外源復(fù)合激素對匍匐翦股穎抗褐斑病的誘導(dǎo)抗性

趙春旭，姜寒玉，董文科，陳紅，方彥霞，謝麗萍，馬暉玲*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室，甘肅省草業(yè)工程實驗室，中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

匍匐翦股穎(Agrostisstolonifera)是禾本科翦股穎屬多年生草本植物，因其草質(zhì)細膩，耐頻繁低度修剪，常被用于高爾夫球場果嶺、草地網(wǎng)球場、草地保齡球場等精細草坪[1]。褐斑病是草坪病害中分布最廣的病害之一，是北方冷季型高爾夫球場果嶺上發(fā)生最普遍、最嚴重的病害之一[2]。1914年褐斑病首次在草坪草上被發(fā)現(xiàn)，后由Piper等[3]首次報道其病原菌為立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)，之后又被眾多研究者證實[4-6]。立枯絲核菌是一種土壤習(xí)居菌，傳播迅速，寄主范圍廣，最適生長溫度為30 ℃，一般在溫暖潮濕的區(qū)域發(fā)病率較高，并且該菌幾乎可以侵染所有草坪草，嚴重影響了草坪的質(zhì)量、美觀度以及綠化功能，給草坪生產(chǎn)和經(jīng)營帶來了巨大損失。

目前，草坪病害的防治主要依賴化學(xué)殺菌劑[7-8]，但化學(xué)防治成本較高，且嚴重污染環(huán)境，同時病原物易對殺菌劑產(chǎn)生耐藥性，防治效果逐漸減弱。誘導(dǎo)植物抗病性是指利用物理、化學(xué)以及生物的方法，激發(fā)植物自身對病原微生物的抗病性的現(xiàn)象[9-10]，它具有環(huán)保且抗病周期長的優(yōu)點，已成為植物病害防治的研究熱點，許多化學(xué)因子可誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性。水楊酸(salicylic acid, SA)是植物體內(nèi)一種簡單的酚類物質(zhì)，是一些重要代謝過程的信號分子，參與植株系統(tǒng)抗性的建立，可以顯著提高植株的抗病性；研究表明，外源SA誘導(dǎo)處理植株后，體內(nèi)多酚氧化酶和苯丙氨酸解氨酶活性顯著上升，誘導(dǎo)植株產(chǎn)生抗性[11]。油菜素內(nèi)酯(epibrassinolide, EBR)是一種天然植物激素，它已經(jīng)被公認為第六類植物激素，對植物的生長和發(fā)育、生物和非生物脅迫的發(fā)展起著至關(guān)重要的作用，研究表明EBR可誘導(dǎo)多種植物對真菌、細菌及病毒產(chǎn)生抗性[12]。乙烯(ethylene, ET)是五大類植物激素之一，參與了植物從種子萌發(fā)到成熟以及衰老的一系列生命過程的調(diào)節(jié)及生物和非生物脅迫下植物的抗性反應(yīng)[13]，研究表明當(dāng)植物受到病原物侵染時，乙烯量急劇增加[14]，是病原菌侵染反應(yīng)的報警信號并參與防御反應(yīng)。盡管國內(nèi)外針對植物誘導(dǎo)抗病性也已經(jīng)展開了一系列的研究，但目前國內(nèi)外使用的植物抗病誘導(dǎo)劑仍存在誘導(dǎo)效果不佳，效果不穩(wěn)定，誘導(dǎo)持續(xù)時間不長等缺點。為此，本研究選擇3種化學(xué)激素誘導(dǎo)劑，即油菜素內(nèi)酯(EBR)、水楊酸(SA)及乙烯(ET)，根據(jù)不同外源激素活性特點及作用原理，研究復(fù)合激素以及連續(xù)誘導(dǎo)時間的協(xié)同增效功能，旨在明確不同激素之間的協(xié)同效應(yīng)，篩選出誘導(dǎo)效果更好，抗病持續(xù)時間更長的新型復(fù)合誘導(dǎo)劑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為匍匐翦股穎“Penn-A4”(A.stoloniferacv.“Penn-A4”)，由北京克勞沃草業(yè)技術(shù)開發(fā)中心提供；誘導(dǎo)劑EBR、SA及ET均購自Sigma公司；病原菌：匍匐翦股穎褐斑病病原菌為立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)，購自中國科學(xué)院菌種保存中心。

