環(huán)境中氨基脲的高通量酶聯(lián)免疫法檢測(cè)

朱暖飛， 董帥兵， 張 禎

(江蘇大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013)

硝基呋喃類藥物是一類廣譜抗生素，由于其對(duì)大多數(shù)革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌、真菌、原蟲等病原體都有強(qiáng)烈的殺滅作用[1-4]，被廣泛應(yīng)用于畜禽及水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)[2，5-9]。常見的硝基呋喃類藥物有呋喃西林、呋喃唑酮等，其結(jié)構(gòu)式如圖1所示。然而，研究表明，這種藥物及其代謝物是一類具有潛在的致癌、致畸和致突變的物質(zhì)[4，10-13]。目前我國(guó)已將呋喃西林等列為禁用藥，禁止在食品工業(yè)中使用該類藥物，并將其列入首批《獸藥地方標(biāo)準(zhǔn)廢止目錄》中。但由于此類藥物價(jià)格低廉、治療效果佳，非法使用仍然存在。

硝基呋喃類藥物在動(dòng)物體內(nèi)的代謝非常迅速，半衰期短，因此這類藥物不易被檢測(cè)，但由于此類物質(zhì)的代謝產(chǎn)物容易和生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)結(jié)合，形成穩(wěn)定的化合物殘留在動(dòng)物體或人體當(dāng)中[10，14-17]，因此，通常通過對(duì)硝基呋喃類抗生素的代謝物的研究來推斷硝基呋喃類物質(zhì)的殘留情況。氨基脲(SEM)是呋喃西林的特征性代謝產(chǎn)物，以SEM作為標(biāo)示物可以檢測(cè)呋喃西林的殘留[18-19]。考慮到呋喃西林大量使用，可能導(dǎo)致SEM在環(huán)境中的廣泛存在。所以，建立簡(jiǎn)單、靈敏、可靠的分析方法，不但可以調(diào)查環(huán)境中SEM的殘留現(xiàn)狀，進(jìn)而評(píng)估其生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)，而且有助于推斷畜禽及水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中呋喃西林的使用狀況。目前對(duì)于SEM的檢測(cè)方法主要集中于儀器分析方法，如氣相色譜-質(zhì)譜法、LC-MS/MS等[2-4，20-26]，雖然這些方法靈敏度高、準(zhǔn)確性好，但是由于存在測(cè)試成本高、分析時(shí)間長(zhǎng)、檢測(cè)所需樣品量大(通常>500 mL)及前處理步驟繁瑣等不足，并不能實(shí)現(xiàn)在較大范圍內(nèi)系統(tǒng)、全面、快速分析樣品中SEM的含量。與此相比，酶聯(lián)免疫法(ELISA)具有操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)成本低、高通量的特點(diǎn)[26-28]，可用于環(huán)境中此種痕量污染物的分析。

因此，本研究利用實(shí)驗(yàn)室所制備的可特異性識(shí)別SEM的單克隆抗體，建立了一種高靈敏度、高通量的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析方法(IC-ELISA)，并以此對(duì)江蘇省鎮(zhèn)江地區(qū)水體與土壤中SEM的污染狀況進(jìn)行了調(diào)查研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氨基脲SEM抗原、抗體由筆者所在課題組制備；氨基脲標(biāo)準(zhǔn)品、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG、3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；吐溫-20(Tween-20)、十二水合磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)、二水磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)、磷酸二氫鉀(KH2PO4)、氯化鈉(NaCl)、氯化鉀(KCl)、碳酸鈉(Na2CO3)、碳酸氫鈉(NaHCO3)、濃硫酸(H2SO4)明膠等購(gòu)自阿拉丁化學(xué)試劑有限公司，且均為分析純；96孔酶標(biāo)板購(gòu)自丹麥NUNC公司。

碳酸鹽包被緩沖液(CBS)為0.05 mol/L碳酸氫鈉和碳酸鈉溶液，pH值為9.6；封閉液為含1%明膠的CBS緩沖液；洗滌液為含體積分?jǐn)?shù)0.05% Tween-20的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液，pH值為7.4；抗體稀釋液為含0.01% Tween-20、0.1%明膠的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液，pH值為7.4；顯色液為500 μL 3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺溶液、10 mL檸檬酸鈉緩沖液、32 μL 0.75%過氧化氫，用時(shí)混合；終止液為2 mol/L硫酸溶液。

