白細(xì)胞介素-6及叉狀頭轉(zhuǎn)錄因子3在老年口腔鱗癌患者外周血及癌組織中表達(dá)及意義

吳 慧 鄭根建 何 龍 陶 巍 肖 旭 (海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院口腔內(nèi)科，海南 ?？?57023)

口腔癌是世界第六大常見腫瘤，據(jù)報(bào)道口腔癌每年新發(fā)病例26.3萬例，死亡近13萬〔1，2〕。我國(guó)每年新發(fā)口腔癌病例近4.65萬例〔2〕。目前口腔癌發(fā)病原因尚不是十分明確，相關(guān)研究表明吸煙、飲酒、口腔衛(wèi)生差、膳食類型等因素與口腔癌有關(guān)，其中多數(shù)老年患者由于不良生活習(xí)慣，長(zhǎng)期吸煙及飲酒導(dǎo)致多種基礎(chǔ)疾病，使口腔癌發(fā)病的影響更加復(fù)雜〔3～5〕。本研究通過檢測(cè)老年口腔癌組織及外周血中白細(xì)胞介素(IL)-6和叉狀頭轉(zhuǎn)錄因子(Foxp)3的表達(dá)，探討其發(fā)病機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2012年3月至2017年3月海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院口腔科門診治療并經(jīng)病理分析確診的60例原發(fā)性口腔癌患者為觀察組，術(shù)前均未進(jìn)行過任何的抗腫瘤治療，并同時(shí)選取50例口腔良性腫瘤患者為對(duì)照組。年齡60～78歲，平均(69.8±5.1)歲，兩組平均年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);其中觀察組發(fā)病部位包括舌、牙齦、頰黏膜及口底等，對(duì)照組男27例，女23例，兩組性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2 樣本的收集 于清晨空腹抽取患者外周靜脈血3 ml，用于流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。兩組手術(shù)切除新鮮標(biāo)本予以固定脫水、石蠟包埋，每例組織進(jìn)行連續(xù)4張切片，切片厚度約為4 μm，并將切片置于預(yù)處理的載玻片上，60℃烘箱中放置過夜，以備免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)IL-6和Foxp3的表達(dá)。

1.3 外周血中IL-6，F(xiàn)oxp3的檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測(cè)外周血IL-6濃度。IL-6單抗包被于酶標(biāo)板上，血清中的 IL-6與單抗結(jié)合;加入生物素標(biāo)記IL-6二抗，在酶標(biāo)板上形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體免疫復(fù)合物;加入顯色液進(jìn)行顯色處理;用酶標(biāo)儀測(cè)量吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血漿中IL-6濃度。步驟如下:濃縮洗滌液用蒸餾水稀釋，混勻后備用;將標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行稀釋，并得到200 pg/ml的高濃度標(biāo)準(zhǔn)品，然后依次稀釋為:100.00，50.00，25.00，12.50，6.25，3.13，0.00 pg/ml;在酶標(biāo)板上加入 100 μl標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)樣品，每個(gè)樣品加一個(gè)孔;混勻后封住板孔，室溫孵育2 h;去除酶標(biāo)板內(nèi)液體，并洗滌反應(yīng)板(每孔內(nèi)加入300 μl洗滌液)，每次洗滌后完全去除液體，反復(fù)洗滌3次;每孔加入100 μl IL-6抗體生物素液，混勻后室溫孵育1 h;去除酶標(biāo)板內(nèi)液體，并洗滌反應(yīng)板(每孔內(nèi)加入300 μl洗滌液)，每次洗滌后完全去除液體，反復(fù)洗滌3次;每孔加入 100 μl酶聯(lián)結(jié)合液，混勻后室溫孵育30 min;去除酶標(biāo)板內(nèi)液體，并洗滌反應(yīng)板(每孔內(nèi)加入300 μl洗滌液)，每次洗滌后完全去除液體，反復(fù)洗滌3次;每孔加入 100 μl顯色液，混勻后室溫孵育30 min;反應(yīng)完成后，在每孔中加入 50 μl終止液，混勻，在酶標(biāo)儀上讀取吸光度值;繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線;將待測(cè)樣本的吸光度帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)應(yīng)的方程中，計(jì)算待測(cè)樣本的濃度。外周血中Foxp3的檢測(cè)步驟同上。

