一種適用于甜菜大規(guī)?？焖偬崛NA的方法

閆彩燕 ，鄒奕 ，吳則東 ，興旺 ，李紅俠 *

（1.黑龍江省普通高等學(xué)校甜菜遺傳育種重點實驗室，哈爾濱150080；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院甜菜研究所/黑龍江大學(xué)農(nóng)作物研究院，哈爾濱150080；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北方糖料作物資源與利用重點開放實驗室，哈爾濱150080）

甜菜原產(chǎn)于地中海沿岸，是世界上第二大糖源作物，僅次于甘蔗。隨著分子標(biāo)記技術(shù)在甜菜育種中的廣泛應(yīng)用，目前甜菜的基因組全序列測定工作已經(jīng)完成[1]，為甜菜的遺傳多樣性分析、分子標(biāo)記輔助育種、轉(zhuǎn)基因甜菜培育等工作打下了扎實的基礎(chǔ)[2－8]。而這些實驗都需要大批量的DNA，因此如何快速高效地提取DNA成為了提高實驗效率的關(guān)鍵，用傳統(tǒng)方法大規(guī)模提取DNA費時費力，操作復(fù)雜等問題日益突出，因此尋找一種適用于甜菜大規(guī)?？焖偬崛NA的方法十分重要。目前關(guān)于各種植物DNA提取方法嘗試的報道已有很多，近期的如Biswas等[9]嘗試了一種不使用液氮進行植物DNA提取的方法；Dang等[10]報道了一種能從花生和其他含油種子中快速提取DNA和RNA的方法；Takakura等[11]報道了一種利用蔗糖緩沖液和玻璃纖維過濾器從植物組織中提取DNA的方法；Shi等[12]報道了一種使用濾紙、96孔板和自制無毒緩沖液相結(jié)合的高通量提取植物DNA的方法；李委等[13]報道了一種適用于辣椒的DNA快速提取技術(shù)；芮文婧等[14]報道了一種改進的番茄葉片DNA提取方法并優(yōu)化了SSR反應(yīng)體系。目前實驗室常用的傳統(tǒng)DNA提取方法為使用液氮冷凍樣品然后進行研缽研磨，但這種方法提取的效率較低，研缽研磨較慢，而且樣品容易損失，難以適應(yīng)大批量DNA提取的需求。因此對于普通實驗室來說，一種快速高效低成本的大批量植物DNA提取方法十分必要。經(jīng)我們的實驗證明利用液氮處理和震蕩研磨機相結(jié)合可以快速高效地提取甜菜基因組DNA，提高甜菜分子標(biāo)記輔助育種和遺傳多樣性分析的效率。

1 實驗材料和方法

1.1 實驗材料

實驗中所用到的甜菜樣本均來自于中國農(nóng)科院甜菜研究所試驗田田間取樣，共取兩個甜菜品種：BETA176、MA3001，每個品種取24個個體，共48個樣本。

在田中取樣時，取號的鮮樣直接裝入事先已放好一枚7 mm小鋼珠的2 mL離心管中。裝樣之后馬上將離心管放入放有多個冰袋的保溫箱中，帶回實驗室后，馬上放入－80℃冰箱中保存。

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA提取方法 將裝有樣品的離心管從－80℃冰箱中取出，馬上放入到液氮當(dāng)中，待液氮不再發(fā)出聲音之后，迅速放到研磨機中以30次/s的振蕩頻率振蕩2 min；振蕩之后加入800 μL CTAB緩沖液，使用金屬浴65℃干浴1 h之后置于冰箱保鮮層冷卻至15℃以下；加入400 μL 24∶1的氯仿/異戊醇，上下混勻后放置5 min以上，之后使用高速離心機12 000 r/min離心10 min；取上清液400 μL，裝入新的離心管中，加入400 μL異丙醇，上下混勻；放入冰箱保鮮層靜置30 min以上；使用高速離心機12 000 r/min離心10 min，棄掉上清液；使用70%乙醇潤洗后，放于室溫下待乙醇揮發(fā)干凈，加入100 μL TE緩沖液溶解DNA。

1.2.2 基因組DNA檢測 本次實驗中，我們使用微量分光光度計和SSR分子標(biāo)記兩種方法檢測。微量分光光度計只需1 μL DNA原液即可檢測出DNA濃度和OD260/280比值。SSR分子標(biāo)記檢測時，將所得DNA原液稀釋為10 ng/μL后，使用兩種INDEL引物擴增，PCR體系和程序來自于文獻[15]，檢測方法采用銀染法[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 微量分光光度計檢測結(jié)果

微量分光光度計檢測樣品DNA的濃度和OD260/280，結(jié)果見表1。結(jié)果證明使用該方法提取出的DNA濃度較高，OD260/280的比值在1.84～2.02之間，純度較好，達到實驗預(yù)期。

2.2 INDEL擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果

利用兩個INDEL引物對兩個品種共48個樣品的DNA進行PCR擴增，擴增后使用濃度為8%的PAGE膠進行快速銀染，所得結(jié)果見圖1、圖2。從圖1、圖2可知，該種新的DNA提取方法所得DNA可用于甜菜INDEL分子標(biāo)記。

表1 樣品DNA紫外分光光度計檢測結(jié)果

圖1 引物ND75對甜菜樣本的PCR擴增結(jié)果

圖2 引物ND229對甜菜樣本的PCR擴增結(jié)果

3 結(jié)論

文中所述的甜菜DNA提取方法主要改進之處在于使用振蕩研磨機和鋼珠代替了手工研磨缽研磨，將甜菜樣品直接放于離心管中，研磨后直接加入CTAB，減少了樣品的損失。極大地節(jié)省了人力和時間，提高了整個實驗約30%的效率，并且所得DNA在濃度與純度檢測和PCR擴增中表現(xiàn)良好。因為影響DNA提取效果的兩個主要因素為樣品研磨是否精細和實驗過程樣品應(yīng)避免反復(fù)凍融[17]。本方法利用振蕩研磨機的高速振蕩和鋼珠的配合可保證樣品研磨的精細度，同時也最大程度地避免了樣品的反復(fù)凍融。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的廣泛應(yīng)用，大規(guī)模多數(shù)量的DNA提取已成為實驗室常態(tài)，在這種情況下，本方法可為植物基因組DNA的提取提供一種新的思路和途徑。