1.2 試驗設(shè)計

試驗于2017年5-8月在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院溫室內(nèi)進行。選取顆粒飽滿的匍匐翦股穎種子，室溫下蒸餾水過夜浸泡后，經(jīng)75%的乙醇浸泡60 s，然后經(jīng)20% NaClO消毒15 min，然后用無菌水沖洗4～5次，最后用吸水紙將水吸干，種植于含滅菌后營養(yǎng)土(營養(yǎng)土∶蛭石=2∶1，pH 6.5)的育苗缽(12 cm×10 cm)中，每盆0.2 g。

試驗共設(shè)置4個激素組合，即EBR+SA、ET+SA、ET+EBR、ET+EBR+SA(EBR 0.03 mg·L-1, SA 1 mmol·L-1, ET 0.03 μg·mL-1，1∶1組合)以及清水對照(CK)處理和3個連續(xù)噴施誘導(dǎo)時間，即5、7、10 d，共15個處理，每個處理3次重復(fù)，每個重復(fù)5盆，待幼苗長出第3片真葉時，根據(jù)不同激素組合和連續(xù)噴施誘導(dǎo)時間處理匍匐翦股穎幼苗，每盆噴施15 mL外源復(fù)合激素。誘導(dǎo)處理后同時接種病原菌，立枯絲核菌于PDB液體培養(yǎng)基(馬鈴薯塊200 g·L-1, 葡萄糖20 g·L-1，自然pH)中震蕩(25 ℃，120 r·min-1)培養(yǎng)2～3 d，培養(yǎng)好的菌種配置成濃度為OD340=0.6～0.8的菌絲懸浮液，采用噴霧法接種，每盆20 mL。接種后第15天，取樣和測定分析。

1.3 測定指標(biāo)及方法

1.3.1病情指數(shù)及防治效果 接種后第15天，統(tǒng)計病葉率并計算病情指數(shù)，匍匐翦股穎褐斑病分級標(biāo)準(zhǔn)[15]為：0級：無癥狀；1級：病斑面積占全株葉片面積的10%以下；2級：病斑面積占全株葉片面積的10%～40%；3級：病斑面積占全株葉片面積的40%～60%；4級：病斑面積占全株葉片面積的60%～80%；5級：病斑面積占全株葉片面積的90%以上。

病情指數(shù)=∑(病級株數(shù)×癥狀等級)/(株數(shù)總和×最高癥狀等級)×100
防治效果=(對照發(fā)病率-處理發(fā)病率)/對照發(fā)病率×100%

1.3.2抗氧化酶活性測定 粗酶液的提取，稱取匍匐翦股穎葉片0.5 g放入研缽中，加入液氮研磨組織破碎后加入2 mL預(yù)冷的磷酸緩沖液和2%聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone，PVP)充分研磨，然后轉(zhuǎn)入離心管中，用2 mL緩沖液充分清洗研缽，轉(zhuǎn)入離心管中，4 ℃下15000 r·min-1離心20 min，所得上清液即為粗酶提取液。將粗酶液分裝入各管中進行抗氧化酶的活性和抗氧化物質(zhì)含量測定。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)采用氮藍四唑顯色法(nitro blue tetrazolium chloride mono-hydrate, NBT)測定[16]；過氧化氫酶(catalase, CAT)活性采用紫外比色法測定[16]；過氧化物酶(peroxidase, POD)活性采用愈創(chuàng)木酚法測定[16]；抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase, APX)活性的測定參照Nakano等[17]的方法；脫氫抗壞血酸還原酶(dehydroascorbate reductase, DHAR)活性的測定參照Krivosheeva等[18]的方法；谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase, GR)活性測定參照 Foyer等[19]的方法。

1.3.3非酶抗氧化物質(zhì)含量測定 粗酶液提取同1.3.2。脫氧抗壞血酸(reduced ascorbic acid, AsA)和氧化型抗壞血酸(dehydroascorbic acid, DHA)測定參照Jin等[20]的方法；氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione, GSH)和還原型谷胱甘肽(reduced glutathione, GSSG)參照Gossett等[21]的方法測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析，采用單因素ANOVA進行分析處理，Duncan’s新復(fù)極差法進行顯著性方差分析；采用Excel 2003進行繪圖與數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源復(fù)合激素對匍匐翦股穎抗褐斑病的作用

