斛是蘭科（Orchidaceae）石斛屬（Dendrobium）植物的總稱。石斛為多年生草本植物，全世界約有1 500余個原生種，我國以云南、廣西、廣東、海南、貴州和臺灣等省區(qū)為分布中心，已經(jīng)證實的石斛種類有79種［1］。石斛是極具觀賞價值和藥用價值的典型植物，作為園藝植物，石斛花具香氣、花期長，花色鮮艷，與蝴蝶蘭、卡特蘭、大花蕙蘭并稱 “四大洋蘭”，具有極高的觀賞價值；作為藥用植物，傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為石斛具益胃生津、滋陰清熱、潤肺止咳、明目強身等功效，現(xiàn)代藥理研究表明石斛還具增強免疫力、抗腫瘤、抗衰老等功效，也具有極高的藥用價值，目前石斛不僅是石斛夜光丸、石斛清胃散、百花散等成藥的主要配伍成分，還是主要高級保健品的主要原料，不僅在中國被廣泛應(yīng)用于藥品、保健食品、食品、化妝品領(lǐng)域，在美國、韓國和日本，石斛提取物也被廣泛應(yīng)用于藥品、化妝品領(lǐng)域［2］。

石斛作為傳統(tǒng)名貴中藥材，受資源短缺和市場供應(yīng)影響，中國藥典（2010 版）僅收載 5 種，即鐵皮石斛（Dendrobium officinale）、金釵石斛（D.nobile）、流蘇石斛（D.fimbriatum）、美花石斛（D.loddigesii）、束花石斛（D.chrysanthum），但實際供藥用的石斛屬植物多達30余種［3］。一直以來，人們在石斛中藥化學(xué)、藥理學(xué)、栽培學(xué)等方面已做了大量的工作并取得了顯著成果［4］，但在石斛新種質(zhì)選育等方面相對滯后。近年隨著人們生活品質(zhì)的提高和相關(guān)研究的不斷深入，其藥用石斛種質(zhì)和開發(fā)利用也越來越受到國內(nèi)外的關(guān)注。本文通過分析近幾年有關(guān)藥用石斛種質(zhì)創(chuàng)新的文獻資料，從國內(nèi)種質(zhì)資源收集鑒定與評價、雜交育種、誘變育種、倍性育種和基因工程育種等方面綜述藥用石斛種質(zhì)創(chuàng)新現(xiàn)狀和研究成果，旨在為深入開展藥用石斛種質(zhì)創(chuàng)新工作提供參考。

1 藥用石斛種質(zhì)資源收集與評價

1.1 可利用藥用石斛種質(zhì)資源的調(diào)查研究

國內(nèi)石斛原生種是藥用石斛道地種質(zhì)來源。在我國，原產(chǎn)石斛原生種有79種（表1），由于過度開采和人為環(huán)境破壞等原因，導(dǎo)致石斛野生種質(zhì)極為匱乏，可利用種質(zhì)多為人工栽培種。據(jù)統(tǒng)計，國內(nèi)栽培的僅有鐵皮石斛、金釵石斛、流蘇石斛、美花石斛、束花石斛、鼓槌石斛、霍山石斛、齒瓣石斛等主要栽培種，以及細莖石斛、細葉石斛、鉤狀石斛、疊鞘石斛、報春石斛、球花石斛、密花石斛、玫瑰石斛、杯鞘石斛、大苞鞘石斛、兜唇石斛、晶帽石斛、黑毛石斛、短棒石斛、羅河石斛、重唇石斛、海南石斛、串珠石斛等30余種藥用石斛種［5-6］，大部分石斛原生種仍未加以重視和利用，開展藥用石斛種質(zhì)創(chuàng)新，還應(yīng)盡快做好分布中心與主產(chǎn)區(qū)品種調(diào)查，盡可能地豐富現(xiàn)有的可利用的石斛原生資源。

產(chǎn)地不同，石斛藥材的質(zhì)量也不同。諸燕對從浙江、云南兩省12個地區(qū)收集到的17個栽培群體140余份鐵皮石斛資源進行多糖、生物堿、金屬元素含量測定，結(jié)果表明不同產(chǎn)地的鐵皮石斛總生物堿含量存在顯著差異［7］；李永清、徐旭棟等分別利用ISSR和SCo T證實鐵皮石斛群體存在豐富的遺傳多樣性［8-9］，張明宇等利用DALP分析也證實金釵石斛不同居群間存在較高水平的遺傳分化［10］。說明在藥用石斛種質(zhì)資源收集利用上，應(yīng)重視同種石斛不同產(chǎn)地的種質(zhì)差異。

