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    基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)葛根治療2型糖尿病的分子機(jī)制研究*

    2018-11-19 01:57:24李冰濤翟興英涂珺章輝王浩臣肖思雨徐國(guó)良嚴(yán)小軍邵峰朱衛(wèi)豐劉榮華江西中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)基礎(chǔ)理論分化發(fā)展研究中心南昌330004江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院南昌330004
    江西中醫(yī)藥 2018年11期
    關(guān)鍵詞:藥性葛根靶點(diǎn)

    ★ 李冰濤 翟興英 涂珺 章輝 王浩臣 肖思雨 徐國(guó)良 嚴(yán)小軍 邵峰 朱衛(wèi)豐 劉榮華***(.江西中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)基礎(chǔ)理論分化發(fā)展研究中心 南昌 330004; .江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 南昌 330004)

    由于飲食結(jié)構(gòu)的調(diào)整和生活方式轉(zhuǎn)變等因素的影響,糖尿病逐漸成為威脅人類(lèi)健康的重大慢性非傳染性疾病。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示2017年全球糖尿病患者達(dá)4億,中國(guó)糖尿病患者1.14億,發(fā)病率約為總?cè)丝诘?0.9%。2型糖尿病患者占糖尿病總?cè)丝诘?0%左右。胰島素抵抗和胰島β細(xì)胞損傷導(dǎo)致外周組織肝臟、脂肪和骨骼肌對(duì)胰島素的敏感性下降是2型糖尿病的基本病理[1-2]。持續(xù)的高血糖,引起組織器官的糖毒性,誘發(fā)糖尿病并發(fā)癥,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量及生命安全。

    葛根是為豆科植物野葛(Pueraria lobata(Willd.)Ohwi)的干燥根,具有退熱解肌、生津止渴等功效。其主要成分包括異黃酮類(lèi)、三萜類(lèi)等[3],具有抗炎、抗氧化、降血糖、降血脂、改善胰島素抵抗等藥理活性[4]。葛根主消渴,是2型糖尿病治療的常用中藥,其作用機(jī)制可能與胰島素信號(hào)通路相關(guān)[5-6]。

    本課題組認(rèn)為葛根改善胰島素抵抗、治療2型糖尿病可能是通過(guò)多靶點(diǎn)、多通路協(xié)同作用的結(jié)果。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是理解中藥方劑復(fù)雜化學(xué)體系與病證復(fù)雜生物系統(tǒng)的相互作用的科學(xué)方法[7]。本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究思路,檢索葛根的化學(xué)成分,結(jié)合類(lèi)藥性分析技術(shù)篩選葛根的有效成分,預(yù)測(cè)其治療靶點(diǎn),結(jié)合2型糖尿病的疾病網(wǎng)絡(luò),分析葛根治療2型糖尿病的靶點(diǎn),構(gòu)建葛根治療2型糖尿病的靶點(diǎn)交互作用網(wǎng)絡(luò),富集葛根治療2型糖尿病的代謝通路,闡述葛根治療2型糖尿病的作用機(jī)制,為葛根治療2型糖尿病的實(shí)驗(yàn)研究及產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。研究流程見(jiàn)圖1。

    圖1 葛根治療2型糖尿病分子機(jī)制研究流程圖

    1 方法

    1.1 葛根化學(xué)成分及類(lèi)藥性分析[8-9]化學(xué)專(zhuān)業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)由中科院上海有機(jī)化學(xué)研究所承擔(dān)建設(shè),服務(wù)于化學(xué)化工研究和開(kāi)發(fā)的綜合性信息系統(tǒng)。本研究依據(jù)化學(xué)專(zhuān)業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)的二級(jí)數(shù)據(jù)庫(kù)植物化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)檢索葛根化學(xué)成分。檢索詞為“葛”,物種名稱(chēng)Pueraria lobata,學(xué)名Pueraria lobata(Willd.)Ohwi。檢索時(shí)間:2018年8月1日。為查找葛根的化學(xué)成分,刪除來(lái)源于莖、葉的化學(xué)成分,保留來(lái)源于地下根化學(xué)成分。使用PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)和ChemicalBook(http://www.chemicalbook.com/)平臺(tái)對(duì)其分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行確證,最后將化合物保存為SDF或Mol格式文件。