與對照(CK)相比，不同激素組合和連續(xù)誘導(dǎo)時間處理的匍匐翦股穎幼苗抗病性明顯增強(表1)。對照(CK)的病情指數(shù)隨連續(xù)誘導(dǎo)時間的增加呈上升趨勢；EBR+SA處理的病情指數(shù)隨連續(xù)誘導(dǎo)時間的增加表現(xiàn)為先降后升，而防治效果表現(xiàn)為先升后降，當(dāng)連續(xù)誘導(dǎo)時間為7 d時，病情指數(shù)最低，為14.93，防治效果達33.53%，但與連續(xù)誘導(dǎo)時間為10 d的防治效果無顯著差異(P>0.05)；ET+SA處理的病情指數(shù)隨連續(xù)誘導(dǎo)時間的增加呈上升趨勢，而防治效果表現(xiàn)為先升后降，當(dāng)連續(xù)誘導(dǎo)時間為5 d時，病情指數(shù)最低，為15.93，但與連續(xù)誘導(dǎo)時間為7 d的病情指數(shù)無顯著差異(P>0.05)，連續(xù)誘導(dǎo)時間為7 d的防治效果最高，為28.70%，但與連續(xù)誘導(dǎo)時間為10 d的防治效果無顯著差異(P>0.05)； ET+EBR處理的病情指數(shù)隨連續(xù)誘導(dǎo)時間的增加呈先降后升趨勢，而防治效果表現(xiàn)為先升后降，當(dāng)連續(xù)誘導(dǎo)時間為7 d時，病情指數(shù)最低為13.36，防治效果為所有處理中最佳，達40.51%；ET+EBR+SA處理的病情指數(shù)隨連續(xù)誘導(dǎo)時間的增加呈上升趨勢，最低防治效果處理為連續(xù)誘導(dǎo)7 d，但3種連續(xù)誘導(dǎo)時間處理的防治效果無顯著差異(P>0.05)。

2.2 外源復(fù)合激素對匍匐翦股穎抗氧化系統(tǒng)的影響

2.2.1對SOD活性的影響 隨著連續(xù)誘導(dǎo)時間的增加，對照(CK)處理的幼苗葉片SOD活性略有下降(圖1)，但無顯著差異(P>0.05)；EBR+SA處理的幼苗葉片SOD活性隨著連續(xù)誘導(dǎo)時間的增加呈先上升后下降趨勢，當(dāng)連續(xù)誘導(dǎo)時間為7 d時，葉片SOD活性最大，為124.78 U·g-1FW，較CK提高了70.58%；ET+SA處理時當(dāng)連續(xù)誘導(dǎo)時間為5 d時，葉片SOD活性達109.49 U·g-1FW，較CK提高了49.70%，之后隨連續(xù)誘導(dǎo)時間的增加呈下降趨勢；ET+EBR處理的SOD活性隨著連續(xù)誘導(dǎo)時間的增加表現(xiàn)為先升后降，當(dāng)連續(xù)誘導(dǎo)時間為7 d時，葉片SOD活性最大，為168.63 U·g-1FW，較CK提高了130.53%，當(dāng)誘導(dǎo)時間為10 d時，SOD活性顯著下降，較7 d處理下降了45.18%；ET+EBR+SA處理的SOD活性變化與ET+SA處理相同，隨連續(xù)誘導(dǎo)時間的增加呈下降趨勢，當(dāng)連續(xù)誘導(dǎo)時間為5 d時，SOD活性最大，為112.39 U·g-1FW，較CK提高了53.66%。

2.2.2對CAT活性的影響 與對照(CK)處理相比，不同激素組合和連續(xù)誘導(dǎo)時間處理的匍匐翦股穎幼苗葉片CAT活性均不同程度上升(圖2)；對照(CK)處理的幼苗葉片CAT活性隨連續(xù)誘導(dǎo)時間的增加而顯著下降，連續(xù)誘導(dǎo)10 d時的CAT活性較5 d處理的下降了67.69%；EBR+SA處理的CAT活性呈先升后降趨勢，當(dāng)連續(xù)誘導(dǎo)時間為7 d時，CAT活性最大，較CK提高了166.82%；ET+SA處理CAT活性隨連續(xù)誘導(dǎo)時間的增加呈逐漸下降趨勢，連續(xù)誘導(dǎo)5 d時CAT活性最大，達13.45 U·g-1·min-1FW; ET+EBR處理的CAT活性隨連續(xù)誘導(dǎo)時間的增加表現(xiàn)為先升后降，連續(xù)誘導(dǎo)7 d時CAT活性最大，達19.45 U·g-1·min-1FW，較CK提高了197.40%；ET+EBR+SA處理的CAT活性變化呈下降趨勢，連續(xù)誘導(dǎo)5 d時CAT活性最大，為18.68 U·g-1·min-1FW，7 d處理和10 d處理的CAT活性差異不顯著(P>0.05)。

表1 外源復(fù)合激素對匍匐翦股穎抗褐斑病的誘導(dǎo)效應(yīng)Table 1 Effect of composite exogenous hormone on creeping bentgrass against R. solani

注：同一處理不同時間下小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

Note: Different lowercase letters in same treatment and different time means significant differences atP<0.05. SA: Salicylic acid; EBR: Epibrassinolide; ET: Ethylene. The same below.