石斛有豐富的園藝栽培種。據(jù)統(tǒng)計，目前石斛已選育出上萬個栽培種［11］。為了進一步開拓春石斛雜交種在藥用方面的潛在價值，章金輝等比較金釵石斛與雜交種多糖、生物堿、氨基酸和礦質(zhì)元素等含量后認(rèn)為，在莖多糖含量方面，石斛雜交種與野生金釵石斛無顯著差異，甚至有個別品種優(yōu)于野生金釵石斛；莖段總生物堿含量方面，Red Cat1雜交種總生物堿含量達到野生金釵石斛的50%左右，具有替代藥用石斛原生種的開發(fā)價值［12-13］。王再花等比較了栽培品種 Dendrobium Second Love‘Tokimeki’與金釵石斛的多糖免疫活性，結(jié)果相近，同樣認(rèn)為具有良好的藥用開發(fā)價值［14］。據(jù)調(diào)查，觀賞石斛多為金釵石斛、鼓槌石斛、球花石斛、密花石斛等雜交種，拓寬藥用石斛資源的調(diào)查范圍、篩查藥用成分含量較高的園藝品種，也是豐富藥用石斛資源的重要途徑。

表1 分布于國內(nèi)的石斛原生種［1］

1.2 藥用石斛種質(zhì)資源的收集保存與評價

石斛種質(zhì)資源保存和資源圃建設(shè)工作得到充分重視。自2001年生物資源上升為國家安全戰(zhàn)略資源以來，北京于2004年依托北京中醫(yī)藥大學(xué)，在貴州黔西南建立國內(nèi)首個藥用石斛種質(zhì)資源圃，收集石斛屬植物30多個種、種質(zhì)資源35份［15］；福建于2012年由三明市農(nóng)業(yè)科學(xué)院從云南和福建收集野生石斛資源31份開展創(chuàng)新研究［16］等；浙江2012年前后，以浙江農(nóng)林大學(xué)為代表的科研院所和一些生產(chǎn)企業(yè)針對鐵皮石斛創(chuàng)新利用收集了浙江、廣西、云南、貴州、江西、湖南、安徽、福建等省份石斛屬物種40余個，鐵皮石斛種質(zhì)資源300余份，并建立了藥用石斛種質(zhì)資源庫［17］。廣東也是最早開展石斛資源收集和品種選育的重點省份之一，2002年起，廣東名優(yōu)花卉種質(zhì)資源圃、南藥種質(zhì)資源圃等開始建設(shè)、廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境園藝研究所和作物研究所、廣州花卉研究中心開展了藥用石斛的資源收集和品種選育工作，目前廣東省農(nóng)科院環(huán)境園藝研究所已收集石斛屬資源112份，廣州花卉研究中心已收集原生種資源85個、栽培種64個，其中包括鐵皮石斛、金釵石斛、流蘇石斛、美花石斛、束花石斛等30多個具有較高藥用價值的種質(zhì)資源。

石斛種質(zhì)資源評價工作相對滯后。在藥用石斛資源質(zhì)量評價上，目前《中國藥典》僅對資源豐富、產(chǎn)量較大的種如鐵皮石斛、金釵石斛、鼓槌石斛、流蘇石斛等的指標(biāo)性成分加以控制，對其他種石斛尚無質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。在種質(zhì)資源選育利用評價上，斯金平等從多糖、生物堿、氨基酸、金屬元素含量等質(zhì)量性狀以及抗寒性、抗病蟲害能力、萌蘗能力、外觀等農(nóng)藝性狀方面對鐵皮石斛差異性進行評價，發(fā)現(xiàn)一批多糖含量、抗寒性、萌蘗性、生長速度等特異的鐵皮石斛種質(zhì)［17］。張鵬博等從莖稈顏色、莖長、莖粗、莖節(jié)數(shù)、葉面積等主要表型性狀和石斛多糖含量方面，對80份野生鐵皮石斛資源開展收集評價［18］。從目前種質(zhì)資源評價利用情況來看，藥用石斛種質(zhì)資源評價利用僅限于鐵皮石斛等少數(shù)種。