1.4 組織切片中IL-6，F(xiàn)oxp3的檢測(cè) 將組織切片至于68℃烤箱30 min，再行脫蠟處理，梯度酒精脫水:二甲苯孵育5 min，加入新的二甲苯繼續(xù)孵育5 min，無水乙醇洗滌3 min，95%乙醇洗滌3 min，80%乙醇洗滌3 min，而后磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，每次3 min;以檸檬酸鈉為修復(fù)液進(jìn)行熱修復(fù)，將載有玻片的盒子置入高壓鍋內(nèi)電磁爐加熱至沸騰煮5 min后，停止加熱，并冷卻至室溫;甲醇-H2O2溶液予以避光修復(fù)20 min，PBS洗滌3次，每次3 min;按照1∶500的比例加入IL-6抗體，對(duì)石蠟組織切片進(jìn)行室溫孵育1 h或者4℃孵育過夜，之后用1×PBS緩沖液沖洗3次，每次3 min;按照 1∶1 000的比例加入辣根過氧化物酶(HRP)二抗，對(duì)石蠟組織切片進(jìn)行室溫孵育40 min，之后用PBS緩沖液沖洗3次，每次3 min;加入二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒中的顯色劑，室溫孵育 5～10 min，然后清水沖洗;再進(jìn)行蘇木精復(fù)染室溫孵育3～5 min，清水沖洗;對(duì)染色后的切片進(jìn)行梯度酒精水化處理，然后樹膠封片觀察。采用上述同樣的操作方法，對(duì)組織切片中的Foxp3進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色觀察。

1.5 結(jié)果的判定 Foxp3表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞，通過免疫組織化學(xué)染色，細(xì)胞核內(nèi)有棕黃色顆粒;IL-6表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞，細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜內(nèi)可觀察到棕色顆粒。以PBS代替一抗，進(jìn)行正常人群口腔黏膜上皮組織的免疫組織化學(xué)染色為實(shí)驗(yàn)的陰性對(duì)照組，以ELISA試劑盒中的陽(yáng)性染色結(jié)果，作為實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性對(duì)照組。在400×的視野下，隨機(jī)選取5個(gè)視野，并對(duì)這5個(gè)視野中的細(xì)胞總數(shù)以及陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t、χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性檢驗(yàn)采用Spearman分析。

2 結(jié)果

2.1 外周血中IL-6、Foxp3表達(dá)水平的比較 觀察組外周血中IL-6平均濃度顯著高于對(duì)照組(P＜0.05);Foxp3在對(duì)照組外周血中平均濃度顯著低于觀察組(P＜0.05)，見表 1。

2.2 多水平檢測(cè)口腔癌患者外周血中IL-6、Foxp3的表達(dá) IL-6濃度在男性和女性患者及有無吸煙史者表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);不同的TNM分期階段，IL-6濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.032)，F(xiàn)oxp3濃度在男性和女性患者中有無吸煙史的患者中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);Ⅲ/Ⅳ期患者Foxp3濃度顯著高于Ⅰ/Ⅱ期患者(P=0.001)，見表2。

表1 兩組外周血中IL-6，F(xiàn)oxp3濃度比較(，μg/L)

表1 兩組外周血中IL-6，F(xiàn)oxp3濃度比較(，μg/L)

組別 n IL-6 Foxp3對(duì)照組 50 1.72±0.28 23.78±3.56觀察組 60 4.83±1.37 41.22±4.17 t值P值15.67＜0.05 23.32＜0.05

表2 多水平比較口腔癌患者外周血、口腔組織中IL-6、Foxp3的表達(dá)(，μg/L)

表2 多水平比較口腔癌患者外周血、口腔組織中IL-6、Foxp3的表達(dá)(，μg/L)

因素 n 外周血口腔組織(n)IL-6 P值 Foxp3 P值IL-6表達(dá) P值 Foxp3表達(dá) P值性別 男 33 4.79±1.32 0.871 40.37±3.98 0.103 17 0.262 17 0.755 27 4.85±1.53 42.13±4.23 10 15吸煙史 有 38 4.85±1.42 0.635 41.89±4.27 0.412 19 0.306 19 0.496無 22 4.67±1.38 40.97±3.94 8 13 TNM 分期 Ⅰ/Ⅱ 39 4.52±1.51 0.032 39.26±3.86 0.001 12 0.003 17 0.039Ⅲ/Ⅳ 21 5.37±1.27 43.17±4.31 15 15女

2.3 口腔癌患者外周血中IL-6與Foxp3的相關(guān)性口腔癌患者外周血中IL-6表達(dá)平均水平為(4.83±1.37)μg/L，F(xiàn)oxp3表達(dá)平均水平為(41.22±4.17)μg/L，兩者表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.40，P＜0.05)，見圖1。

2.4 各組口腔組織中IL-6，F(xiàn)oxp3表達(dá)陽(yáng)性率比較IL-6陽(yáng)性表達(dá)率兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);Foxp3在兩組中表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見表 3、圖 2。

圖1 口腔癌患者中IL-6與Foxp3呈正相關(guān)

表3 兩組口腔組織中IL-6，F(xiàn)oxp3表達(dá)陽(yáng)性率比較〔n(%)〕

圖2 兩組口腔組織中IL-6、Foxp3免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(DAB，400×)