    類(lèi)藥性分析是分析化合物成為藥物的可能性,Linpinski五規(guī)則是類(lèi)藥性分析的經(jīng)典方法,也是對(duì)口服藥物類(lèi)藥性經(jīng)驗(yàn)型規(guī)律總結(jié)。具體內(nèi)容包括分子量小于500;氫鍵給體數(shù)目小于5;氫鍵受體數(shù)目小于10;脂水分配系數(shù)小于5。符合Lipinski規(guī)則的化合物會(huì)有更好的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì),在生物體內(nèi)代謝過(guò)程中會(huì)有更高的生物利用度。如果化合物違背5規(guī)則2個(gè)以上,這個(gè)化合物成藥的可能性就比較低。由于傳統(tǒng)葛根治療2型糖尿病給藥途徑是口服給藥,本研究對(duì)葛根化學(xué)成分依據(jù)Linpinski規(guī)則進(jìn)行類(lèi)藥性分析。

    1.2 葛根作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)[10]藥材化學(xué)成分通過(guò)與人體特定靶點(diǎn)相結(jié)合,通過(guò)調(diào)節(jié)靶點(diǎn)生物活性或轉(zhuǎn)錄水平,使藥物發(fā)揮治療疾病的作用。依據(jù)分子相似性原理,應(yīng)用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法,預(yù)測(cè)化學(xué)成分的作用靶點(diǎn),是化合物作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)有效方法。本研究Swiss target prediction在線(xiàn)分析軟件,預(yù)測(cè)葛根中有效化學(xué)成分的作用靶點(diǎn),并將概率值大于0.5大分子作該成分的有效靶點(diǎn),提取作用靶基因名稱(chēng)構(gòu)建葛根化學(xué)成分靶點(diǎn)交互作用網(wǎng)絡(luò)。

    1.3 葛根“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 Cytoscape是一款圖形化顯示網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行分析和編輯的軟件,依據(jù)葛根化學(xué)成分與作用靶點(diǎn)的對(duì)應(yīng)關(guān)系,使用Cytoscape 3.2.1構(gòu)建葛根化學(xué)成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。使用Excel構(gòu)建成分靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)關(guān)系,然后將Excel文件導(dǎo)入cytoscape軟件以完成相關(guān)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建,其中用“節(jié)點(diǎn)”(node)表示化學(xué)成分、作用靶點(diǎn),用“邊”(edge)表示成分與靶點(diǎn)之間關(guān)系。

    1.4 葛根治療2型糖尿病蛋白質(zhì)交互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI) 糖尿病是一種慢性疾病,其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,涉及多個(gè)蛋白功能改變。本研究應(yīng)用在線(xiàn)文本挖掘服務(wù)器CooLGeN(http://ci.smu.edu.cn/CooLGeN/)獲取2糖尿病疾病相關(guān)基因。具體設(shè)置為以type 2 diabetes mellitus為關(guān)鍵詞,雜志影響因子選擇5~40,發(fā)表年限為1980~2018年,檢索數(shù)據(jù)庫(kù)為MEDLINE,物種設(shè)置為人。檢索有已報(bào)道2型糖尿病相關(guān)蛋白,提取80%以上疾病基因,作為疾病靶基因。

    通過(guò)對(duì)于葛根治療靶點(diǎn)及2型糖尿病疾病靶點(diǎn)交叉分析,獲取葛根治療2型糖尿病的靶點(diǎn),將葛根對(duì)2型糖尿病的治療靶點(diǎn)導(dǎo)入GeneMANIA蛋白質(zhì)交互作用網(wǎng)絡(luò)分析網(wǎng)站,構(gòu)建葛根治療2型糖尿病蛋白質(zhì)交互作用網(wǎng)絡(luò)。

    1.5 葛根治療2型糖尿病通路(pathway)富集分析 采用ClueGO分析插件,對(duì)上述葛根治療2型糖尿病的作用網(wǎng)絡(luò)涉及作用靶點(diǎn),進(jìn)行生物通路進(jìn)行富集分析。方法是將葛根治療2型糖尿?。╬rotein-protein interaction network)PPI網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)(基因名稱(chēng))導(dǎo)入ClueGo插件,限定物種為人,經(jīng)上述數(shù)據(jù)庫(kù)檢索和轉(zhuǎn)化操作,設(shè)定閾值P<0.05,evidience設(shè)定為all,進(jìn)行通路(pathway)富集分析。

    2 結(jié)果

    2.1 葛根化學(xué)成分及類(lèi)藥性分析 通過(guò)檢索化學(xué)專(zhuān)業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù),本研究共檢測(cè)到葛化學(xué)成分157種,其中無(wú)機(jī)物及金屬離子6種,22個(gè)化學(xué)成分來(lái)源于葛根花、葉,10個(gè)化學(xué)成分結(jié)構(gòu)信息尚在更新中。對(duì)其余119個(gè)化學(xué)成分分別使用Pubmed和Chemicalbook進(jìn)行結(jié)構(gòu)確認(rèn),另有19個(gè)化學(xué)成分結(jié)構(gòu)信息無(wú)法確認(rèn)。去除葛中金屬離子、結(jié)構(gòu)無(wú)法確認(rèn)化合物及來(lái)源于花葉中的化學(xué)成分,本研究獲得葛根化學(xué)成分100個(gè)。

