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    桑枝基質(zhì)的靈芝優(yōu)質(zhì)高效栽培配方研究

    2018-11-19 09:12:00肖建中鄒湘月顏新培邵元元葉添梅李霞
    四川蠶業(yè) 2018年3期
    關(guān)鍵詞:桑枝木屑靈芝

    肖建中 鄒湘月 顏新培 邵元元 葉添梅 李霞

    (湖南省蠶??茖W研究所,湖南 長沙 410127)

    靈芝(Ganodermalucidum),屬擔子菌綱多孔菌科靈芝屬真菌[1],又稱“仙草”、“瑞草”,自古以來就是我國的一味傳統(tǒng)名貴藥材?,F(xiàn)代醫(yī)學和臨床研究結(jié)果表明,靈芝具有保肝護肝、免疫調(diào)節(jié)和抑制腫瘤的藥理作用[2-3],有關(guān)靈芝的開發(fā)利用備受關(guān)注。目前,人工代料栽培靈芝的培養(yǎng)基質(zhì)以木屑、棉籽殼為主,隨著食用菌產(chǎn)業(yè)規(guī)模的不斷擴大,原材料成本一路攀升,尋求一種新的優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)原料成為靈芝代料產(chǎn)業(yè)亟待解決的難題之一[4-5]。桑枝作為蠶桑產(chǎn)業(yè)中生物量最多的副產(chǎn)物,富含纖維素、粗蛋白、桑黃酮、生物堿等多種營養(yǎng)物質(zhì)和功能成分[6],理論上可作為靈芝代料栽培的上等培養(yǎng)原料,也可使廢棄桑枝得到合理有效的利用。本試驗以桑枝和棉籽殼為主要培養(yǎng)基,通過不同的配比栽培靈芝主栽菌株G1,并對其菌絲生長特性、農(nóng)藝性狀及子實體功能成分含量(包括靈芝多糖、黃酮及三萜類物質(zhì))進行差異分析,以期獲得以桑枝為主要基質(zhì)高效栽培靈芝的最優(yōu)配方,為桑枝靈芝的進一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    1.1.1 供試菌株。G1為赤芝(Ganoderma lucidum),由湖南省蠶??茖W研究所保藏。

    1.1.2 培養(yǎng)基。母種培養(yǎng)基(PDA加富培養(yǎng)基:馬鈴薯200g,葡萄糖20g,瓊脂15g,KH2-PO43g,MgSO41.5g,酵母膏2g,蛋白胨2g,水1000ml,pH自然),121℃、0.1MPa高壓蒸汽下滅菌后備用。

    原種培養(yǎng)基(玉米粒74%,小米25%,石膏1%,pH自然),121℃、0.1MPa高壓蒸汽下滅菌后備用。

    1.1.3 主要試劑與儀器。馬鈴薯、玉米粒、棉籽殼、麥麩等購自本地農(nóng)貿(mào)市場,桑枝來源于湖南省蠶??茖W研究所桑樹資源圃,葡萄糖、酵母膏、瓊脂、KH2PO4、MgSO4、蒽酮、硫酸、熊果酸、香蘭素、冰醋酸、高氯酸、蘆丁、甲醇、乙醇、氫氧化鈉、硝酸鋁等,試劑均為分析純。

    YXQ-LS-50SII型立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠),PL203電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司),DH G-9140恒溫干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司),SW-CJ-2FO凈化工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司),LRH-150生化培養(yǎng)箱(上海一恒科學儀器有限公司),KA-1000型臺式離心機(日本日立公司),UV-1800型紫外可見分光光度儀(日本島津公司),其他為實驗室常規(guī)設(shè)備。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 母種活化與原種培養(yǎng)。按無菌化操作要求分別取黃豆粒大小G1靈芝母種的菌種,轉(zhuǎn)接于PDA母種培養(yǎng)基中央,28℃培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)6d,取生長邊緣的旺盛菌絲再接種于新培養(yǎng)基內(nèi),反復(fù)轉(zhuǎn)接至菌絲恢復(fù)生長活力,保存?zhèn)溆谩?/p>