2.2.3對POD活性的影響 隨著連續(xù)誘導(dǎo)時間的增加，對照(CK)的POD活性呈下降趨勢(圖3)，連續(xù)誘導(dǎo)10 d時的POD活性較5 d處理的下降了30.90%；EBR+SA處理的POD活性變化趨勢同SOD和CAT，呈現(xiàn)上升后下降趨勢，連續(xù)誘導(dǎo)7 d時POD活性最大，較CK提高了56.23%；ET+SA處理的POD活性隨連續(xù)誘導(dǎo)時間的增加呈逐漸下降趨勢，連續(xù)誘導(dǎo)5 d時POD活性最大，為5.01 U·g-1·min-1FW，但與連續(xù)誘導(dǎo)7 d時的POD活性無顯著差異(P>0.05)；ET+EBR處理的POD活性隨著連續(xù)誘導(dǎo)時間的增加表現(xiàn)為先升后降，當(dāng)連續(xù)誘導(dǎo)時間為7 d時，葉片POD活性最大，為7.28 U·g-1·min-1FW，較CK提高了101.66%；ET+EBR+SA處理的POD活性變化呈下降趨勢，連續(xù)誘導(dǎo)5 d時POD活性最大，為5.68 U·g-1·min-1FW。

2.3 外源復(fù)合激素對匍匐翦股穎AsA-GSH系統(tǒng)的影響

2.3.1對APX活性的影響 與對照(CK)相比，噴施激素處理的幼苗葉片APX活性均顯著升高，并隨連續(xù)誘導(dǎo)時間的增加，不同激素組合的幼苗葉片的APX活性變化趨勢各不相同(圖4)。對照(CK)處理中，連續(xù)誘導(dǎo)時間為5和7 d時APX活性無顯著差異(P>0.05)，但連續(xù)誘導(dǎo)10 d時的APX活性顯著下降(P<0.05)；EBR+SA處理的APX活性呈先升后降趨勢，連續(xù)誘導(dǎo)時間為7 d時APX活性最大，與CK相比提高了276.42%；ET+SA處理在連續(xù)誘導(dǎo)5和7 d時的APX活性差異不顯著(P>0.05)，分別較CK提高了119.33%和115.45%，當(dāng)在連續(xù)誘導(dǎo)10 d處理時，APX活性顯著下降；ET+EBR處理在連續(xù)誘導(dǎo)7 d時APX活性提高幅度最大，較CK提高了316.26%；ET+EBR+SA處理的APX活性變化呈下降趨勢，連續(xù)誘導(dǎo)5 d時APX活性最大，達0.351 U·g-1，與CK相比提高了194.96%。

圖1 不同誘導(dǎo)處理對匍匐翦股穎幼苗SOD活性的影響Fig.1 Effect of different inducement treatments on SOD enzyme activity in creeping bentgrass

圖2 不同誘導(dǎo)處理對匍匐翦股穎幼苗CAT活性的影響Fig.2 Effect of different inducement treatments on CAT enzyme activity in creeping bentgrass

同一處理不同時間下小寫字母表示在0.05水平上差異顯著。下同。Different lowercase letters in same treatment and different time indicate significant difference at 0.05 level. The same below.

圖3 不同誘導(dǎo)處理對匍匐翦股穎幼苗POD活性的影響Fig.3 Effect of different inducement treatments on POD enzyme activity in creeping bentgrass

圖4 不同誘導(dǎo)處理對匍匐翦股穎幼苗APX活性的影響Fig.4 Effect of different inducement treatments on APX enzyme activity in creeping bentgrass