2.5 多水平檢測(cè)口腔癌患者癌組織中IL-6，F(xiàn)oxp3的表達(dá) 在口腔癌患者組織中IL-6、Foxp3陽(yáng)性表達(dá)率在男性和女性患者中、有吸煙和無吸煙的患者中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);不同TNM分期階段，IL-6、Foxp3的陽(yáng)性表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表2。

2.6 口腔癌患者癌組織中IL-6與Foxp3的相關(guān)性IL-6與Foxp3陽(yáng)性表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.38，P＜0.05)。

3 討論

口腔鱗狀細(xì)胞癌是最常見的口腔惡性腫瘤，其惡性程度高、進(jìn)展快、預(yù)后效果較差，易侵犯周圍鄰近組織，且淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率較高，預(yù)后較差〔6，7〕。由于早期癥狀不很明顯，導(dǎo)致許多患者在就診時(shí)已經(jīng)處于中晚期，并且發(fā)病也主要發(fā)生于40歲以上的中老年人〔7〕。老年口腔癌患者其主要表現(xiàn)在諸多老年患者飲酒、吸煙等不良口腔生活習(xí)慣較久，暴露于煙草、酒精等其他危險(xiǎn)因素的時(shí)間也較長(zhǎng)，與年輕口腔癌患者相比其發(fā)病因素也更復(fù)雜〔3，4〕。研究指出，對(duì)口腔癌患者進(jìn)行早診斷早治療，可有效改善其預(yù)后〔7〕。在癌癥中尋找相關(guān)特異性的蛋白標(biāo)志物及相關(guān)生化指標(biāo)，尤其在口腔癌患者組織或血清中尋求腫瘤標(biāo)志物對(duì)口腔癌的早診斷治療及對(duì)患者預(yù)后具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值〔8～10〕。

IL-6是一種多功能細(xì)胞因子，在機(jī)體參與腫瘤免疫過程中具有影響腫瘤細(xì)胞增殖、分化的作用〔11〕。研究發(fā)現(xiàn)，膽管癌患者血清IL-6水平顯著增高，且與患者預(yù)后具有相關(guān)性，提示IL-6水平異?；蛟S會(huì)引起膽管上皮的增殖改變，從而誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生和發(fā)展〔8〕。Wei等〔9〕發(fā)現(xiàn)宮頸癌組織中 IL-6的表達(dá)明顯增高，提示腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的IL-6可能作用于宿主并參與腫瘤血管的形成，改變組織局部的免疫機(jī)制，引發(fā)腫瘤細(xì)胞進(jìn)一步增殖、分化〔9〕。本研究與先前國(guó)外學(xué)者研究結(jié)果一致，暗示著口腔癌組織中合成分泌IL-6的能力增強(qiáng)與口腔癌的發(fā)生密切相關(guān)〔10〕。

Foxp3在Treg細(xì)胞的發(fā)育及調(diào)控中起重要作用，F(xiàn)oxp3分子通過發(fā)揮強(qiáng)烈的抑制抗腫瘤免疫功能，從而導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸的發(fā)生，視為判斷腫瘤患者生存期和預(yù)后的一個(gè)重要指標(biāo)〔12～14〕。研究表明，F(xiàn)oxp3基因沉默的細(xì)胞株具有顯著減弱 T細(xì)胞增殖的抑制作用，提示Foxp3可通過某種作用機(jī)制來影響效應(yīng)性T細(xì)胞免疫功能〔12〕;研究還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxp3基因表達(dá)具有明顯降低沉默癌細(xì)胞中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、IL-10表達(dá)，表明腫瘤細(xì)胞中 Foxp3可能通過影響VEGF及IL-10的表達(dá)，參與血管形成及免疫抑制來促進(jìn)腫瘤發(fā)生與發(fā)展〔15〕。B細(xì)胞經(jīng)由Th2細(xì)胞產(chǎn)生的IL-6促進(jìn)分化分泌免疫球蛋白(Ig)A，從而顯著影響T細(xì)胞增殖與分化〔12〕。在腫瘤微環(huán)境下，異常表達(dá)的IL-6導(dǎo)致體液免疫調(diào)節(jié)紊亂，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)異常〔11〕。細(xì)胞毒性T細(xì)胞的終末因子IL-6會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致T細(xì)胞的增殖與分化發(fā)生異常，從而加重對(duì)機(jī)體的毒性〔14，15〕。腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生IL-6引發(fā)口腔黏膜局部周圍組織結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞甚至重構(gòu)，促進(jìn)Foxp3的表達(dá)，抑制體內(nèi)T細(xì)胞免疫功能的發(fā)揮，從而導(dǎo)致腫瘤進(jìn)一步發(fā)展。