    在滅菌后備用的玉米粒原種培養(yǎng)基中依次接種,做好標記,置25℃組培室中暗培養(yǎng)20 d左右,待菌絲長滿菌袋后保存在4℃冰箱備用。

    1.2.2 栽培種的制作。將桑枝粉碎加工成直徑小于5mm的木屑顆粒,按照各種配方要求(詳見表1)與棉籽殼、麥麩等混合裝在規(guī)格為17cm×33cm的聚丙烯袋中,每袋干料0.5Kg,每個配方30袋,共3次重復(fù),121℃、0.1MPa高壓蒸汽下滅菌2 h后備用。

    表1 桑枝靈芝栽培基質(zhì)配方

    1.2.3 發(fā)菌培養(yǎng)。把在無菌條件下接種的靈芝菌袋放置在25℃、相對濕度為60%~70%且通風良好的組培室中進行避光發(fā)菌,每天觀察菌絲的生長及污染情況,發(fā)現(xiàn)雜菌污染的菌包及時剔除,定期記錄靈芝菌絲生長速度、菌絲外觀、長勢及發(fā)菌時間等生長特性。

    1.2.4 出芝管理。待菌絲長滿菌袋后,表面菌絲由白色逐漸轉(zhuǎn)為乳白或淺黃色,便開始揭蓋進行出芝管理。培養(yǎng)溫度嚴格控制在25℃~30℃,定時通風,現(xiàn)蕾期的空氣濕度為80%~90%,在菌蓋分化期啟用加濕器保持恒定空氣相對濕度85%~90%。當菌蓋邊緣白色生長線消失、子實體長成,開始及時采收。出芝期間觀察并記錄各配方各重復(fù)子實體的農(nóng)藝性狀,包括現(xiàn)蕾時間、菌蓋直徑厚度、菌柄長度、孢子彈射量,并計算單袋平均產(chǎn)量及生物學轉(zhuǎn)化率。

    1.2.5 靈芝子實體活性物質(zhì)含量的測定。子實體中靈芝多糖的提取與檢測,以葡萄糖為標準品,繪制標準曲線回歸方程y=0.579x+0.077測定多糖含量[7];靈芝三萜的提取與檢測,以熊果酸為標準品,繪制標準曲線回歸方程y=0.510x-0.005測定總?cè)坪縖8];子實體中黃酮的提取與檢測,以蘆丁為標準品,繪制標準曲線回歸方程y=0.319x+0.047測定總黃酮的含量[9]。

    1.2.6 數(shù)據(jù)處理。試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2003進行初步統(tǒng)計,用SPASS 18.0統(tǒng)計處理軟件進行方差分析及顯著性檢驗。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 不同配方對靈芝菌絲生長特性的影響

    在培養(yǎng)條件一致的情況下,不同的配方對靈芝菌株G1的菌絲生長情況影響較大(見表2)。在配方4中(CK)的純棉籽殼培養(yǎng)基中,靈芝菌絲的生長速度最快,為4.17±0.29 mm/d,且長勢良好,表明棉籽殼的營養(yǎng)結(jié)構(gòu)及C/N比較適合靈芝菌絲的生長發(fā)育;而在添加了50%桑枝木屑的配方2中,菌絲生長速度也高達4.02±0.34 mm/d,僅次于對照組,無顯著差異,且菌絲外觀濃密、潔白、長勢旺盛,從菌絲表現(xiàn)來看也可以作為菌株G1的最優(yōu)配方。菌絲生長速度較慢的是配方1和配方3,平均生長速度都在4.0 mm/d以下,與對照組差異顯著,且菌絲長勢一般。從表2可知,菌絲生長情況并沒有隨著桑枝木屑添加量的增加而逐漸減弱,反而在配方2中達到最優(yōu),分析其中的原因可能是雖然桑枝沒有棉籽殼內(nèi)的營養(yǎng)成分和C/N比合適,但靈芝為好氣性真菌,一定量的桑枝木屑可以增加袋內(nèi)的空氣流動,促進了菌絲生長,而當桑枝木屑添加過多(配方1)難以給靈芝菌絲提供充足的養(yǎng)分,導(dǎo)致其生長緩慢、菌絲稀疏、不整齊等外觀表現(xiàn)。

    表2 不同配方靈芝菌絲生長情況

    注:同列數(shù)據(jù)后小寫字母不同者表示P<0.05水平的差異顯著性,下同。表中“++”表示長勢較弱,“+++”表示長勢中等,“++++”表示長勢旺盛。

