高糖對(duì)人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥因子和線粒體功能的影響及津力達(dá)聯(lián)合通心絡(luò)的保護(hù)作用

位 庚 邢玉微 申瑞霞 郭會(huì)敏 梁俊清 姚 兵 郭志方(石家莊市第二醫(yī)院，河北 石家莊 05005)

糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)為糖尿病初期最為嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，主要病理改變是眼底血管結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，出現(xiàn)微動(dòng)脈瘤、滲出或新生血管形成;患者視力、視野明顯減退，甚者失明。非增殖期DR通過(guò)積極的藥物治療是可以逆轉(zhuǎn)的，而到出現(xiàn)新生血管等增殖期病變時(shí)則無(wú)法逆轉(zhuǎn)。中醫(yī)藥治療DR非增殖期療效明顯〔1，2〕。本課題組前期的臨床研究已顯示津力達(dá)聯(lián)合通心絡(luò)對(duì)非增殖期DR有較好的療效，但其作用機(jī)制尚不明確〔3〕。視網(wǎng)膜微血管由單層內(nèi)皮細(xì)胞組成，本研究分析人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HRCECs)高糖誘導(dǎo)損傷及津力達(dá)(JLD)聯(lián)合通心絡(luò)(TXL)對(duì)該損傷的干預(yù)作用及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 HRCECs購(gòu)自美國(guó)Sciencell公司。JLD及TXL藥粉由石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司提供;內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(ECM)(美國(guó)Sciencell公司);細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK-8，日本同仁化學(xué)研究所);白細(xì)胞介素(IL)-6及細(xì)胞間黏附分子(ICAM)-1試劑盒(南京建成生物工程研究所);JC-1線粒體膜電位分析試劑盒(美國(guó)Cayman公司);細(xì)胞色素(Cyt)C抗體(美國(guó)Santa Cruz公司);核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB p65抗體(美國(guó)Abcam公司)。Primo Vert倒置顯微鏡(德國(guó)Zeiss公司);Forma371細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Electron公司);SW-CJ-ZFD生物潔凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司);多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio Tek公司);UVP凝膠掃描系統(tǒng)(美國(guó)UVP公司);電轉(zhuǎn)膜儀、半干轉(zhuǎn)膜儀、垂直電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.2 藥物配制 配制JLD及TXL工作液〔4〕。

1.3 細(xì)胞分組及處理 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HRCECs，胰蛋白酶消化后將細(xì)胞接種于直徑為6 cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿或96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，使細(xì)胞密度為1.0×105個(gè)/ml，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞融合至80%用于實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞被隨機(jī)分為以下5組(每組平行設(shè)置3～4個(gè)復(fù)孔)，(1)正常對(duì)照組:正常培養(yǎng)的HRCECs棄去原培養(yǎng)基，換為無(wú)血清ECM培養(yǎng)基;(2)模型組:正常培養(yǎng)的HRCECs棄去原培養(yǎng)基，換為含30 mmol/L葡萄糖的ECM無(wú)血清培養(yǎng)基;(3)JLD組:正常培養(yǎng)的HRCECs棄去原培養(yǎng)基，換為含JLD 200 μg/ml無(wú)血清ECM培養(yǎng)基預(yù)孵育4 h后，換為含葡萄糖30 mmol/L加 JLD 200 μg/ml的無(wú)血清 ECM培養(yǎng)基;(4)TXL組:正常培養(yǎng)的HRCECs棄去原培養(yǎng)基，換為含 TXL 100 μg/ml的無(wú)血清 ECM培養(yǎng)基預(yù)孵育4 h后，換為含葡萄糖30 mmol/L加TXL 100 μg/ml的無(wú)血清 ECM 培養(yǎng)基;(5)JLD+TXL組:正常培養(yǎng)的HRCECs棄去原培養(yǎng)基，換為含 JLD 200 μg/ml加 TXL 100 μg/ml預(yù)孵育 4 h，換為含葡萄糖 30 mmol/L加 JLD 200 μg/ml加 TXL 100 μg/ml的無(wú)血清ECM培養(yǎng)基。以上5組細(xì)胞處理完畢后置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后待檢測(cè)。