2 藥用石斛育種方法

2.1 雜交育種

雜交育種是目前藥用石斛品種創(chuàng)新和種質(zhì)改良的主要手段。在雜交育種技術(shù)研究上，羅煥明等選用鼓槌石斛、兜唇石斛、鐵皮石斛、金釵石斛、報春石斛和翅梗石斛進行自花授粉、同株異花授粉、異株授粉和自然授粉的結(jié)果表明，人工異株授粉能大大提高石斛屬植物的結(jié)實率，鐵皮石斛自花授粉的結(jié)實率以開花第2～3 d結(jié)實率最高可達36.7%［19］；潘春香等測定了玫瑰石斛、鼓槌石斛、細莖石斛和金釵石斛4種藥用石斛種間親和力，結(jié)果表明4種石斛種間親和力較高，不存在遠緣雜交不育性，花期授粉成功率較高［20］；李振堅等以晶帽石斛、鼓槌石斛、兜唇石斛、大苞鞘石斛、杯鞘石斛、齒瓣石斛等6個石斛蘭原種為親本進行自交，結(jié)果多數(shù)株間自交結(jié)實率高于株內(nèi)自交，株間自交鼓槌石斛和兜唇石斛授粉結(jié)實率＞80%，株內(nèi)大苞鞘石斛的自交親和力高、晶帽石斛的自交親和力低［21］。朱勝蕾按Schlechter分組把石斛分成 12個“組”中，通過檢索英國皇家園藝學(xué)會（RHS）中蘭花登錄情況分析認(rèn)為模式組、黑毛組組內(nèi)雜交更易產(chǎn)生后代，短花組、燈籠組、心葉組、寡花組、鳥腳組組間雜交更易產(chǎn)生后代，優(yōu)秀石斛蘭品種組內(nèi)雜交種和組間雜交種比例相當(dāng)，組內(nèi)雜交種黑毛組最多，組間雜交種蝴蝶組和羚羊組最多等［1］，從譜系關(guān)系上揭示藥用石斛雜交工作開展方向。在藥用石斛種質(zhì)改良上，蔡永萍通過雜交技術(shù)以霍山石斛、細莖石斛為母本對霍山石斛進行種質(zhì)改良，結(jié)果表明其F1代的年生莖鮮重分別為親本霍山石斛、細莖石斛的4.23、1.11倍，產(chǎn)量分別為親本的3.91、1.11倍，有效藥用成分和營養(yǎng)成分優(yōu)于細莖石斛，比霍山石斛略低，F(xiàn)1代石斛多糖復(fù)合物的結(jié)構(gòu)特征與兩親本相似，雜交后代石斛多糖的結(jié)構(gòu)特征沒有較大的變化，F(xiàn)1代石斛多糖復(fù)合物的體外清除自由基的作用與兩親本相似，雜交不影響其后代石斛多糖體外清除自由基的能力［22］，揭示了藥用石斛可以通過人工雜交技術(shù)進行品質(zhì)提升和種質(zhì)改良。

藥用石斛品種選育取得了階段性成果。從表2、表3可以看出，目前藥用石斛已選育出新種質(zhì)54個，按審定和登記地區(qū)劃分，云南選育品種34個、廣東11個、浙江5個、廣西2個、四川1個、福建1個，以云南最多；從品種上劃分，鐵皮石斛有38個、齒瓣石斛5個、金釵石斛1個、疊鞘石斛1個、鼓槌石斛1個、兜唇石斛1個、球花石斛1個、細莖石斛1個、霍山石斛1個；從藥用石斛育種現(xiàn)狀來看，目前仍以選育鐵皮石斛品種為主［17，23-24］，齒瓣石斛［25］、金釵石斛、鼓槌石斛［26］、疊鞘石斛［27］等也有新品種推出，但總體數(shù)量相對偏少。

