響應(yīng)面法優(yōu)化鳳丹內(nèi)生真菌發(fā)酵工藝探究

張培良，許鳳清，王國(guó)凱，王剛，馬宗慧，劉海濤，韓婧，吳娟，吳培云

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院現(xiàn)代中藥安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽，合肥 230012)

丹皮始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[1]，作為安徽省四大道地藥材之一，其道地產(chǎn)區(qū)主要分布于安徽銅陵、南陵等地。《中藥大辭典》明文記載：“安徽省銅陵鳳凰山所產(chǎn)丹皮質(zhì)量最佳”，故道地產(chǎn)區(qū)出產(chǎn)的丹皮又稱為鳳丹皮，其原植物又稱為鳳丹(PaeoniaostiiT. Hong et J.X.Zhang)。丹皮具有抗菌、抗氧化、抗炎、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗腫瘤、降血糖、抗凝血、抗心律失常、抗高血壓、增強(qiáng)免疫功能、抗腦缺血再灌注性損傷、鎮(zhèn)靜、保肝[2-14]等作用。

近年來植物內(nèi)生真菌已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域，且對(duì)鳳丹內(nèi)生真菌的研究較少[15]。鑒于內(nèi)生真菌與宿主植物之間特殊的生物學(xué)關(guān)系，且內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的活性成分，開展對(duì)植物中優(yōu)勢(shì)內(nèi)生真菌的研究極具意義。前期的研究確定鳳丹根皮中內(nèi)生真菌優(yōu)勢(shì)種群為Fusarium[16]。本研究2017年8—11月采用響應(yīng)面分析法對(duì)鳳丹一株優(yōu)勢(shì)內(nèi)生真菌Fusariumoxysporum的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，為其進(jìn)一步研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器Fusariumoxysporum菌株分離于新鮮的鳳丹根皮，并交由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行分子鑒定，經(jīng)過基因測(cè)序?qū)Ρ群箬b定為Fusariumoxysporum(GenBank:KT271765.1)，保存于安徽中醫(yī)藥大學(xué)天然藥化教研室。

十萬(wàn)分之一電子天平(賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；SPT-P250C智能生化培養(yǎng)箱(合肥華德利科學(xué)器材有限公司)；QHZ-98A型全溫振蕩培養(yǎng)箱(常州普天儀器制造有限公司)。

1.2方法

1.2.1菌絲體的制備 將保存于斜面試管中的真菌F.oxysporum轉(zhuǎn)接于活化培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫培養(yǎng)5 d，沿菌落邊緣用打孔器打取6 mm菌片，備用。稱取一定量的馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基粉末，加一定比例的水混合均勻，倒入250 mL錐形瓶中，每個(gè)錐形瓶中100 mL液體培養(yǎng)基，然后不同的錐形瓶中再分別加入不同含量的蔗糖、酵母浸出膏、KH2PO3、K2HPO3，滅菌20 min，待冷卻后，將上述打孔的菌片用鑷子挑取2～3片放入液體培養(yǎng)基中，平板搖床180 r·min-1，28 ℃培養(yǎng)發(fā)酵7 d后，抽濾，得到菌絲體。

1.2.2菌絲體生物量的測(cè)定 菌體生長(zhǎng)過程中發(fā)生代謝，產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物，菌體的生長(zhǎng)可促進(jìn)次生代謝產(chǎn)物含量的增加。將培養(yǎng)7 d的發(fā)酵培養(yǎng)基抽濾，分離出菌絲體，于50 ℃真空干燥箱中烘干至恒重，記錄其重量。

1.2.3響應(yīng)面分析法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) (1)單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：分別以蔗糖、酵母浸出膏、KH2PO3、K2HPO3加入量為考察指標(biāo)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。(2)Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：以單因素實(shí)驗(yàn)及相關(guān)參考文獻(xiàn)為依據(jù)來設(shè)定Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中各因素的水平，以菌絲體生物量為響應(yīng)值，對(duì)影響菌絲體生物量的4個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，同時(shí)，根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)得出響應(yīng)面中心水平(0)本應(yīng)為蔗糖(30 g·L-1)、酵母浸出膏(4 g·L-1)、KH2PO3(1 g·L-1)、K2HPO3(1 g·L-1)，但此時(shí)發(fā)現(xiàn)若按照此中心水平作響應(yīng)面設(shè)計(jì)，則“蔗糖”因素的“1”水平為空，“KH2PO3”和“K2HPO3”兩個(gè)因素的“-1”水平為空，因此，為了完成完整的響應(yīng)面設(shè)計(jì)，從實(shí)際角度出發(fā)，最終RSM實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因子水平見表1。并使用Design-Expert 8.05b對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。

2 結(jié)果

2.1單因素實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1，由結(jié)果可知，綜合考慮，四個(gè)因素的最優(yōu)值分別確定為30、4、1、1 g·L-1。

2.2Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.2.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果和分析 采用RSM實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)菌株的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)因素包括蔗糖、酵母浸出膏、KH2PO3、K2HPO34個(gè)因素，并以單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果為中心水平，進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，確定最佳發(fā)酵條件。使用Design expert 8.05b統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到菌絲體生物量對(duì)A、B、C、D四因素的二次多項(xiàng)式回歸方程：