1.4 CCK-8檢測(cè)HRCECs生存活性 接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的HRCECs按照1.3處理后，吸棄原培養(yǎng)基，每孔加入含CCK-8的無(wú)血清ECM培養(yǎng)基100 μl，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育1 h后酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處OD值。以各組OD值與正常對(duì)照組的比值行統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 ELISA檢測(cè)HRCECs上清液中IL-6和ICAM-1含量 接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的HRCECs按1.3處理后，收集各組細(xì)胞上清液，1.5 ml無(wú)菌 EP管中1 000 r/min離心2 min取上清液。ELISA檢測(cè)各組細(xì)胞上清液中IL-6和ICAM-1含量，操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書。

1.6 JC-1試劑盒測(cè)定細(xì)胞中線粒體膜電位(MMP)接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的RCMECs按1.3處理后，JC-1 MMP分析試劑盒測(cè)定，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.7 Western印跡法檢測(cè)NF-κB、CytC蛋白表達(dá) 接種于直徑為6 cm細(xì)胞皿的HRCECs按1.3處理后，生理鹽水沖洗2次，吸棄生理鹽水，培養(yǎng)皿內(nèi)加入40 μl細(xì)胞裂解液于冰上充分裂解20 min，超聲破碎后放入4℃離心機(jī)內(nèi)，以12 000 r/min離心20 min，收集上清液，取2 μl進(jìn)行蛋白定量后，取等量蛋白樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，約5 h后電泳結(jié)束，取下凝膠進(jìn)行半干轉(zhuǎn)膜，約1 h后轉(zhuǎn)膜完成，于封閉液中封閉2 h，一抗孵育，至于搖床上4℃過(guò)夜，洗膜后與二抗結(jié)合1 h，洗膜后用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)抗體結(jié)合區(qū)帶，以GAPDH作為內(nèi)參，將各目的蛋白吸光度值與GAPDH吸光度值的比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，若方差齊時(shí)采用最小顯著差法(LSD)，若方差不齊采用Dunnett T3法。

2 結(jié)果

2.1 生存活性 與正常對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞生存活性明顯降低(P＜0.01);與模型組比較，JLD組、TXL組及JLD+TXL組細(xì)胞生存活性均明顯升高(P＜0.01);與JLD組、TXL組比較，JLD+TXL組細(xì)胞生存活性明顯升高(P＜0.05)。見表1。

2.2 高糖損傷HRCECs上清液IL-6和ICAM-1含量與正常對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞上清液中IL-6和ICAM-1含量明顯升高(P＜0.01);與模型組比較，JLD組、TXL組及JLD+TXL組細(xì)胞上清液中IL-6和ICAM-1含量明顯降低(P＜0.01);與JLD組比較，JLD+TXL組細(xì)胞上清液中IL-6含量明顯降低(P＜0.05)，TXL組及JLD+TXL組ICAM-1含量明顯降低(P＜0.01)。見表1。

2.3 高糖損傷HRCECs MMP 與正常對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞MMP明顯降低(P＜0.01);與模型組比較，TXL組及JLD+TXL組細(xì)胞MMP明顯升高(P＜0.01);與JLD組比較，TXL組、JLD+TXL組細(xì)胞MMP明顯升高(P＜0.01)，與TXL組比較，JLD+TXL組細(xì)胞MMP明顯升高(P＜0.05)。見表1。

2.4 高糖損傷HRCECs NF-κB、CytC蛋白表達(dá) 與正常對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞NF-κB、CytC蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P＜0.01);與模型組比較，JLD組、TXL組及JLD+TXL組細(xì)胞NF-κB、CytC蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P＜0.01);與 JLD 組比較，JLD+TXL 組細(xì)胞 NF-κB、CytC蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P＜0.01)。見表1，圖1。

表1 各組HRCECs生存活性、細(xì)胞上清液IL-6、ICAM-1含量、MMP、NF-κB及CytC蛋白表達(dá)比較(，n=4)

表1 各組HRCECs生存活性、細(xì)胞上清液IL-6、ICAM-1含量、MMP、NF-κB及CytC蛋白表達(dá)比較(，n=4)

與正常對(duì)照組比較:1)P＜0.01;與模型組比較:2)P＜0.01;與JLD組比較:3)P＜0.01，4)P＜0.05;與TXL組比較:5)P＜0.05

