中國四川省峨眉山特有小鯢類（兩棲綱，有尾目）龍洞山溪鯢（Batrachuperus londongensis Liu and Tian, 1978）正模標本骨骼μCT三維數(shù)據(jù)集

賈佳 ，張美華，高克勤，江建平

1.北京大學(xué)地球與空間科學(xué)學(xué)院，北京 100871

2.中國科學(xué)院資源地層學(xué)與古地理學(xué)重點實驗室，中國科學(xué)院南京地質(zhì)古生物研究所，南京 210008

3.中國科學(xué)院成都生物研究所，成都 610041

數(shù)據(jù)庫（集）基本信息簡介

數(shù)據(jù)庫（集）名稱 中國四川省龍洞山溪鯢正模標本（CIB 14380）高精度μCT掃描源數(shù)據(jù)集數(shù)據(jù)作者 賈佳、張美華、高克勤、江建平數(shù)據(jù)通信作者 賈佳（jia_jia@pku.edu.cn）標本采集時間 龍洞山溪鯢的正模標本采集于1965年3月23日地理區(qū)域 龍洞山溪鯢的正模標本發(fā)現(xiàn)于中國四川省峨眉山龍洞河，地理坐標為北緯29°34′42.85″，東經(jīng)103°17′5.61″，海拔1300米。

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引 言

蠑螈類又稱有尾兩棲類，是一類四肢與尾巴正常發(fā)育的中小型滑體兩棲動物。作為現(xiàn)存最為原始的四足動物，蠑螈類與其他滑體兩棲動物（蛙類與蟾蜍、蚓螈類）相比在形態(tài)上與已經(jīng)絕滅的原始兩棲動物更為相似，因此對了解脊椎動物由水生環(huán)境向陸地環(huán)境的過渡、四足動物的早期演化和滑體兩棲動物的起源具有重要的研究意義[1]。

小鯢科（Hynobiidae）是一類小型蠑螈（體長約70～260毫米）[2]，包括9～11屬，67～68個現(xiàn)存物種，主要分布在東亞地區(qū)，僅有個別屬種分布在中亞（副趾鯢屬Paradactylodon）和歐洲東部的俄羅斯境內(nèi)（極北鯢屬Salamandrella）[3-4]。該科成員的幼年個體生活在水中，具有外鰓和尾鰭；成年個體通常經(jīng)過變態(tài)發(fā)育之后，外鰓和尾鰭通常消失，可生活在水中或陸地上。唯一的特例是龍洞山溪鯢：它們的某些個體不經(jīng)過變態(tài)發(fā)育，卻成為了保留幼體特征（如鰓裂）并終生生活在水中的童體類型[2]。小鯢科因其具有多個原始特征，如體外受精、較高的染色體數(shù)目（40個以上）、具有小染色體、脊神經(jīng)由椎體之間穿過（第一條脊神經(jīng)除外）、下頜中隅骨不與前關(guān)節(jié)骨愈合等，被廣泛認為是現(xiàn)存蠑螈類中的一個原始類群[5-7]，對蠑螈類的起源研究至關(guān)重要。

