氨基羥乙酸對慢性酒精中毒大鼠海馬線粒體及纖維狀肌動蛋白的影響

代 玄 付鵬艷 侯佳寶 姜洪波 杜愛林 張瑞嶺 羅曉秋 (新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與神經(jīng)生物學(xué)教研室 中英腦功能損傷聯(lián)合實驗室 河南省高校腦研究重點實驗室培育基地，河南 新鄉(xiāng) 453003)

慢性酒精中毒是一種潛在的可以致人死亡的疾病。過量飲酒對腦組織有一定影響，可造成大腦學(xué)習(xí)記憶、認(rèn)知判斷等功能下降，出現(xiàn)神經(jīng)行為異常等問題，不僅嚴(yán)重?fù)p害患者的身體健康，而且可能引發(fā)一系列的社會安全問題。研究〔1～5〕顯示飲用酒精可引起學(xué)習(xí)、記憶水平下降和精神行為功能缺陷。氨基羥乙酸(AOAA)是胱硫醚-β-合成酶(CBS)活性抑制劑〔6〕，可使H2S含量減少，進而抑制 Ca2+內(nèi)流，減輕細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，從而改善受損中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能。細(xì)胞骨架是維持細(xì)胞正常形態(tài)與功能的重要結(jié)構(gòu)，其中F-actin是細(xì)胞最重要的骨架成分之一。F-actin的完整對于維持內(nèi)皮細(xì)胞的正常功能是必需的〔7〕。本實驗探討AOAA對慢性酒精中毒大鼠組織損傷和行為的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 60只清潔級健康雄性SD大鼠，體重120～160 g，由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院動物管理中心提供，實驗前在22～25℃實驗室中適應(yīng)性飼養(yǎng)5～7 d。隨機分為正常對照(NC)組、AOAA治療(AR)組、慢性酒精中毒模型(M)組，每組20只。高速冷凍離心機由德國Heraeus公司生產(chǎn);Eclipse E200顯微鏡由日本Nikon公司提供;NaHS由美國ACROS公司提供;超微量總ATP酶測定試劑盒、總蛋白測定試劑盒、線粒體提取試劑盒由中國南京建成生物工程研究所提供;AOAA由美國ACROS公司提供;兔抗F-肌動蛋白(actin)抗體購自北京Solarbio公司;SP試劑盒由中國博奧森公司生產(chǎn);二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;其他試劑均為國產(chǎn)或進口分析純級。

1.2 模型建立 除NC組外，各組飲含6%(V/V)酒精水溶液28 d，酒精溶液每日9∶00配制，置換，構(gòu)建慢性酒精中毒大鼠模型〔8〕。14 d后，AOAA溶解在1 ml生理鹽水中，每日腹腔注射一次，連續(xù)14 d，劑量為NC組1 ml生理鹽水，AR組5 mg/kg。

1.3 學(xué)習(xí)和記憶能力評價 各組進行Y型電迷宮測試〔9〕，Y型電迷宮分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三個臂，隨機選擇作為安全區(qū)。每臂頂端設(shè)立一個信號燈，燈亮后提示此臂為安全區(qū)。學(xué)習(xí)記憶測試均在晚間暗光、安靜下進行，將大鼠置于迷宮中，并打開三條臂的指示燈，讓其適應(yīng)環(huán)境，適應(yīng)3 min后將燈熄滅。隨機打開其中一臂的指示燈，指示燈不亮的兩臂自動延遲5 s后通電電擊大鼠，直至大鼠逃避到安全區(qū)為止，然后燈亮持續(xù)15 s后熄滅，完成1次測試。大鼠在10 s內(nèi)一次直接逃至安全區(qū)為正確反應(yīng)，否則為錯誤反應(yīng)。以10次電刺激后有9次做出正確反應(yīng)為學(xué)會，用大鼠做出正確反應(yīng)所需訓(xùn)練的次數(shù)來表示其空間分辨反應(yīng)的學(xué)習(xí)記憶成績，訓(xùn)練次數(shù)越少，說明大鼠學(xué)習(xí)能力越強。

1.4 分光光度法間接測定海馬組織H2S的含量 在波長670 nm處測定吸光度，根據(jù)H2S標(biāo)準(zhǔn)曲線計算溶液中的H2S含量，海馬中H2S含量以單位重量的組織H2S的量(nmol/g)表示。

1.5 電子顯微鏡下觀察線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu) 取海馬組織制成樣本，電子顯微鏡觀察并攝片。

1.6 海馬線粒體提取 按照線粒體提取試劑盒說明書，依次經(jīng)過機械方法破裂細(xì)胞、低速差速離心去除殘渣碎屑和巨大細(xì)胞器、高速差速離心獲得線粒體。

1.7 蛋白濃度測定 按照蛋白定量測試盒說明書測出樣本蛋白濃度。

1.8 線粒體ATP酶活力的測定 按照超微量總ATP酶測定試劑盒說明書，依次經(jīng)過樣本前處理，酶促反應(yīng)和定磷反應(yīng)。使用分光光度計在波長636 nm處測定吸光度，根據(jù)公式計算出ATP酶的活性。

1.9 免疫組化觀察F-actin 每組隨機選取4只大鼠，全部用作免疫組化檢測，每只大鼠取腦、固定、包埋、切片。石蠟切片經(jīng)脫蠟復(fù)水后，進行免疫組化，DAB顯色，常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片，顯微鏡觀察雙側(cè)海馬并攝片。