    計(jì)算葛根中化學(xué)成分的Linpinski參數(shù),其中6個(gè)化學(xué)成分違背Linpinski規(guī)則,94個(gè)成分符合Linpinski規(guī)則,具有較好的類(lèi)藥性。將這些化學(xué)成分編號(hào)及CAS號(hào)整理,具體見(jiàn)表1。

    表1 葛根類(lèi)藥性化學(xué)成分表

    2.2 葛根化學(xué)成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò) 使用Swiss target prediction在線(xiàn)軟件化學(xué)成分靶點(diǎn)預(yù)測(cè)軟件,選擇靶點(diǎn)概率大于0.5有效靶點(diǎn)。Excel建立化學(xué)成分-作用靶點(diǎn)的對(duì)應(yīng)關(guān)系,Cytoscape構(gòu)建成分-靶點(diǎn)的相互作用網(wǎng)絡(luò)(圖2)。由于94個(gè)類(lèi)藥性成分中24個(gè)成分預(yù)測(cè)靶點(diǎn)概率均小于0.5,視此成分無(wú)有效靶點(diǎn),構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)是不考慮此成分。網(wǎng)絡(luò)基于葛根中70個(gè)化學(xué)成分,作用于180靶點(diǎn)。葛根成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)作用圖反映了葛根“多成分,多靶點(diǎn)”作用的特點(diǎn),也提示葛根治療2型糖尿病作用機(jī)制可能是與葛根多靶點(diǎn)作用相關(guān)。

    圖2 葛根類(lèi)藥性成分與靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

    2.3 葛根治療2型糖尿病治療靶點(diǎn)蛋白質(zhì)交互作用網(wǎng)絡(luò) 通過(guò)對(duì)CoolGEN數(shù)據(jù)庫(kù)檢索,研究共獲得2型糖尿病疾病相關(guān)基因297個(gè),通過(guò)與葛根180個(gè)治療靶點(diǎn)的交互作用分析,發(fā)現(xiàn)13個(gè)疾病與葛根共有靶點(diǎn)(圖3)。

    圖3 葛根作用靶點(diǎn)及2型糖尿病疾病靶點(diǎn)的交叉分析

    機(jī)體的內(nèi)在調(diào)控往往不是單一的信號(hào)通路支配的,而是復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。不同的信號(hào)通路和靶點(diǎn)之間會(huì)存在一定程度的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),藥物的治療作用除表現(xiàn)為成分靶點(diǎn)的直接結(jié)合外,更多見(jiàn)于直接調(diào)控靶點(diǎn)與間接調(diào)控其他靶點(diǎn)相結(jié)合的調(diào)控方式。而蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系數(shù)據(jù)為尋找靶點(diǎn)的直接、間接調(diào)控作用關(guān)系提供了可能。為探索葛根治療2型糖尿病的作用機(jī)制,研究將葛根治療2型糖尿病的作用靶點(diǎn)13個(gè)靶點(diǎn),以基因名稱(chēng)導(dǎo)入GeneMANIA數(shù)據(jù)庫(kù),構(gòu)建起蛋白質(zhì)交互作用網(wǎng)絡(luò)(圖4),該網(wǎng)絡(luò)共有33個(gè)蛋白。

    圖4 葛根治療2型糖尿病靶點(diǎn)蛋白質(zhì)交互作用圖(圓圈大?。汗?jié)點(diǎn)度;線(xiàn)條粗細(xì):交互作用可能性)

    2.4 葛根治療2型糖尿病靶點(diǎn)的通路富集分析 依據(jù)葛根治療2型糖尿病靶點(diǎn)交互作用網(wǎng)絡(luò),提取相互作用靶點(diǎn)以基因名稱(chēng)導(dǎo)入ClueGo,對(duì)葛根治療2型糖尿病靶點(diǎn)進(jìn)行通路富集分析。富集結(jié)果見(jiàn)圖5。通過(guò)對(duì)生物通路的富集分析,發(fā)現(xiàn)葛根治療2型糖尿病通路包括脂肪攝取及消化,PPAR信號(hào)通路,甘油三酯催化通路及甘油三酯代謝通路,游離脂肪酸通路及長(zhǎng)鏈脂肪酸通路,調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞脂化,前列腺素合成及調(diào)節(jié)通路,硒微量元素網(wǎng)絡(luò)通路,色氨酸代謝通路,AGE/RAGE通路等14條代謝通路。