然而，前人對小鯢科的起源時間和地點[8-12]、某些特征的演化歷史[13-14]和內(nèi)部譜系分支關(guān)系[11,15-17]存在較大分歧。小鯢科曾一度被認為是一個并系類群（paraphyletic group[18]）或復(fù)系類群（polyphyletic group[14]）；而它的單系性，即包括同一共同祖先演化而來的所有后裔的演化分支，直到最近才得到分支系統(tǒng)學(xué)研究的支持（參見[11,15]）。造成以上爭議的原因可分為以下四點：第一，該科化石記錄稀缺。目前僅發(fā)現(xiàn)5個新生代（6600萬年至今）化石屬種，而且它們多保存為零散的脊椎和肢骨，鮮有可靠的形態(tài)特征信息[12]。近年來，中國遼西、冀北和內(nèi)蒙古東部地區(qū)中侏羅世到早白堊世（距今1.25～1.65億年前）地層中產(chǎn)出了6個在形態(tài)特征上與現(xiàn)存小鯢類極為相似的化石屬種，即東方塘螈（Laccotritonorientalis）、鳳山中華螈（Sinerpetonfengshanensis）、鐘健遼西螈（Liaoxitritonzhongjiani）、道虎溝遼西螈（Liaoxitritondaohugouensis）、圍場皇家螈（Regalerpetonweichangensis）和北方諾敏螈（Nuominerpetonaquilonaris）[19-20]。這些化石保存完整，為探討小鯢科的起源提供了珍貴材料，然而它們與現(xiàn)存小鯢類的分支關(guān)系并不明確（見下文），僅有鐘健遼西螈和北方諾敏螈被認為是小鯢科的基干屬種[20-22]；第二，對小鯢科的現(xiàn)存屬種，特別是對較為進步的中國特有小鯢類（如山溪鯢類）的骨骼形態(tài)學(xué)研究不足，加重了從充盈原始特征的小鯢類中尋找近裔共性（synapomorphy）的難度。第三，基于分子數(shù)據(jù)對該科的分支分析結(jié)果不一致。隨著基因測序技術(shù)的突飛猛進，現(xiàn)存小鯢類的分子數(shù)據(jù)正以愈加低廉的成本快速地積聚。獨立演化的基因位點為探討小鯢類的分支關(guān)系提供了大量有效信息。但是前人根據(jù)線粒體DNA[11,23]、細胞核DNA[17]以及結(jié)合二者[15-16,24-25]所得出的分支分析結(jié)果依然存在差別，不能提供一致的小鯢科內(nèi)部支系演化關(guān)系。第四，目前還沒有基于形態(tài)特征數(shù)據(jù)對小鯢科進行分支分析的研究。前人曾對小鯢科具有演化和分類意義的形態(tài)特征有過總結(jié)[10,26-27]，然而卻并未嚴格地按照分支分析理論[28]進行研究，而且所得結(jié)果與基于分子數(shù)據(jù)得到的分支分析結(jié)果差異懸殊。

如上所述，盡管分子數(shù)據(jù)以其驟增的體量占較大優(yōu)勢，現(xiàn)生小鯢科成員的形態(tài)特征依然是研究小鯢類支系演化相關(guān)問題不可或缺的組成部分。另一方面，大部分小鯢類化石僅保存了骨骼信息，只有少數(shù)情況下較好地保存了軟體信息。因此形態(tài)特征，尤其是骨骼形態(tài)特征，是唯一能夠鏈接化石與現(xiàn)存屬種的橋梁，對探討化石屬種與現(xiàn)存小鯢類支系演化關(guān)系至關(guān)重要。此前，對現(xiàn)存小鯢類的形態(tài)特征研究主要依靠雙染色法（參見[29-31]）。該方法通過使用染色試劑將硬骨和軟骨分別染成紅色和藍色，因而能夠很好地呈現(xiàn)出骨骼（軟骨和硬骨）的輪廓[32]，不足之處在于無法獲取標本內(nèi)部的三維結(jié)構(gòu)信息，而且對標本造成了不可逆的損壞。高精度計算機斷層掃描（high-resolution X-ray tomography, 或μCT掃描）是利用高能X光射線掃描標本并在短時間內(nèi)獲取標本三維結(jié)構(gòu)的技術(shù)。該技術(shù)可以完好無損地獲取重要標本的骨骼虛擬信息，方便研究人員的觀察。

針對上述問題，本文選取棲息于中國四川省峨眉山龍洞河地區(qū)的龍洞山溪鯢（Batrachuperuslondongensis）為研究對象，對其正模標本（CIB 14380）進行了μCT掃描。這是μCT掃描技術(shù)在中國現(xiàn)存小鯢類骨骼研究中的首次應(yīng)用，也是我們利用μCT掃描技術(shù)實現(xiàn)對現(xiàn)存小鯢類骨骼系統(tǒng)研究的一系列結(jié)果之一[33]。如前所述，龍洞山溪鯢同時具有變態(tài)發(fā)育和兼性童體型現(xiàn)象，在發(fā)育方式上有別于其他所有現(xiàn)存小鯢類。然而，該屬種從被正式確立[34]至今已有40年，此前卻并未有針對其骨骼系統(tǒng)的詳細研究。μCT掃描揭示出龍洞山溪鯢在頭骨、舌器和肢骨上存在多個特殊的骨骼形態(tài)特征（見2數(shù)據(jù)樣本描述）。