2.3.2對DHAR活性的影響 由圖5可知，對照(CK)的幼苗葉片DHAR活性在連續(xù)誘導(dǎo)5和7 d處理時差異不顯(P>0.05)，當(dāng)連續(xù)誘導(dǎo)10 d時，DHAR活性呈下降趨勢；EBR+SA處理的DHAR活性呈上升趨勢，連續(xù)誘導(dǎo)7 d時DHAR活性達最大，但與10 d處理時無顯著差異(P>0.05)；ET+SA處理的DHAR活性隨連續(xù)誘導(dǎo)時間的增加呈下降趨勢，且連續(xù)誘導(dǎo)7和10 d處理時差異不顯著(P>0.05)，各誘導(dǎo)時間處理較CK相比提高程度不明顯；ET+EBR處理的DHAR活性同APX活性的變化，呈先升后降趨勢，在連續(xù)誘導(dǎo)7 d時達最大，較CK提高了41.95%；ET+EBR+SA處理的DHAR活性變化隨連續(xù)誘導(dǎo)時間的增加呈下降趨勢，連續(xù)誘導(dǎo)5 d時DHAR活性最大，達5.789 U·g-1，與CK相比提高了14.67%。

2.3.3對GR活性的影響 隨連續(xù)誘導(dǎo)時間的增加，對照(CK)的GR活性呈先升后降趨勢，在連續(xù)誘導(dǎo)7 d時GR活性最大，為0.356 U·g-1(圖6)；EBR+SA處理的GR活性由連續(xù)誘導(dǎo)5 d增加到7 d時略有上升，但差異不顯著(P>0.05)，連續(xù)誘導(dǎo)10 d時GR活性顯著下降；ET+SA處理的GR活性在誘導(dǎo)5 d時最大，達0.489 U·g-1，但與7 d處理的差異不顯著，10 d處理時顯著下降；ET+EBR處理的GR活性隨連續(xù)誘導(dǎo)時間的增加呈先升后降趨勢，在7 d處理時達最大，較CK提高了80.34%，提升幅度為各處理最大；ET+EBR+SA處理的GR活性隨連續(xù)誘導(dǎo)時間的增加呈下降趨勢，但連續(xù)誘導(dǎo)5和7 d處理的差異不顯著(P>0.05)，當(dāng)連續(xù)誘導(dǎo)10 d時其活性顯著下降。

圖6 不同誘導(dǎo)處理對匍匐翦股穎幼苗GR活性的影響Fig.6 Effect of different inducement treatments on GR enzyme activity in creeping bentgrass

2.3.4對AsA和DHA含量及AsA/DHA的影響 與對照(CK)相比，噴施激素處理的幼苗葉片AsA含量均顯著升高，但各處理隨連續(xù)誘導(dǎo)時間的不同而變化趨勢各不相同(表2)。對照(CK)處理的AsA含量隨誘導(dǎo)時間的增加呈先升后降趨勢，在連續(xù)誘導(dǎo)7 d處理時AsA含量達最大，為336.39 μg·g-1；EBR+SA處理的AsA含量隨誘導(dǎo)時間的增加呈先升后降趨勢，在連續(xù)誘導(dǎo)7 d處理時AsA含量達最大，較CK提高了56.97%；ET+SA處理的AsA含量隨誘導(dǎo)時間的增加呈下降趨勢，在連續(xù)誘導(dǎo)5 d處理時AsA含量達最大，為499.65 μg·g-1，較CK提高了57.12%；ET+EBR處理的AsA含量在連續(xù)誘導(dǎo)7 d時較各處理達最大，為654.74 μg·g-1，較CK提高了94.64%；ET+EBR+SA處理的ASA含量隨誘導(dǎo)時間的增加呈下降趨勢，在連續(xù)誘導(dǎo)5 d處理時AsA含量達最大，為536.41 μg·g-1，較CK提高了68.68%。

對照(CK)處理的DHA含量隨誘導(dǎo)時間的增加呈先降后升趨勢，在連續(xù)誘導(dǎo)7 d處理時DHA含量積累最少，為1031.44 μg·g-1；EBR+SA處理的DHA含量呈上升趨勢，在連續(xù)誘導(dǎo)5 d處理時DHA含量積累最小，但與連續(xù)誘導(dǎo)7 d處理時差異不顯著；ET+SA處理的DHA含量呈先升后降趨勢，在連續(xù)誘導(dǎo)5 d處理時積累量最小，為1014.42 μg·g-1；ET+EBR處理的DHA隨連續(xù)誘導(dǎo)時間的增加DHA含量積累變化較小，各連續(xù)誘導(dǎo)時間處理均無顯著差異，在連續(xù)誘導(dǎo)7 d處理時DHA積累量最少，為1062.88 μg·g-1；ET+EBR+SA處理的DHA含量呈逐漸上升趨勢，在連續(xù)誘導(dǎo)5 d處理時DHA含量積累最小，為1076.88 μg·g-1。

