DJ-1保護多巴胺能神經(jīng)元抵抗過氧化氫氧化應激損傷的研究

胡霞，陳方方，孔陳蘇

(1.四川省八一康復中心、四川省康復醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，四川 成都 611135；2.新疆維吾爾自治區(qū)鄯善縣人民醫(yī)院醫(yī)務部，新疆 鄯善 838200)

帕金森病(PD)是老年人常見的運動障礙。其主要病理特征是紋狀體中多巴胺能神經(jīng)元的退化和壞死。臨床表現(xiàn)為肌僵直、靜止性震顫等。目前國內(nèi)外帕金森病的發(fā)病機制一直處于探討中，而在臨床治療上也缺乏有效的抗氧化應激以及神經(jīng)保護治療措施[1-4]。PD形成的重要原因與α-突觸核蛋白的異常聚集相關，這更容易在氧化應激環(huán)境中聚集和促進多巴胺能神經(jīng)元的進行性退化和壞死[5]。DJ-1蛋白參與基因轉錄、信號轉導、維持mRNA的穩(wěn)定性以及參與抗氧化應激等過程。在對抗氧化應激治療中，氧化應激的敏感性的增加是由于DJ-1基因的缺陷引起的[6-7]。此外，DJ-1基因可保護細胞免受大鼠多巴胺能神經(jīng)元細胞系和原代多巴胺細胞過氧化氫(H2O2)氧化應激誘導的細胞凋亡[9-10]。本研究自2016年1月至2017年7月建立了用H2O2處理的PC12多巴胺能神經(jīng)元的體外氧化應激模型，探討 DJ-1對多巴胺能神經(jīng)元氧化應激損傷的保護作用與機制，為PD的發(fā)病機制和治療方法提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要儀器和試劑冷凍高速離心機，購買于Thermo Fisher公司；酶標儀，購買于Bio-rad公司；熒光顯微鏡，購買于Olympus公司；熒光定量PCR儀，購買于Bio-rad公司；蛋白電泳儀，購買于Bio-rad公司。

大鼠嗜鉻細胞瘤細胞系(PC12細胞)及胎牛血清(Gibco)購買于中國科學院上海細胞研究所；H2O2購買于上海遠大公司；DHE超氧陰離子熒光探針購買于碧云天公司； DJ-1抗體、TH蛋白抗體和β-actin抗體購買于Abcom公司；CCK-8試劑盒購買于BBI life sciences公司；RNA提取試劑盒購買于上海杰瑞生物技術有限公司；逆轉錄和定量PCR試劑盒均購買于TAKARA。

1.2PC12細胞培養(yǎng)及誘導分化將 PC12細胞系置于 RPMI1640培養(yǎng)基中(含有10只滅活的小牛血清，青霉素100 U·mL-1，鏈霉素100 U·mL-1， L-谷氨酰胺0.12 g·L-1， NaHCO33 g·L-1)，37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將100 μg·L-1神經(jīng)生長因子(NGF)加入PC12細胞培養(yǎng)基中進行分化。隔天更換培養(yǎng)液，培養(yǎng)液中事先加入 NGF，誘導分化進行8 d。形態(tài)學鑒定后，將已經(jīng)分化成多巴胺能神經(jīng)元細胞的PC12細胞系進行后續(xù)實驗。

1.3H2O2誘導的氧化應激損傷模型在96孔板中接種 PC12細胞，處理組分別加入50、100、150 μmol·L-1的H2O2，空白對照組不加H2O2，在1.5 h和3 h后分別采用 CCK-8法檢測 PC12細胞活性。

1.4DJ-1過表達載體的構建DJ-1基因序列由Bioengineering Biotechnology(Shanghai)Co.，Ltd。合成和限制性內(nèi)切核酸酶KpnI和XbaI設計在序列的兩端。隨后將片段連接到pCDH1-cmv載體上。采用氨芐青霉素用于篩選陽性克隆抽提質(zhì)粒，進行DNA序列測定，驗證基因序列和表達框是否正確。

1.5細胞內(nèi)活性氧(ROS)水平檢測處理3 h后，加入用50、100、150 μmol·L-1H2O2處理的PC12細胞培養(yǎng)基，并用PBS洗滌2次。隨后用5 μmol·L-1的DHE染色30 min，DAPI染核。在熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.6PI/Hoechst染色法檢測細胞凋亡在96孔板中接種 PC12細胞，處理組分別加入50、100、150 μmol·L-1的H2O2，空白對照組不加H2O2，反應24 h。PI / Hoechst染色顯微鏡下觀察PC12細胞凋亡，計算細胞凋亡率。