本數(shù)據(jù)集提供了龍洞山溪鯢正模標本（CIB 14380）的μCT掃描原始數(shù)據(jù)、三維重建圖片和視頻、頭部的3D pdf文件和可用于3D打印的stl文件。以上原始數(shù)據(jù)的共享旨在為相關(guān)科研工作者提供可用于對比研究的龍洞山溪鯢的原始資料，同時也為公眾了解龍洞山溪鯢的骨骼信息提供了渠道。

1 數(shù)據(jù)采集和處理方法

1.1 標本與數(shù)據(jù)采集

1.1.1 標本采集

龍洞山溪鯢的正模標本于1965年3月23日由劉承釗等人采集。采集地點位于四川省樂山市峨眉山零公里附近龍洞河（N29°34′42.85″、E103°17′5.61″），海拔 1300 米。此后該標本浸泡在福爾馬林溶液中，并保存在成都生物研究所兩棲爬行動物標本館模式標本室，野外編號為CIB 65I0013，正式館藏編號為CIB 14380。該標本為一雄性成年個體，全長265毫米，吻臀距（吻端至肛孔后緣的長度）129毫米，頭長（吻端至枕髁后緣之間的長度）27.5毫米，頭寬（頭部兩側(cè)的最大距離）23.8毫米。頭部后外側(cè)保留鰓裂，屬于童體型個體。我們將該標本從福爾馬林溶液中取出，使用佳能（Canon EOS 5D）單反相機對其進行照相（見圖 1）。

1.1.2 μCT數(shù)據(jù)采集

龍洞山溪鯢正模標本的 μCT掃描工作依托成都生物研究所的掃描儀 Quantum GX microCT Imaging System（PerkinElmer?，Massachusetts，USA）進行。

把拍照之后的正模標本移入密封袋，小心將其盡量縷直并卷成長條狀。將標本固定在掃描儀的小動物床（Small Bed）上，并保持標本的長軸與動物床的長軸平行。設(shè)置電壓為50千伏，電流為60毫安，通過調(diào)整掃描視域（Field of View）下的采集（Acquisition）和重建（Reconstruction）兩個參數(shù)，使標本盡可能充滿掃描區(qū)域。在預(yù)覽（Live）模式下，通過調(diào)整 X光射線源的旋轉(zhuǎn)角度（Rotation Control）來確保所掃描的結(jié)構(gòu)在任意角度均處于掃描范圍之內(nèi)。之后，選擇高精度掃描模式（High Resolution）下的57分鐘檔位對標本的每一段進行掃描。由于龍洞山溪鯢的正模標本較長，為了獲取較高的分辨率，需要分段對其進行掃描（圖 1）：通過調(diào)整動物床的位置將標本沿其長軸進行水平移動，待移動到下一段后，重復(fù)上述設(shè)置對其進行高精度掃描。移動過程中，確保相鄰兩段掃描存在一定重疊區(qū)域，以便后續(xù)的圖像拼接。

圖1 龍洞山溪鯢正模標本CIB 14380照片及μCT分段掃描設(shè)計方案

結(jié)束每段掃描后，掃描儀生成10.3 GB的原始數(shù)據(jù)，包括803張raw格式的文件。通過掃描儀配套軟件（Quantum GX microCT software）將每一段掃描之后的原始數(shù)據(jù)導(dǎo)出成橫切標本長軸的512張16位tiff格式圖片，總大小為256 MB，即本數(shù)據(jù)集第一部分數(shù)據(jù)的以下8個文件：skull90um.zip，forelimb120um.zip，trunk120um.zip，hindlimb144um.zip，tail_1_120um.zip，tail_2_120um.zip，tail_3_120um.zip 和 tail_4_120um.zip。

值得注意的是，該掃描儀（Quantum GX microCT Imaging System）與其他常用掃描儀（如GE Phoenix v|tome|x s Industrial High-Resolution CT & X-Ray System或Nikon XT H系列等）相比具有兩處不同：首先，該掃描儀在運行過程中標本保持靜止，而X光射線源和X光感受器圍繞標本旋轉(zhuǎn)360度；這與其他掃描儀的掃描過程恰好相反。其次，該掃描儀具有分體積重建功能（Subvolume Reconstruction），可以在原始掃描數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)之上通過人為選擇感興趣區(qū)（Region of Interest），并將所選區(qū)域進行插值法運算，從而提高該區(qū)域的分辨率（Voxel Size）。本文對龍洞山溪鯢正模標本的頭骨，即第一段的原始掃描數(shù)據(jù)（文件skull90um.zip）進行了分體積重建，其分辨率由原來的90 μm提升至67.1 μm，即本數(shù)據(jù)集第一部分數(shù)據(jù)的第9個文件，skull67_1um.zip。