圖1 4種因素對(duì)菌絲體生物量影響的趨勢(shì)圖

菌絲體生物量=1.54+0.097A+0.003 746B-0.049C-0.040D-0.056AB+0.021AC+0.028AD-0.022BC-0.020BD-0.002 152CD-0.25A2-0.037B2-0.000 998 8C2+0.016D2

2.2.2響應(yīng)面圖與等高線圖分析 圖2A說明蔗糖含量和酵母浸膏含量之間的交互作用顯著；當(dāng)蔗糖含量較小，菌絲體生物量隨酵母浸膏含量的增大表現(xiàn)為上升，當(dāng)蔗糖含量達(dá)到一定值，菌絲體生物量隨著酵母浸膏含量的增大表現(xiàn)為先上升后下降；當(dāng)酵母浸膏含量不變，菌絲體生物量隨著蔗糖含量的增大表現(xiàn)為先上升后下降。圖2B說明蔗糖含量和KH2PO3含量之間的交互作用不顯著；當(dāng)蔗糖含量不變，菌絲體生物量隨著KH2PO3含量的增大而下降；當(dāng)KH2PO3含量不變，菌絲體生物量隨著蔗糖含量的增大表現(xiàn)為先上升后下降。圖2C說明蔗糖含量和K2HPO3含量之間交互作用顯著；K2HPO3含量較小時(shí)，菌絲體生物量隨著蔗糖含量的增大變現(xiàn)為先上升后下降；K2HPO3含量一定時(shí)，菌絲體生物量隨著蔗糖的增大表現(xiàn)為上升趨勢(shì)，當(dāng)蔗糖含量達(dá)到一定時(shí)，菌絲體生物量隨著蔗糖含量的增大趨于平緩。圖2D說明酵母浸膏含量和KH2PO3含量之間交互作用不顯著；酵母浸膏含量一定時(shí)，菌絲體生物量隨著KH2PO3含量的增大而上升；KH2PO3含量一定時(shí)，菌絲體生物量隨著酵母浸膏含量的增加趨于平緩。圖2E說明酵母浸膏含量和K2HPO3含量之間交互作用顯著；酵母浸膏含量一定時(shí)，菌絲體生物量隨著K2HPO3含量的增大而下降；K2HPO3含量一定時(shí)，菌絲體生物量隨著酵母浸膏含量的增大表現(xiàn)為先上升后下降。圖2F說明KH2PO3含量和K2HPO3含量之間交互作用不顯著；KH2PO3含量一定時(shí)，菌絲體生物量隨著K2HPO3含量的增大而下降；K2HPO3含量一定時(shí)，菌絲體生物量隨著KH2PO3含量的增大而下降。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

表3 回歸模型方差分析

圖2 各交互作用對(duì)菌絲體生物量影響的響應(yīng)曲面

2.2.3驗(yàn)證性試驗(yàn) 使用Design Expert 8.05b 對(duì)回歸方程進(jìn)行求解，得出最優(yōu)發(fā)酵工藝為：蔗糖含量20.31 g·L-1，酵母浸膏含量5.17 g·L-1，KH2PO3含量1.00 g·L-1，K2HPO3含量1.00 g·L-1，菌絲體生物量預(yù)測(cè)值為1.660 79 g。考慮實(shí)際情況，確定最優(yōu)發(fā)酵工藝為：蔗糖含量20 g·L-1，酵母浸膏含量5 g·L-1，KH2PO3含量1.00 g·L-1，K2HPO3含量1.00 g·L-1。

按照上述工藝，平行發(fā)酵3瓶發(fā)酵液，測(cè)定實(shí)際平均菌絲體生物量為1.647 g，與預(yù)測(cè)值之間偏差較小，表明此回歸模型能與實(shí)際情況較好擬合。

3 討論

微生物的發(fā)酵是一個(gè)非結(jié)構(gòu)化、曲線的復(fù)雜過程，在發(fā)酵工業(yè)中，發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化對(duì)發(fā)酵水平的提高起著舉足輕重的作用[17]。響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)，克服了正交設(shè)計(jì)只能處理離散的水平值，而無法找出整個(gè)區(qū)域上因素的最佳組合和響應(yīng)值的最優(yōu)值的缺陷，并能減少試驗(yàn)次數(shù)，分析幾種因素間的交互作用，以達(dá)到較全面地反映各因素水平的效果[18-20]。為了獲得最佳的發(fā)酵條件本實(shí)驗(yàn)采用響應(yīng)面法，將因素與結(jié)果的關(guān)系進(jìn)行多項(xiàng)式擬合，優(yōu)選出最佳促菌絲體生物量的發(fā)酵工藝。首先采用單因素試驗(yàn)確定因素水平，進(jìn)一步應(yīng)用響應(yīng)面分析法考察因素對(duì)菌絲體生物量的影響，采用二次回歸設(shè)計(jì)菌絲體生物量回歸模型，驗(yàn)證試驗(yàn)表明了該模型的可靠性。