對照(CK)處理的AsA/DHA隨連續(xù)誘導(dǎo)時間的增加呈先升后降趨勢，連續(xù)誘導(dǎo)7 d處理時比值最大，為0.33；EBR+SA處理的AsA/DHA在連續(xù)誘導(dǎo)7 d處理時最大，為0.53，較CK提高了60.61%，連續(xù)誘導(dǎo)5和10 d處理的AsA/DHA無顯著差異；ET+SA處理的AsA/DHA隨連續(xù)誘導(dǎo)時間的增加而顯著下降，在連續(xù)誘導(dǎo)5 d處理時最大，為0.49；ET+EBR處理的AsA/DHA在連續(xù)處理7 d時為各處理中最大值，達0.62，較CK提高了87.88%，隨后呈下降趨勢；ET+EBR+SA處理在連續(xù)誘導(dǎo)5 d時AsA/DHA最大，為0.50，較CK提高了66.67%，當(dāng)連續(xù)誘導(dǎo)時間增加時呈下降趨勢。

2.3.5對GSH和GSSG含量及GSH/GSSG的影響 各激素處理較對照(CK)相比GSH含量均有所增加(表3)。對照(CK)的GSH含量在連續(xù)誘導(dǎo)7 d時達最大，為9.66 μg·g-1，但與連續(xù)誘導(dǎo)5 d時的GSH含量差異不顯著(P>0.05)，連續(xù)誘導(dǎo)10 d時開始呈下降趨勢；EBR+SA處理的GSH含量隨連續(xù)誘導(dǎo)時間的變化呈先升后降趨勢，7 d處理時達最大，為12.58 μg·g-1，較CK提高30.23%；ET+SA處理隨連續(xù)誘導(dǎo)時間的增加，GSH含量呈下降趨勢，其在5 d處理時含量最高，為12.07 μg·g-1，較CK提高了28.95%；ET+EBR處理在連續(xù)誘導(dǎo)7 d時GSH含量達各處理的最大值，為13.67 μg·g-1，較CK提高41.51%，隨后呈下降趨勢；ET+EBR+SA處理的GSH含量同AsA含量變化趨勢相同，隨連續(xù)誘導(dǎo)時間的增加而逐漸下降，在5 d處理時GSH含量最高，為13.00 μg·g-1，較CK提高了38.89%。

表2 不同誘導(dǎo)處理對匍匐翦股穎幼苗AsA、DHA含量及AsA/DHA的影響Table 2 Effect of different inducement treatments on contents of AsA, DHA and AsA/DHA in creeping bentgrass

對照(CK)處理的GSSG含量在連續(xù)誘導(dǎo)7 d時積累量最少，為1.30 μg·g-1，5和10 d處理時的GSSG含量積累均高于7 d處理；EBR+SA處理的GSSG積累量隨連續(xù)誘導(dǎo)時間的增加而不斷增加，5 d處理時積累量最小，為1.28 μg·g-1；ET+SA處理的GSSG積累量在5 d處理時積累量最小，為1.29 μg·g-1，但與7 d處理的無顯著差異，10 d處理時GSSG積累量顯著增加；ET+EBR處理在連續(xù)誘導(dǎo)時間為5 d時，GSSG積累量最小，隨連續(xù)誘導(dǎo)時間的增加GSSG含量呈增加趨勢，7和10 d處理的GSSG含量差異不顯著(P>0.05)；ET+EBR+SA處理的GSSG含量隨連續(xù)誘導(dǎo)時間的增加而呈上升趨勢，5和7 d處理差異不顯著(P>0.05)，10 d處理時GSSG積累量顯著增加。

對照(CK)處理的GSH/GSSG隨連續(xù)誘導(dǎo)時間的增加呈先升后降趨勢，連續(xù)誘導(dǎo)7 d處理時比值最大，為7.43；EBR+SA處理的GSH/GSSG在連續(xù)誘導(dǎo)7 d處理時最大，為9.09，較CK提高了22.34%，但與連續(xù)誘導(dǎo)5 d時的GSH/GSSG差異不顯著；ET+SA處理的GSH/GSSG隨連續(xù)誘導(dǎo)時間的增加而顯著下降，在連續(xù)誘導(dǎo)5 d處理時最大，為9.36，較CK提高了37.04%；ET+EBR處理的GSH/GSSG在連續(xù)處理7 d時為各處理中最大值，達9.88，較CK提高了32.97%；ET+EBR+SA處理的GSH/GSSG隨連續(xù)誘導(dǎo)時間的增加而逐漸降低，在5 d處理時GSH/GSSG最大，為9.56。