1.7蛋白質(zhì)免疫印跡法(WesternBlot)檢測使用RIPA裂解物裂解細胞，裂解上清液并使用BCA試劑盒測量蛋白質(zhì)濃度。通過半干電泳將SDS-PAGE凝膠電泳應用于PVDF膜，并將第一抗體在4 ℃溫育過夜，將第二抗體溫育1 h，然后顯影并暴露。抗體使用稀釋比分別為：DJ-1 1∶1 000，TH蛋白抗體 1∶2 000，β-actin 1∶2 000。

1.8熒光定量PCR用不同濃度的H2O2處理PC12細胞3 h后，提取總RNA，用TAKARA逆轉錄試劑盒將500 ng總RNA逆轉錄成cDNA。稀釋5倍后用熒光定量 PCR檢測。所用PCR引物如為，DJ-1正向引物：5′-GGTCCTACTGCTCTGTTG-3′，DJ-1反向引物：5′-GTTGTGACTTCCA-TACTTCC-3′；Caspase-3正向引物：5′-AGAGCTGGACTGCGGTATTGAG-3′，Caspase-3反向引物：5′-GAACCATGACCCGTCCCTTG-3′；α-synuclein正向引物：5′-CCTCAGCCCAGAGCCTTTC-3′，α-synuclein反向引物：5′-CCTCTGCCACACCCTGCTT-3′；Bax正向引物：5′-ACACCTGAGCTGACCTTGGA-3′，Bax反向引物：5′-CCGTGTCCACGTCAGCAATC-3；Bcl-2正向引物：5′-AAGCTGTCACAGAGGGGCTA-3′，Bcl-2反向引物：5′-GACGGTAGCGACGAGAGAAG-3′；p53正向引物：5′-GTACCGTATGAGCCACCTGAG-3′，p53反向引物：5′-CGTCCCAGAAGATTCCCAC-3′；β-actin (內(nèi)參)正向引物：5′-AGAAAATCTGGCACCACACC-3′，β-actin (內(nèi)參)反向引物：5′-CTCCTTAATGTCACGCACGA-3′。

1.9統(tǒng)計學方法實驗數(shù)據(jù)由SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學分析。通過單因素方差分析(ANOVA)分析組間比較的結果，并通過SNK-q檢驗進行兩組之間的比較。以P<0.05被認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1H2O2對PC12細胞增殖活性的影響分別用不同濃度的H2O2處理PC12細胞1.5 h和3 h，用CCK-8試劑盒檢測細胞增殖活性。結果如圖1所示，PC12細胞的活性隨H2O2濃度的升高逐漸降低。當H2O2濃度大于100 μmol·L-1時，細胞活性低到一定水平繼續(xù)升高H2O2濃度對細胞活性的影響不大。

注：與0 μmol·L-1的H2O2處理1.5 h組相比較，aP<0.05

圖1H2O2處理對PC12細胞增殖活性影響

2.2H2O2處理對PC12細胞凋亡的影響用不同濃度H2O2處理PC12細胞24 h后，PI結果顯示，PI陽性細胞的隨H2O2濃度的升高而增多，H2O2濃度大于100 μmol·L-1時，超過80%的細胞呈PI陽性，即100 μmol·L-1H2O2可以引起大部分細胞發(fā)生凋亡。

2.3H2O2對DJ-1表達的影響TH蛋白是多巴胺合成的限速酶[11]，而PD的病理學特征之一是紋狀體多巴胺含量顯著減少，所以TH蛋白的表達量是PD的一個重要參數(shù)。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，隨著H2O2處理濃度的升高，TH蛋白表達量逐漸減少(圖2)。

2.4過表達DJ-1對H2O2誘導的PC12細胞凋亡的影響用pCDH1-cmv過表達載體表達DJ-1，轉染到PC12細胞中，pCDH1-cmv空載體組作為對照組，過表達DJ-1組作為實驗組。用100 μmol·L-1的H2O2處理PC12細胞24 h，用PI/Hoechst染色法檢測細胞凋亡情況。結果顯示相對于對照組，DJ-1組細胞的凋亡率降低超過50%，見圖3。

注：與對照組相同H2O2濃度相比較，aP<0.05

圖3DJ-1對H2O2誘導的細胞凋亡的影響(DHE染色×100)

2.5過表達DJ-1對細胞內(nèi)ROS水平的影響H2O2處理PC12細胞3h，pCDH1-cmv空載體組作為對照組，過表達DJ-1組作為實驗組。細胞內(nèi)的ROS水平用DHE探針檢測。結果是經(jīng)過100μmol·L-1H2O2處理后，對照組ROS水平在上升。而在過表達DJ-1后，ROS上升卻受到了抑制，見圖4。

注：與對照組相同H2O2濃度相比較，aP<0.05

圖4DJ-1對H2O2細胞內(nèi)ROS水平的影響(DHE染色×100)