    2.2 不同配方對靈芝子實體農(nóng)藝性狀及產(chǎn)量的影響

    在不同比例桑枝添加量的培養(yǎng)基質(zhì)中,靈芝子實體的農(nóng)藝性狀及產(chǎn)量等各項生長指標存在一定差異(見表3)。在菌絲長滿并開口后,配方2培養(yǎng)基中的靈芝現(xiàn)蕾最早,平均6d可完成現(xiàn)蕾,比對照組早1d;在配方1、配方2、配方3之間,在菌蓋直徑、菌蓋厚度和孢子粉彈射量的指標上存在顯著差異(P<0.05),其中,配方2的這3項性狀指標(菌蓋直徑11.58±0.65cm,厚度1.63±0.15mm,彈孢量4.28±0.36g)優(yōu)于其它配方,僅次于對照組,表現(xiàn)突出,理論上靈芝孢子粉的彈射量隨著菌蓋直徑及厚度的增大而增加,從表中數(shù)據(jù)可以看出,該試驗結(jié)果符合一般規(guī)律;但在短柄靈芝品種G1的菌柄長度上,配方1和配方2的表現(xiàn)優(yōu)于配方3和對照,其中各項生長指標均較弱的配方1培養(yǎng)的靈芝子實體菌柄最長,為3.56±0.24cm;以配方2培養(yǎng)基培養(yǎng)的靈芝子實體鮮重為123.95±5.58g,與對照配方靈芝無顯著差異,在配方1培養(yǎng)基中生長的靈芝子實體鮮重最低,只有85.66±5.36g;生物轉(zhuǎn)化率與子實體鮮重產(chǎn)量是呈正相關(guān)的,其順序依次為:配方1<配方3<配方2

    2.3 不同配方對子實體活性成分的影響

    多糖、三萜和黃酮作為靈芝的主要活性物質(zhì),其含量是衡量靈芝品質(zhì)好壞的重要指標,同一個菌株的活性成分含量由于基質(zhì)配方、培養(yǎng)條件、環(huán)境或培管方法不同而存在差異。分別對上述4種不同配方的靈芝子實體進行活性成分的檢測(見表4)可知,添加桑枝木屑的配方靈芝比CK組靈芝的所測活性成分含量明顯提高,除了靈芝三萜外,多糖和黃酮含量隨著桑枝木屑的比例增加呈現(xiàn)一定的上升趨勢,表明桑枝作為一種培養(yǎng)基質(zhì)有利于靈芝子實體的次生代謝產(chǎn)物的分泌合成,起到一定的誘導(dǎo)作用,其中,配方2中的靈芝三萜及黃酮含量達到最高,分別為4.71±0.42 mg/g和0.43±0.09 mg/g,與其他配方存在顯著差異,而在靈芝多糖的含量上,配方1的多糖含量最高,為0.63±0.04 mg/g,配方2中靈芝多糖僅次于配方1,無顯著差異。因此在活性成分的比較上,可選擇配方2為靈芝菌株G1的最佳配方。此外從表4可知,該菌株的三萜含量明顯高于多糖和黃酮類物質(zhì),CK組的靈芝三萜也高達2.44±0.87 mg/g,出現(xiàn)這一結(jié)果應(yīng)該與品種特性有關(guān),在應(yīng)用上可將菌株G1作為獲得高劑量靈芝三萜的加工專用型菌種。

    圖1 不同配方的靈芝活性成分含量

    3 小結(jié)與討論

    本試驗以桑枝和棉籽殼為主要培養(yǎng)基,通過不同的配比培育靈芝主栽菌株G1,對其菌絲生長特性、農(nóng)藝性狀、產(chǎn)量及子實體活性成分含量(包括靈芝多糖、黃酮及三萜類物質(zhì))等指標進行差異分析,結(jié)果表明添加50%桑枝木屑、30%棉籽売、15%麥麩的配方是適宜靈芝主栽菌株G1優(yōu)質(zhì)高效栽培的最優(yōu)配方。

    通過本試驗篩選了以桑枝木屑為主要基質(zhì)適宜靈芝主栽菌株G1栽培的最優(yōu)配方,以桑枝木屑為主要基質(zhì)培育其它靈芝主栽菌株的最優(yōu)配方需要在以后的試驗中進一步研究。

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