    圖5 葛根治療2型糖尿病相關(guān)通路網(wǎng)絡(luò)

    3 討論

    2型糖尿病是是一種血糖升高為主要特征的代謝性疾病,其臨床表現(xiàn)主要是血糖升高、脂代謝紊亂。胰島素抵抗是指主要的病理因素,目前認(rèn)為胰島素抵抗的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,其中脂毒性學(xué)說(shuō)、微量元素缺乏學(xué)說(shuō)、慢性炎癥學(xué)說(shuō)是糖尿病重要發(fā)病機(jī)制學(xué)說(shuō)。葛根主消渴,2型糖尿病屬消渴的范疇,研究表明葛根及主要成分葛根素具有降血糖、降血脂,治療2型糖尿病。探索葛根治療2型糖尿病的作用機(jī)制對(duì)于葛根的臨床應(yīng)用及產(chǎn)品開(kāi)發(fā)具有重要的意義。

    本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法,探索葛根治療2型糖尿病的機(jī)制。發(fā)現(xiàn)94個(gè)具有較好的吸收特征葛根化學(xué)成分,這些化學(xué)成分可能是葛根藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)。依據(jù)分子相似性原理預(yù)測(cè)化學(xué)成分作用靶點(diǎn),葛根化學(xué)成分主要作用180個(gè)靶點(diǎn),其中13個(gè)靶點(diǎn)為藥材與疾病共有靶點(diǎn),通過(guò)蛋白質(zhì)交互作用分析,構(gòu)建基于33個(gè)基因交互作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。對(duì)葛根治療2型糖尿病的蛋白質(zhì)交互作用網(wǎng)絡(luò)上蛋白進(jìn)行通路富集分析,葛根治療2型糖尿病的通路包括脂肪攝取及消化,PPAR信號(hào)通路,甘油三酯催化通路及甘油三酯代謝通路,游離脂肪酸聯(lián)合長(zhǎng)鏈脂肪酸通路,調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞細(xì)胞中脂質(zhì)分解等14條通路。

    葛根治療2型糖尿病的主要機(jī)制可能與葛根對(duì)脂質(zhì)的影響有關(guān)。葛根影響脂肪消化和吸收,從而減少外源性脂肪進(jìn)入體內(nèi);其次影響甘油三酯的催化和代謝,降低體內(nèi)甘油三酯的水平;再次影響脂肪酸結(jié)合蛋白與長(zhǎng)鏈脂肪酸的結(jié)合,從而影響循環(huán)系統(tǒng)脂肪酸含量。目前研究證實(shí)具有改善2型糖尿病脂代謝紊亂,降低甘油三酯和游離脂肪酸水平[11]。PPAR信號(hào)通路可能在葛根改善糖尿病患者脂肪水平過(guò)程發(fā)揮重要作用。PPAR是過(guò)氧化物酶體增殖劑激活受體,主要包括α,β/δ,γ三種亞型。PPARα主要表達(dá)于脂肪酸分解代謝速度較快的棕色脂肪細(xì)胞中,其次表達(dá)于肝、腎、心臟、骨骼肌細(xì)胞中,PPARα可以通過(guò)多種通路調(diào)節(jié)膽固醇和游離脂肪酸[12],PPARβ的表達(dá)較為廣泛,在脂肪酸的分解代謝、能量代謝及膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)中起一定作用。PPARγ其次表達(dá)于腎、脾、肝臟、小腸、骨骼肌和巨噬細(xì)胞中,已被證明對(duì)調(diào)節(jié)糖脂代謝有著重要的作用[13]。葛根及葛根素可以調(diào)節(jié)是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和脂肪細(xì)胞中PPARγ的表達(dá),改善胰島素抵抗模式生物的糖脂代謝紊亂[14-15]。

    上述通路富集結(jié)果還顯示,網(wǎng)絡(luò)集群中還覆蓋了硒微量元素網(wǎng)絡(luò),前列腺素合成及調(diào)節(jié)通路、脂肪組織中脂質(zhì)水解,色氨酸代謝,AGEs/RAGEs通路。因此除了影響糖尿病患者脂質(zhì)代謝,改善脂代謝紊亂治療糖尿病病外,葛根還具有影響體內(nèi)多種通路發(fā)揮抗糖尿病的作用。

    本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析藥物與疾病相互網(wǎng)絡(luò)關(guān)系,有效地揭示葛根治療2型糖尿病的作用機(jī)制,為葛根治療型糖尿病的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的優(yōu)化及葛根產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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