3 討論

3.1 外源復(fù)合激素誘導(dǎo)匍匐翦股穎抗褐斑病的效應(yīng)

植物誘導(dǎo)抗性是利用物理、化學(xué)及生物的方式使植物受誘導(dǎo)因子刺激后自身所產(chǎn)生的抗性，從而達到防治植物病害的作用，然而不同的誘導(dǎo)劑對同一植物的防治效果存在差異，這主要與誘抗劑的誘導(dǎo)抗病機理及植物自身的代謝途徑等有關(guān)，對于某一固定植物，存在著適合該植物的一種或幾種有效誘抗劑[22]。Lee等[23]使用苯并噻二唑(benzothiadiazole, BTH)誘導(dǎo)匍匐翦股穎品種“Crenshaw”、“Penncross”和“Providence”抗幣斑病，但對“L-93”是沒有效果的。房媛媛等[24]研究發(fā)現(xiàn)以不同濃度的2,3-丁二醇(2,3-butanediol, 2,3-BD)和水楊酸處理匍匐翦股穎后接種尖孢鐮刀菌，水楊酸各處理中防治效果最高為11.25%，而250 μmol·L-1的2,3-丁二醇的防治效果可高達78.26%。誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性，均需要一定時間激發(fā)寄主植物體內(nèi)產(chǎn)生系列生理反應(yīng)，不同誘導(dǎo)物或同一誘導(dǎo)物對不同寄主和病害的誘導(dǎo)抗病時間持續(xù)性可能有所不同[25]。向妙蓮等[25]研究表明，采用0.1 mmol·L-1的茉莉酸甲酯(methyl jasmonate, MeJA)于接種青枯病前0～96 h噴霧處理辣椒幼苗均具有一定的防治效果，但以接種前48 h時處理的防治效果最好。劉興菊等[26]研究發(fā)現(xiàn)，利用2,3-丁二醇對匍匐翦股穎多次誘導(dǎo)后接種立枯絲核菌，其中2次誘導(dǎo)處理下效果最好，病情指數(shù)最低。本研究結(jié)果表明，不同的復(fù)合激素及連續(xù)誘導(dǎo)時間對匍匐翦股穎抗褐斑病的效果不同，其中ET+EBR連續(xù)誘導(dǎo)處理7 d的病情指數(shù)最低，為13.36，防治效果最佳，為40.51%。分析現(xiàn)有研究誘導(dǎo)匍匐翦股穎抗性的試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4種外源激素組合對匍匐翦股穎褐斑病均有一定的誘導(dǎo)防治效果，但誘導(dǎo)機制可能存在差異，導(dǎo)致抗性差別顯著；另外，植株抗病性的激發(fā)是一個相對緩慢的過程，短時間內(nèi)或較少次數(shù)的誘導(dǎo)對植株抗病能力而言沒有明顯提高，但不同誘導(dǎo)物或同一誘導(dǎo)物對不同寄主和病害的誘導(dǎo)抗病時間和誘導(dǎo)次數(shù)也可能有所不同。

3.2 外源復(fù)合激素誘導(dǎo)匍匐翦股穎抗褐斑病與活性氧代謝的關(guān)系

在植物的誘導(dǎo)抗病過程中伴隨著多種物質(zhì)的代謝，而這些過程中關(guān)鍵因子是催化代謝反應(yīng)的酶，其中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)是與植物抗病相關(guān)的抗氧化關(guān)鍵酶，植物通過調(diào)節(jié)這些抗氧化關(guān)鍵酶活性，保持活性氧代謝平衡，以減緩細胞內(nèi)活性氧自由基積累和膜脂過氧化傷害[27]。SOD作為植物細胞防御酶系統(tǒng)中的重要成分之一，主要的功能便是歧化負氧離子，產(chǎn)生H2O2和O2，減少活性氧對植物體細胞的傷害；CAT和POD是植物體內(nèi)常見的氧化還原酶，是細胞內(nèi)重要的內(nèi)源活性氧清除劑[28]，從而使植物細胞能夠緩解一定程度上的氧化損傷。許多研究表明，植物經(jīng)誘導(dǎo)劑處理后SOD、CAT、POD等的活性都顯著增加[29-30]，并且這些酶活性的升高常被用來作為植物抗病性的重要指標(biāo)[31]。而關(guān)于SOD、POD、CAT等酶活性與植物抗病性的關(guān)系也存在較多爭議[32]。本研究分析比較匍匐翦股穎幼苗經(jīng)不同復(fù)合激素處理后接種立枯絲核菌，其葉片關(guān)鍵抗氧化酶活性的變化，發(fā)現(xiàn)各復(fù)合激素可顯著提高SOD、CAT、POD等酶活性，且于最佳連續(xù)誘導(dǎo)時間處理下酶活性最強，證實了SOD、POD、CAT的活性增強有助提高植株的抗病性，說明復(fù)合激素誘導(dǎo)匍匐翦股穎抗褐斑病，可能與其激發(fā)植株體內(nèi)抗氧化酶活性并調(diào)控活性氧代謝平衡有關(guān)。