表2 廣東、浙江等主產(chǎn)區(qū)審（認(rèn)）定的石斛品種

表3 云南省注冊登記的石斛品種

2.2 誘變育種

誘變育種是在人為條件下利用物理、化學(xué)等因素誘發(fā)生物體產(chǎn)生突變，從中選擇和培育新品種的重要方法，物理誘變應(yīng)用較多的是輻射誘變，即用α、β、γ射線、Χ射線、中子等物理因素誘發(fā)變異，徐程、詹忠根、謝小波等利用137Csγ射線輻照鐵皮石斛原球莖，輻照半致死劑量（LD50）在67.23～86.4 Gy之間，且外部形態(tài)發(fā)生改變的植株，其DNA的倍性發(fā)生了改變，出現(xiàn)相當(dāng)多的非整倍體［28-30］。郭玉梅等采用人工模擬UV-B輻射照射處理鐵皮石斛幼苗，植株總多糖、總黃酮、總生物堿含量等主要次生代謝產(chǎn)物增加［31］。化學(xué)誘變方面，金清等利用一氧化氮（NO）的供體硝普鈉（SNP）處理霍山石斛雜交種的類原球莖能提高組培藥用石斛生物堿含量［32］。顯然，誘變育種是選育藥用成分含量高、適應(yīng)性及抗逆性較強的石斛新優(yōu)品種的新途徑。但目前尚未見利用甲基磺酸乙酯（EMS）等烷化劑、5-溴尿嘧啶（BU）等核酸堿基類似物、重氮絲氨酸等抗生素處理藥用石斛的化學(xué)誘變的報道。

2.3 倍性育種

倍體育種是目前植物新品種選育的常用手段，利用多倍體植物的巨大性、旺盛的新陳代謝和較強的抗逆性可提高藥用石斛產(chǎn)量、石斛堿和多糖含量及獲得抗逆品種。由于利用物理方法誘導(dǎo)多倍體的誘導(dǎo)率不高，且在蘭花多倍體育種中未見相關(guān)報道，目前石斛多倍體育種的誘導(dǎo)常用秋水仙素等化學(xué)藥劑處理為主［33］。廖蘇梅用秋水仙素誘導(dǎo)鐵皮石斛多倍體，結(jié)果表明原球莖或已萌發(fā)的種胚經(jīng)秋水仙素溶液浸泡后再培養(yǎng)，或者把種胚接種在添加秋水仙素培養(yǎng)基中，均可誘發(fā)鐵皮石斛多倍體，以萌發(fā)40 d的種胚在0.3%秋水仙素中浸泡36 h，誘變率最高，達63.51%［34］；李涵等用秋水仙素處理齒瓣石斛叢生芽以0.03%處理24 h誘導(dǎo)效果最好［35］；徐程利用濃度0.05%的秋水仙素處理種胚原球莖10 d獲得鐵皮石斛四倍體植株［28］；張靜靜在培養(yǎng)基中添加秋水仙素的方法處理鐵皮石斛類原球莖和種子，發(fā)現(xiàn)種子在秋水仙素濃度為50 mg/L的處理，誘導(dǎo)率高達 50%，且多是四倍體［36］；卓孝康用浸泡法和混配法對大苞鞘石斛進行多倍體誘導(dǎo)，結(jié)果浸泡法以秋水仙素濃度為0.1%、處理時間為12 h，誘變率最高，達26.0%，混配法以秋水仙素濃度為0.03%的誘導(dǎo)效果最好，誘變率達34.0%［37］。經(jīng)誘導(dǎo)處理石斛多倍體植株在形態(tài)、氣孔直徑以及染色體數(shù)目上均有明顯的改變，形態(tài)上出現(xiàn)植株粗矮、節(jié)間短、叢生且生長緩慢等顯著特征［35-36］；誘導(dǎo)的鐵皮石斛四倍體植株莖的多糖含量只是二倍體的1.31倍，未達顯著水平［38］。在藥用石斛中是否存在能同時提高多糖含量及生物產(chǎn)量的多倍體資源類型仍有待深入研究。