1.2 數(shù)據(jù)預(yù)處理

對正模標本進行的圖像拼接（Merge）、圖像分割（Segmentation）、三維重建（3D Reconstruction）、圖像和視頻生成和 stl文件導(dǎo)出均利用軟件 VG Studio Max 2.2（Volume Graphics, Heidelberg, Germany）進行。

第一步圖像拼接。首先將每一段掃描生成的512張tiff格式圖像堆棧分別導(dǎo)入軟件VG Studio Max 2.2中，并分別保存為單獨的vgl格式文件。打開VG Studio Max軟件的一個空白文件，使用該軟件的拼接功能（Merge）將以上vgl格式文件依次導(dǎo)入。按照龍洞山溪鯢的解剖結(jié)構(gòu)，并結(jié)合掃描時相鄰兩段之間的重疊區(qū)域?qū)⑺衯gl文件拼接起來，最終得到完整的骨骼虛擬模型。

第二步圖像分割和三維重建。以龍洞山溪鯢的頭骨為例，在VG Studio Max 軟件的二維窗口中，將頭骨的每一塊骨骼單獨建立感興趣區(qū)，并將每一塊骨骼在所有截面中的輪廓畫入相應(yīng)的感興趣區(qū)。對感興趣區(qū)進行平滑（Smooth）或修正（Refine）處理，將感興趣區(qū)提取（Extract ROI）、渲染（Render）便得到相應(yīng)頭骨骨骼的三維結(jié)構(gòu)模型（圖2）。

圖2 龍洞山溪鯢正模標本CIB 14380頭部骨骼三維重建圖

第三步圖像、視頻和stl文件制作。仍以頭骨為例，在VG Studio Max軟件的三維窗口中，將渲染后的頭骨放大并旋轉(zhuǎn)到相應(yīng)角度（如頂視、腹視、側(cè)視等），選擇文件選項卡并保存圖像（文件pics.zip）。同樣地，在三維窗口中，通過軟件自帶的關(guān)鍵幀（Keyframer mode）功能，將頭骨保存為沿某一軸向旋轉(zhuǎn)的視頻文件（文件videos.zip）。將每一個提取出來的文件進行表面測定（Surface Determination），進而導(dǎo)出stl文件（pdf_stl.zip）。

2 數(shù)據(jù)樣本描述

2.1 數(shù)據(jù)集文件命名格式

龍洞山溪鯢正模標本（CIB 14380）高精度μCT掃描源數(shù)據(jù)集的命名規(guī)則如下：

（1）該數(shù)據(jù)集第一部分包括 9個文件。以第一個文件 skull90um.zip和第五個文件tail_1_120um為例，它們的命名規(guī)則如下：skull表明該文件包括了對頭部的高精度掃描，90um代表該段的掃描分辨率為 90 μm。tail_1表明該文件包括了對尾部第一段的高精度掃描，120um代表該段的掃描分辨率為120 μm。每個文件夾下包括一個xml參數(shù)文本文件和512個tiff格式文件。所有tiff格式文件均分別添加了連續(xù)的后綴p001-p512。讀者利用三維軟件（如VG Studio Max等）導(dǎo)入以上tiff文件時，務(wù)必按順序連續(xù)讀取，以確保骨骼結(jié)構(gòu)的完整性。

（2）該數(shù)據(jù)集第二部分包括三個文件，分別為pics.zip，videos.zip和pdf_stl.zip，包括了三維重建的圖像、視頻以及3D pdf和stl文件。讀者可用任意版本的Adobe Reader軟件打開3D pdf，激活內(nèi)容并查看龍洞山溪鯢的頭部骨骼。如果需要制成實體模型，可將stl文件進一步處理，并利用3D打印機按照同一比例打印即可。