3.3 外源復(fù)合激素誘導(dǎo)匍匐翦股穎抗褐斑病與AsA-GSH循環(huán)的關(guān)系

植物在減緩或抵御細胞傷害時常調(diào)運酶促和非酶促兩類系統(tǒng)來清除活性氧，其中抗壞血酸過氧化物酶(APX)、脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)和谷胱甘肽還原酶(GR)是抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)(AsA-GSH)活性氧清除系統(tǒng)的重要酶組成，AsA和GSH是重要的非酶抗氧化物質(zhì)[33-35]。APX在AsA-GSH循環(huán)中通過AsA來清除H2O2，在H2O2清除過程中起主要作用，AsA被氧化形成單脫氫抗壞血酸(monodehydroascorbate，MDHA)，MDHA或在單脫氫抗壞血酸還原酶(monodehydroascorbate reductase，MDAR)作用下再生形成AsA，或通過非酶促歧化形成氧化型抗壞血酸(DHA)，DHA在DHAR作用下再生形成AsA，GR通過催化GSSG生成還原態(tài)的GSH。AsA是植物體常見的一種非酶促抗氧化劑，在AsA-GSH循環(huán)中能夠有效清除H2O2，同時還可直接清除O2·-，而GSH作為植物體內(nèi)重要的還原物質(zhì)，能夠有效防止膜脂過氧化程度，并且促進AsA再生[36]。朱紅芳等[37]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)外源水楊酸(SA)誘導(dǎo)后，不結(jié)球白菜葉片和根系中APX和GR活性與對照相比均有顯著提高，促進不結(jié)球白菜AsA-GSH循環(huán)的快速進行，加快植物體活性氧的清除速度，提高對根腫病的抗性。房媛媛等[38]研究表明，在2,3-丁二醇誘導(dǎo)匍匐翦股穎抗褐斑病的過程中，AsA-GSH循環(huán)參與抗病反應(yīng)，AsA含量和GSH含量明顯上升，AsA/DHA及GSH/GSSG均不同程度提高，說明AsA與GSH作為活性氧清除劑參與匍匐翦股穎的抗病反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，匍匐翦股穎幼苗經(jīng)不同復(fù)合激素在最佳連續(xù)誘導(dǎo)時間處理后接種立枯絲核菌，幼苗仍保持較高的APX、DHAR及GR活性，而且AsA、GSH含量及AsA/DHA和GSH/GSSG均不同程度提高，表明幼苗在接種后清除過量活性氧的同時能較好地維持AsA-GSH循環(huán)的完整性，從而表現(xiàn)出對褐斑病的抗性。

4 結(jié)論

以EBR、SA和ET相互組合為外源復(fù)合激素，在不同連續(xù)誘導(dǎo)時間下處理匍匐翦股穎幼苗，可以降低匍匐翦股穎褐斑病的病情指數(shù)，提高匍匐翦股穎對褐斑病的抗性，并增強SOD、CAT、POD和AsA-GSH循環(huán)中抗氧化酶活性及AsA和GSH的再生能力，使活性氧的清除能力增強，降低膜脂過氧化程度，從而維持細胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，提高匍匐翦股穎的抗病性。綜合不同外源復(fù)合激素和連續(xù)誘導(dǎo)時間對匍匐翦股穎抗褐斑病各指標(biāo)的分析，本試驗認為，外源復(fù)合激素ET+EBR連續(xù)誘導(dǎo)處理7 d時對匍匐翦股穎抗褐斑病的誘導(dǎo)效果最好。但是，外源復(fù)合激素誘導(dǎo)植物抗病的響應(yīng)機制及其信號途徑還較為復(fù)雜，還需進一步深入研究。