1.10 統(tǒng)計處理 使用SPSS13．0進行t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 學(xué)習(xí)記憶成績 與NC組相比，M組學(xué)習(xí)和記憶能力明顯降低，表現(xiàn)為學(xué)會空間分辨所需訓(xùn)練次數(shù)顯著增高(P＜0.01);與M組相比，AR組學(xué)會空間分辨所需訓(xùn)練次數(shù)明顯減少(P＜0.01)。見表1。

2.2 海馬組織中H2S的含量 與NC組相比，M組海馬組織內(nèi)H2S含量明顯增高(P＜0.01);與M組相比，AR組海馬組織中H2S含量顯著降低(P＜0.01)。見表1。

表1 各組學(xué)習(xí)記憶能力和海馬組織中H2S的含量(，n=20)

與NC組比較:1)P＜0.01;與M組比較:2)P＜0.01;下表同

組別 學(xué)會空間辨認(rèn)的訓(xùn)練次數(shù) H2S(nmol/g)NC 組 40.250 0±4.008 3 27.430 5±1.520 4 M 組 83.562 5±4.925 71) 44.505 6±2.401 31)AR 組 64.437 5±3.915 21)2) 36.707 5±2.123 31)2)

2.3 電鏡觀察海馬組織中線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu) NC組海馬組織細(xì)胞內(nèi)的線粒體電鏡下形態(tài)完好，偶有缺損;M組大多線粒體內(nèi)出現(xiàn)空泡，嵴斷裂而且腫脹變形;AR組線粒體形態(tài)有所改善。見圖1。

2.4 線粒體ATP酶活性 與NC組相比，M組海馬組織內(nèi)的線粒體ATP酶活性明顯降低(P＜0.01);與M組相比，AR組海馬組織內(nèi)線粒體ATP酶活性顯著上升(P＜0.01)。見表2。

2.5 光鏡觀察海馬組織中F-actin表達 各組海馬CA1區(qū)均可見一定量F-actin表達。與NC組相比，M組F-actin含量明顯降低(P＜0.01);與M組相比，AR組F-actin含量顯著上升(P＜0.01)。見表2和圖2。

表2 各組海馬組織中線粒體ATP酶活性和F-actin平均光密度值(，n=4)

表2 各組海馬組織中線粒體ATP酶活性和F-actin平均光密度值(，n=4)

組別 ATP酶活性( μmolPi·mgprot－1·h－1)F-actin平均光密度值NC 組 2.096 8±0.033 9 0.056 3±0.002 6 M 組 1.485 3±0.042 91) 0.031 1±0.002 01)AR 組 1.631 2±0.053 71)2) 0.039 9±0.002 31)2)

圖2 各組海馬組織F-actin表達(×400)

3 討論

慢性酒精中毒可以對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能造成嚴(yán)重?fù)p害，引起學(xué)習(xí)記憶方面的認(rèn)知功能障礙。本研究提示，AOAA能減輕慢性酒精中毒大鼠所致的記憶力下降，提高學(xué)習(xí)記憶能力。

H2S 是體內(nèi)重要的氣體信號分子〔10～13〕。腦內(nèi)含硫氨基酸(蛋氨酸)在體內(nèi)代謝生成半胱氨酸，半胱氨酸在CBS催化下生成H2S〔14〕。生理濃度下，H2S可以舒張血管，抗氧化應(yīng)激，維持大鼠學(xué)習(xí)記憶、智力水平。而高濃度的H2S對活體器官具有一定的傷害作用:一方面體現(xiàn)在對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抑制作用，能夠特異性地抑制興奮性突觸后膜電位，從而阻滯突觸傳遞，抑制神經(jīng)元正常的功能〔15～17〕;另一方面通過增強 N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體介導(dǎo)的鈣超載，使線粒體腫脹變形、能量代謝出現(xiàn)障礙，導(dǎo)致細(xì)胞逐步壞死〔18，19〕。而慢性酒精中毒可以激活 CBS，催化 H2S大量形成〔19〕;AOAA 是 CBS 活性抑制劑〔6〕，可以通過抑制CBS活性來減少組織中H2S含量。

線粒體是一種存在于大多數(shù)細(xì)胞中的由兩層膜包被的細(xì)胞器，是細(xì)胞中產(chǎn)生能量的結(jié)構(gòu)，是細(xì)胞進行有氧呼吸的主要場所。ATP酶存在于組織細(xì)胞及細(xì)胞器的膜上，是生物膜的一種蛋白酶，它在物質(zhì)運送、能量轉(zhuǎn)換及信息傳遞方面具有重要的作用，機體在缺血、缺氧及一些疾病狀態(tài)下，此酶活力發(fā)生改變〔20〕。

actin是真核細(xì)胞最主要的骨架成分之一，它有單體(G-actin)和纖維狀(F-actin)兩種形式，這兩種形式之間可以相互轉(zhuǎn)換〔21〕。研究證明，酒精的主要成分乙醇及其代謝產(chǎn)物乙醛、氧自由基及高濃度H2S的毒性效應(yīng)可以使F-actin的裝配能量不足和分解加劇，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)F-actin含量降低，使細(xì)胞骨架溶解、重構(gòu)、塌陷，從而導(dǎo)致突觸結(jié)構(gòu)改變，突觸傳遞受到阻滯，引發(fā)神經(jīng)元功能障礙，降低其智力水平〔22〕。

綜上所述，AOAA可減輕慢性酒精中毒對大鼠腦組織的損傷，可能是通過降低組織內(nèi)H2S含量，從而保護線粒體的功能，減輕酒精對F-actin的損傷進而保護神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)和功能，使慢性酒精中毒大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和智力水平提高。