1.2 儀器設(shè)備

電子分析天平、恒溫培養(yǎng)箱、多功能酶標(biāo)儀分別購(gòu)自重慶CoiC公司、上海精密試驗(yàn)設(shè)備有限公司和瑞士Tecan公司。

1.3 間接酶聯(lián)免疫分析法試驗(yàn)條件的優(yōu)化

根據(jù)棋盤滴定法測(cè)定原則，選取吸光度D值為1且斜率最大的抗原、抗體濃度組合為本試驗(yàn)中抗原最佳包被濃度、抗體最佳稀釋濃度，同時(shí)，為了使該方法的檢測(cè)效果達(dá)到最佳，對(duì)反應(yīng)體系甲醇含量、離子強(qiáng)度、pH值3個(gè)影響因素進(jìn)行篩選優(yōu)化。

1.4 間接酶聯(lián)免疫分析法的建立

在最優(yōu)試驗(yàn)條件下建立方法，具體操作步驟如下：

(1)包被：用包被液稀釋SEM包被原加至96孔酶標(biāo)板中，100 μL/孔，4 ℃ 12～16 h或37 ℃ 2 h孵育。(2)洗滌：傾去孔內(nèi)多余液體，用新配制的洗滌液洗滌5遍，200 μL/孔，在吸水紙上將板拍干。(3)封閉：150 μL/孔加入封閉液，37 ℃孵育45 min。(4)洗滌：傾去孔內(nèi)液體，用新配制的洗滌液洗滌3遍，200 μL/孔，在吸水紙上拍干。(5)競(jìng)爭(zhēng)：加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品或樣品和抗體，各50 μL/孔，37 ℃孵育30 min。(6)洗滌：傾去孔內(nèi)液體，用新配制的洗滌液洗滌5遍，200 μL/孔，在吸水紙上拍干。(7)加入酶標(biāo)二抗：加入辣根過氧化物酶-羊抗鼠IgG 100 μL/孔，37 ℃孵育30 min。(8)洗滌：傾去孔內(nèi)液體，用新配制的洗滌液洗滌，200 μL/孔，共洗5遍，在吸水紙上拍干。(9)顯色：加入新鮮配制的TMB底物溶液，100 μL/孔，避光顯色5 min。(10)終止：加入終止液，50 μL/孔。(11)測(cè)定：使用多功能酶標(biāo)儀讀取各孔 450 nm 下的吸光度。

1.5 空白加標(biāo)和樣品加標(biāo)試驗(yàn)

1.5.1 樣品前處理 水樣處理：取10 mL水樣，抽濾，向其中加入8 mL正己烷，恒溫振蕩6 h，離心2 min，取上清，氮吹至近干，用2 mL甲醇復(fù)溶。

土壤樣品處理：取5 g土壤樣品，烘干至恒質(zhì)量，向其中加入10 mL正己烷，恒溫振蕩12 h，高速離心5 min，取上清，氮吹至近干，用2 mL甲醇復(fù)溶。

1.5.2 加標(biāo)試驗(yàn) 空白加標(biāo)試驗(yàn)：取一定量的蒸餾水或自來水或空白土壤，向其中添加線性范圍內(nèi)低、中、高3個(gè)濃度的SEM標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)水平設(shè)置3個(gè)平行重復(fù)孔，根據(jù)“1.4”節(jié)中建立的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法進(jìn)行測(cè)定。將測(cè)定結(jié)果代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算濃度，并根據(jù)公式(1)計(jì)算添加回收率。

空白回收率=測(cè)定量(μg/L)/加標(biāo)量(μg/L)×100%。

(1)

樣品加標(biāo)試驗(yàn)：取相同的樣品2份，其中1份加入定量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；將2份樣品按相同的分析步驟進(jìn)行分析。將測(cè)定結(jié)果代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算濃度，并根據(jù)公式(2)計(jì)算添加回收率。

樣品回收率=[測(cè)定量(μg/L)-樣品量(μg/L)]/加標(biāo)量(μg/L)×100%。

(2)