2.4 基因工程育種

隨著生物遺傳機制探討的深入，在分子水平上干預(yù)生物遺傳特性的技術(shù)日漸成熟。在石斛自身功能基因研究上，據(jù)李清等統(tǒng)計2011—2016年國內(nèi)已克隆參與石斛生長發(fā)育、糖類代謝和菌根互作等類的功能基因40多個［39］，為今后通過石斛自身基因調(diào)控人為提高藥用石斛產(chǎn)量和活性成分含量提供了重要的參考依據(jù)；2016年1月鐵皮石斛全基因組圖譜公布，更為深入揭示鐵皮石斛多糖合成、花形態(tài)建成及抗逆等基因調(diào)控機制、其他藥用石斛種質(zhì)資源的各項生命活動分子機制及人工合成藥用活性成分奠定了堅實的基礎(chǔ)［40］；在遺傳轉(zhuǎn)化上常用的方法有農(nóng)桿菌介導(dǎo)、基因槍法等，其中農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化是應(yīng)用最廣最成功的方法，目前在石斛上已成功導(dǎo)入基因的有抗細菌軟腐病基因aii A-hac D［41］、大麥抗耐鹽基因lea3［42］、調(diào)控生長發(fā)育與抵御脅迫基因NAC［43］、抗建蘭花葉病毒外殼蛋白基因（Cy MV-CP）［44］等。隨著研究的持續(xù)深入，分子標(biāo)記輔助選擇、轉(zhuǎn)基因技術(shù)、基因編輯技術(shù)將是輔助藥用石斛新品種選育的重要技術(shù)手段。

3 展望

石斛作為道地藥材，目前國內(nèi)僅有鐵皮石斛、金釵石斛、鼓槌石斛、流蘇石斛等主要品種的控制性質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，尚無霍山石斛、齒瓣石斛、細莖石斛等實際產(chǎn)量較大的藥用石斛的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，石斛是傳統(tǒng)的多基原名貴中藥材，藥材基原復(fù)雜，不同種類石斛化學(xué)成分差異較大，且部分種類石斛還含有種內(nèi)專屬性成分，在質(zhì)量管理上不宜套用現(xiàn)有的控制標(biāo)準(zhǔn)，建議管理部門今后加快霍山石斛、齒瓣石斛、細莖石斛、疊鞘石斛等藥用控制性質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研發(fā)工作，為優(yōu)質(zhì)石斛資源的開發(fā)利用工作做好基礎(chǔ)性工作。

從目前的藥用石斛保存利用現(xiàn)狀來看，種質(zhì)資源圃的建設(shè)得到了充分的重視，但鑒定與評價工作相對滯后；藥用石斛品種選育雖取得了階段性成果，但國內(nèi)選育品種較為集中，這對石斛產(chǎn)業(yè)的整體開發(fā)是不利的；鑒于石斛屬植物已廣泛應(yīng)用于藥品、保健食品、食品、化妝品領(lǐng)域，石斛品種選育目標(biāo)也應(yīng)可以兼顧多種用途。蔡永萍［22］利用種間雜交改良霍山石斛已獲得了有雜種優(yōu)勢兼具利用價值F1代種質(zhì)，雖然藥理藥效和實證性等還有待驗證，和中醫(yī)藥界接受和采用雜交改良品種作為中藥基原材料還有一個漫長的過程等，但利用傳統(tǒng)雜交優(yōu)勢改良品種將是培育藥用石斛種質(zhì)的新趨勢。利用誘變育種和倍性育種方法已為選育藥用成分含量高、適應(yīng)性及抗逆性較強的石斛新優(yōu)品種探索出新途徑，但距品種開發(fā)尚有一段距離；在基因工程育種上，雖然功能基因克隆、基因組圖譜、轉(zhuǎn)基因成功導(dǎo)入已有較多研究，但分子研究在實際生產(chǎn)中的應(yīng)用并不多。在今后藥用石斛新品種選育上，首先應(yīng)重視藥用石斛質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)研發(fā)、種質(zhì)資源收集保存及資源圃的建設(shè)工作，加強珍稀優(yōu)質(zhì)石斛資源農(nóng)藝性狀和活性成分分析、鑒定與評價利用工作，從種源上保證藥材需要的人工培植的石斛道地性；其次，在藥用石斛新品種選育中要充分利用雜交優(yōu)勢選配親本進行單交、回交、復(fù)交，創(chuàng)制出符合不同用途需求的雜交新種質(zhì)。再次，充分利用現(xiàn)代生物技術(shù)，應(yīng)用分子標(biāo)記輔助育種，物理、化學(xué)誘變育種等多種育種方法進行新品種培育，提高藥用石斛育種水平，滿足生產(chǎn)和市場的需要。