2.2 數(shù)據(jù)樣本

龍洞山溪鯢的系統(tǒng)分類信息如下：

兩棲綱 Amphibia Linnaeus, 1758

滑體兩棲亞綱 Lissamphibia Haeckel, 1866

有尾超目 Caudata Scopoli, 1777

有尾目 Urodela Duméril, 1806

隱鰓鯢亞目 Cryptobranchoidea Dunn, 1922

小鯢科 Hynobiidae, 1859

龍洞山溪鯢Batrachuperus londongensisLiu and Tian, 1978

龍洞山溪鯢是小鯢科中較為獨特的一種，因其既有完全變態(tài)發(fā)育的成體也有保留鰓裂等幼體特征的童體類型。正模標本（CIB 14380）具有鰓裂，屬于童體類型。μCT掃描揭示出正模標本的舌器骨化程度較高，包括成對的第一下鰓骨（hypobranchial I）、第二下鰓骨（hypobranchial II）、第一到第四角鰓骨（ceratobranchial I–IV）、角舌骨（ceratohyal）和第二基鰓骨（basibranchial II）（圖2）。與龍洞山溪鯢的變態(tài)發(fā)育個體和其他小鯢類中通常僅有第二下鰓骨和第二角鰓骨骨化的情況相比，骨化程度顯然更高[33-34]。

圖3展示了正模標本的整體骨骼結(jié)構(gòu)?？梢钥闯觯埗瓷较F正模標本具有17枚薦前椎，而且前肢的腕骨（carpal，紅色）和后肢的跗骨（tarsal，藍色）骨化較高，與其他童體型蠑螈類（如鰻螈、兩棲螈科等）腕、跗骨通常為軟骨的情況形成鮮明對比。

圖3 龍洞山溪鯢正模標本CIB 14380整體骨骼三維重建圖

3 數(shù)據(jù)質(zhì)量控制和評估

本數(shù)據(jù)集包括利用高精度μCT掃描獲取龍洞山溪鯢正模標本的所有原始文件和參數(shù)。讀者可利用常用的三維軟件（Amira、Dragonfly、ImageJ、Mimics、VG Studio等）按照參數(shù)文本中的分辨率讀取。

μCT掃描所得的骨骼分辨率受以下兩方面因素的影響：第一，掃描儀 Quantum GX microCT Imaging System所得到的分辨率取決于掃描視域（Field of View）的大小，而后者受限于采集（Acquisition）和重建（Reconstruction）兩個參數(shù)的設(shè)定（表1）。其中，采集有36和72兩個數(shù)值選項（無單位），相應(yīng)的重建有36、25、10、5和72、60、45幾個固定值（無單位）。

表1 Quantum GX高精度掃描系統(tǒng)小動物床的視域與分辨率大小對照表

第二，正模標本的不同部位由于寬度不同導(dǎo)致分辨率不同。該標本浸泡于福爾馬林溶液中已有50余年，其肌肉和軟體組織僵化，使得標本早已形成固定姿勢。后肢部分由于向兩側(cè)伸展，只能在最大視域范圍內(nèi)，即采集和重建參數(shù)均為72的情況下進行掃描，因此所得分辨率（144 μm）最低。盡管如此，該標本每一段的骨骼結(jié)構(gòu)在任意掃描截面上的輪廓均清晰可辨（圖4）。

圖4 龍洞山溪鯢正模標本CIB 14380分段掃描截面示意圖

4 數(shù)據(jù)價值

本數(shù)據(jù)集共享了中國四川省峨眉山地區(qū)特有小鯢類蠑螈龍洞山溪鯢的正模標本（CIB 14380）高精度μCT骨骼數(shù)據(jù)，這是目前μCT掃描技術(shù)在我國現(xiàn)存小鯢科蠑螈類骨骼研究中的首次應(yīng)用。本數(shù)據(jù)集所包含的數(shù)據(jù)便于處理，為相關(guān)科研人員提供了可供對比參照的原始數(shù)據(jù)。我們注意到國外類似共享掃描數(shù)據(jù)集的網(wǎng)站如 DigiMorph等已提供了蠑螈類部分屬種的掃描數(shù)據(jù)，但是缺少中國特有屬種的信息。龍洞山溪鯢骨骼數(shù)據(jù)的共享為我國建立相關(guān)的數(shù)據(jù)網(wǎng)站提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)材料，對我國小鯢科蠑螈類的形態(tài)演化研究具有重要價值。