1.6 樣品測(cè)定

根據(jù)“1.5.1”節(jié)進(jìn)行樣品前處理，根據(jù)“1.4”節(jié)中建立的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法進(jìn)行樣品測(cè)定，最后將測(cè)定結(jié)果代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)條件的優(yōu)化

ELISA是一種經(jīng)典的分析方法，其靈敏度由多種因素決定。優(yōu)化反應(yīng)條件和體系各種參數(shù)對(duì)于靈敏度的提高極其必要。本研究對(duì)體系甲醇含量、pH值和離子濃度3個(gè)方面進(jìn)行了優(yōu)化，并以IC50值和Dmax/IC50作為優(yōu)化結(jié)果的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。

從圖2-A可以看出，反應(yīng)體系加入甲醇后，該方法的IC50值迅速上升，這意味著甲醇的加入損壞了方法的靈敏度，因此本檢測(cè)體系剔除了甲醇。同樣，當(dāng)體系中緩沖液的pH值為7、Na+濃度為0.3 mol/L時(shí)，該方法的IC50值和Dmax/IC50達(dá)到最佳值(圖2-B、圖2-C)。基于此，建立該方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3)，其線性范圍為0.179～8.627 μg/L，IC50值為 0.967 μg/L，檢測(cè)限可達(dá)到0.059 μg/L。

2.2 加標(biāo)回收試驗(yàn)

為了驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性，本研究進(jìn)行了加標(biāo)回收試驗(yàn)(表1、表2)，空白加標(biāo)回收率在81.9%～105.6%之間，變異系數(shù)均小于5%；樣品加標(biāo)回收率在83.0%～104.0%，變異系數(shù)均小于5%，證明該方法具有良好的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確度，符合檢測(cè)要求，可用于實(shí)際樣品的分析。

2.3 鎮(zhèn)江地區(qū)水體及土壤樣本的測(cè)定

硝基呋喃類藥物經(jīng)生物體代謝后，一部分與生物體中的蛋白質(zhì)結(jié)合，穩(wěn)定存在于動(dòng)物機(jī)體內(nèi)，另一部分則被排泄到體外，進(jìn)入環(huán)境中[29-30]，SEM結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，進(jìn)入到環(huán)境中不易降解且有較強(qiáng)的生物富集性，其蓄積效應(yīng)會(huì)對(duì)水生生態(tài)系統(tǒng)高營(yíng)養(yǎng)級(jí)生物產(chǎn)生毒性和危害[29]。

表2的分析結(jié)果可以看出，在鎮(zhèn)江地區(qū)的2條主要支流——玉帶河與團(tuán)結(jié)河均檢出了SEM的殘留，濃度分別為 0.431 μg/L 和1.325 μg/L，團(tuán)結(jié)河附近土壤的含量為 0.205 ng/g。2處河流周圍均無畜禽及水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)，其來源可能是該物質(zhì)通過食物鏈進(jìn)入人體，隨著生活污水等方式釋放到環(huán)境中。濃度為μg/L級(jí)的SEM持續(xù)暴露可嚴(yán)重?fù)p害水生系統(tǒng)中的敏感菌，嚴(yán)重影響水生系統(tǒng)的平衡。SEM對(duì)環(huán)境的負(fù)作用是慢性、長(zhǎng)期和累積性的，它們可以通過生物累積和食物鏈的傳遞而最終導(dǎo)致對(duì)高等動(dòng)植物和人類的危害。同時(shí)，從環(huán)境水體與土壤中殘留量的結(jié)果可以看出，目前仍有一定量的硝基呋喃類抗生素的非法使用。

表1 IC-ELISA空白加標(biāo)回收試驗(yàn)

注：ND表示未檢出。下表同。

表2 IC-ELISA樣品測(cè)定和樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)

3 結(jié)論

本研究建立了一種高靈敏、高通量快速檢測(cè)環(huán)境中SEM的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析方法(IC-ELISA)，方法的線性檢測(cè)范圍為0.179～8.627 μg/L，檢測(cè)限可達(dá)0.059 μg/L。該方法具有良好的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性。利用此方法對(duì)鎮(zhèn)江地區(qū)環(huán)境水體與土壤中SEM的殘留狀況進(jìn)行調(diào)查研究，在部分河流與土壤中檢出了此種污染物。相關(guān)結(jié)果將為研究環(huán)境中SEM的污染狀況和生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供技術(shù)支撐。