2.6過表達DJ-1對H2O2中凋亡基因表達的影響

pCDH1-cmv空載體作為對照組，過表達DJ-1作為實驗組，用不同濃度的H2O2處理細胞3 h，并用RT-qPCR檢測相關基因的表達變化。結果顯示，隨著H2O2濃度的升高，α-synuclein的表達逐漸增加。同時凋亡相關基因Bax，p53和caspase-3的表達增加，而Bcl-2的表達減少。這些基因的表達變化也許是細胞出現(xiàn)凋亡的主要原因。過表達DJ-1后，α-synuclein表達升高幅度變小。凋亡基因Bax，p53和caspase-3的表達不再隨H2O2濃度的升高而增加，H2O2對Bcl-2的下調(diào)作用也被減弱(圖5)。

3 討論

PD是一種神經(jīng)退行性疾病，其主要病理特征是紋狀體，尤其是黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元(DA)，它們是退行性缺陷。大量文獻證實，紋狀體中多巴胺及其代謝物的減少是由于TH的喪失引起的，導致一系列病理和臨床癥狀[12]。形態(tài)學研究報道了PD患者腦內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元凋亡的顯著變化[13-14]。目前PD黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元凋亡的一個重要因素被認為是由氧化應激引起的活性氧的增加[15-18]。研究表明，多巴胺類固醇和細胞毒性物質(zhì)如 H2O2和超氧化物是H2O2對多巴胺神經(jīng)細胞的損害[19]，在黑質(zhì)鐵離子催化下產(chǎn)生有毒的羥基受損細胞會使多巴胺能神經(jīng)元置于氧化應激狀態(tài)[20]。DA本身還可以與谷胱甘肽結合形成谷胱甘肽-多巴胺，從而減弱PD患者腦內(nèi)的抗自由基能力，增強氧化應激損傷作用[21];此外，由氧化應激引起的DA神經(jīng)元中α-突觸核蛋白的異常修飾和聚集破壞了細胞內(nèi)DA的自我平衡[22]。DA的氧化產(chǎn)生細胞毒性物質(zhì)并且增加細胞自身的氧化應激的損害。使得其持久損害神經(jīng)元[23]。

注：與0 μmol·L-1H2O2處理組相比較，aP<0.05

圖2Western blot檢測H2O2對DJ-1和TH蛋白表達的影響

注：與對照組相同H2O2濃度比較，aP<0.05

圖5RT-qPCR檢測DJ-1對H2O2中凋亡基因表達的影響

DJ-1基因位于人染色體1p36.26.3處，全長是24 kb。有8個外顯子，其中外顯子1A和1B不參與蛋白質(zhì)的編碼，編碼DJ-1蛋白含有外顯子2-7[24]。研究表明， DJ-1可以控制多個抗凋亡的基因，除此之外，還發(fā)現(xiàn)在體內(nèi) DJ-1和體外 DJ-1，他們與 p53均相互作用影響， UV暴露條件下，過表達 DJ-1能夠明顯抑制 p53的轉錄活性，這導致 Bax表達降低并且還抑制胱天蛋白酶-3活性，最終導致小鼠神經(jīng)母細胞瘤細胞的凋亡[25]。另有研究表明， DJ-1在細胞內(nèi)外均具有與多個目的 RNA結合的能力，不乏包括 PTEN/ PI3 K通路上成員、線粒體基因以及谷胱甘肽代謝基因。在氧化應激狀態(tài)下，納摩爾濃度水平的DJ-1即可發(fā)揮上述作用，但有致病性的突變會使其失活，從而上述作用被抑制[26]。

在這里，神經(jīng)生長因子(NGF)用于誘導PC12細胞進入具有長樹突的多巴胺能神經(jīng)元。建立了H2O2誘導的PDPC12細胞氧化應急損傷模型。結果表明，H2O2可顯著抑制PC12細胞的增殖活性。 DHE染色顯示H2O2處理后 PC12細胞內(nèi) ROS水平顯著升高，在長時間的H2O2處理后能夠誘導細胞凋亡，即在H2O2的處理后可以造成 DJ-1蛋白和 TH蛋白的表達下調(diào)。過表達DJ-1后，PC12細胞對H2O2的耐受力升高，細胞內(nèi)的ROS升高受到抑制。DJ-1可以抑制α-突觸核蛋白的表達水平，而p53，Bax和caspase-3的表達水平受到抑制。Bcl-2的表達受到保護，這些功能可以減少細胞凋亡。這些結果表明， DJ-1可以通過調(diào)節(jié) p53， Bax， caspase-3和 Bcl-2的表達，調(diào)節(jié)細胞中的 ROS水平并減弱H2O2誘導的多巴胺神經(jīng)元中的氧化應激損傷。本研究為PD的發(fā)病機制和臨床治療提供了新的靶點。這將帶來PD臨床治療的曙光。

(本文圖3,4見插圖12-1)