組別 生存活性(%) IL-6(pg/ml) ICAM-1(pg/ml) MMP NF-κB CytC正常對(duì)照組 100.00±2.19 21.49±2.31 140.27±8.59 3.17±0.12 0.14±0.02 0.10±0.05模型組 42.71±9.761) 56.78±5.821) 211.36±11.711) 1.56±0.181) 0.58±0.041) 0.31±0.071)JLD 組 63.99±4.322) 46.98±2.542) 187.13±6.272) 1.80±0.08 0.38±0.052) 0.23±0.062)TXL 組 65.68±4.452) 42.98±5.462) 163.67±10.032)3) 2.07±0.202)3) 0.32±0.052) 0.16±0.042)JLD+TXL 組 74.33±3.722)4)5) 39.55±3.792)4) 157.12±12.022)3) 2.53±0.192)3)5) 0.26±0.032)3) 0.12±0.042)3)

圖1 各組HRCECs NF-κB、CytC蛋白表達(dá)

3 討論

吳以嶺院士創(chuàng)建的脈絡(luò)學(xué)說(shuō)指導(dǎo)從“脾”論治消渴(糖尿病)，提出“運(yùn)脾津、通脾絡(luò)”的消渴新治法，其治療的代表藥物為JLD顆粒和TXL膠囊〔5〕。已有實(shí)驗(yàn)研究將JLD聯(lián)合TXL用于保護(hù)胰島微血管內(nèi)皮細(xì)胞，結(jié)果顯示其保護(hù)機(jī)制與減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)〔4〕。亦有臨床研究顯示JLD顆粒聯(lián)合TXL膠囊能有效降低糖尿病腎病患者尿蛋白、改善腎功能〔6〕。視網(wǎng)膜血管屬于微血管范疇，屬中醫(yī)學(xué)“絡(luò)脈”，而視網(wǎng)膜微血管的病變則屬“絡(luò)病”范疇。胰島微血管、腎臟微血管與視網(wǎng)膜微血管同為微血管。

DR為糖尿病的常見并發(fā)癥，已成為主要致盲眼病之一。近年實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，DR的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中炎癥起到了重要的作用，該觀點(diǎn)的提出為治療DR提供了新方向〔7〕。NF-κB是細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵因子之一，能夠調(diào)控包括IL-6和ICAM-1在內(nèi)的多種炎癥細(xì)胞因子的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)〔8〕。IL-6作為前炎癥因子，在炎癥反應(yīng)中起著重要的作用〔9〕。IL-6可上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1等的表達(dá)〔10〕。生存活性的提高是保證血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮正常功能的基礎(chǔ)條件。本文中高糖誘導(dǎo)的HRCECs中NF-κB蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，表明細(xì)胞內(nèi)炎癥調(diào)節(jié)因子被激活，產(chǎn)生了炎癥反應(yīng)。被NF-κB蛋白調(diào)控的炎癥因子IL-6和ICAM-1，經(jīng)高糖損傷后其細(xì)胞上清液中同樣表現(xiàn)出含量增加的趨勢(shì)，JLD和TXL均能提高高糖損傷的HRCECs生存活性、抑制高糖引起的炎癥反應(yīng)，二者聯(lián)合使用其效果更優(yōu)。線粒體存在于大多數(shù)細(xì)胞中，細(xì)胞的有氧呼吸主要在此進(jìn)行，對(duì)細(xì)胞受到的損傷較為敏感。已有研究顯示，高糖可損傷內(nèi)皮細(xì)胞的線粒體，是細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一。高糖等損傷因素可使線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔保持持續(xù)開放，通透性增加，MMP下降，導(dǎo)致跨膜的氫離子濃度梯度消失，引起呼吸鏈脫耦聯(lián)，此時(shí)線粒體發(fā)生滲透性水腫，外膜破裂，使存在于線粒體內(nèi)的CytC釋放入胞質(zhì)〔11〕，導(dǎo)致線粒體內(nèi)的CytC減少，直接造成了線粒體內(nèi)呼吸鏈電子傳遞的中斷，抑制氧化磷酸化，促進(jìn)了氧自由基的生成，繼而ATP含量減少，可最終導(dǎo)致細(xì)胞損傷乃至壞死〔12〕。本研究說(shuō)明JLD聯(lián)合TXL可有效逆轉(zhuǎn)線粒體的損傷狀態(tài)。綜上，高糖可誘導(dǎo)HRCECs產(chǎn)生炎癥反應(yīng)及損傷線粒體功能，JLD聯(lián)合TXL可抑制該過(guò)程，其作用機(jī)制可能與減輕NF-κB的活化，進(jìn)而減少炎癥因子的釋放及保護(hù)線粒體功能有關(guān)。