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    miRNA對Fontan術(shù)后血小板活化程度及血栓形成影響的精確預(yù)測價值

    2018-11-16 03:47:10
    精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)雜志 2018年5期
    關(guān)鍵詞:病兒白細(xì)胞內(nèi)皮

    (上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院,上海 200092 1 附屬新華醫(yī)院兒心血管科; 2 附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心心臟中心)

    臨床一些復(fù)雜性先天性心臟病,如三尖瓣閉鎖、單心室、肺動脈閉鎖伴室間隔完整等病兒多數(shù)需行Fontan手術(shù)以降低死亡率。Fontan手術(shù)是將上、下腔靜脈直接連接到肺動脈,從而使肺循環(huán)和體循環(huán)分開,該手術(shù)雖然一定程度能夠減輕病兒低氧狀況,但術(shù)后一些常見并發(fā)癥,如心律失常、血栓栓塞、腔靜脈壓力升高及心力衰竭等可能會致病兒死亡[1]。由于腔靜脈血直接回流肺動脈,使肺動脈缺少“脈沖性”血流灌注,可造成術(shù)后肺動脈狹窄、扭曲,肺血栓和肺動脈高壓形成,且隨生存時間延長而日益明顯。多項臨床研究表明,F(xiàn)ontan術(shù)后血栓栓塞是造成病人死亡的重要原因。Fontan術(shù)后血栓形成常見原因有血管內(nèi)皮受損、血管狹窄、凝血功能異常等。臨床研究發(fā)現(xiàn)一些微小核糖核酸(miRNA)與血管內(nèi)皮損傷和血小板活化、血栓形成等有關(guān)。血管內(nèi)皮損傷以后miR-126以及miR-21常升高,而miR-96、miR-340以及miR-223升高則提示血小板活化[2]。本研究主要探討外周血白細(xì)胞、血小板以及血清中miRNA變化能否準(zhǔn)確預(yù)測單心室病兒行Fontan術(shù)后對血小板活化以及血栓形成的影響,旨在為臨床隨訪及抗血栓治療提供參考。

    1 材料和方法

    1.1 實驗對象

    單心室行Fontan術(shù)后病兒6例(TG組),男4例,女2例;年齡2~11歲,平均5.6歲;術(shù)后時間為1~5年。體檢正常的兒童6例(CG組),男3例,女3例;年齡2~12歲,平均6.2歲。試驗前收集血液標(biāo)本均告知家長并簽署知情同意書。

    1.2 主要儀器和試劑

    CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Scientific,Waltham,美國);倒置顯微鏡(Olympus,Tokyo,日本);電泳儀和電轉(zhuǎn)儀(BIO-RAD,Irvine,美國);Real-time檢測儀(天龍,TL988)。Ficoll(GE,17-5442-02,美國);TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit等試劑盒(Takara,日本);Ikkb Antibody等抗體(Affinity,AF6009,美國);RIPA組織細(xì)胞快速裂解液(Solarbio,R0010);BCA蛋白定量試劑盒(Thermos,PICPI23223,美國)等。

    1.3 實驗方法

    1.3.1血清、血小板和白細(xì)胞中miRNA提取 采集病兒靜脈血15 mL,分別用于血清、血小板和白細(xì)胞中miRNA提取。①血清miRNA提?。簩⑵渲械? mL靜脈血置于干管中,30 min內(nèi)高速離心(3 000 r/min離心10 min,后8 000 r/min離心15 min)分離血清。加入QIAzol試劑使血清變性,然后用Qiagen miRNeasy Mini Kit進(jìn)行RNA采集和純化。②血小板miRNA提?。簩⑵渲? mL靜脈血置于抗凝管中,4 ℃靜止過夜收集上清液。采用DEPC水稀釋血清,然后12 000 r/min低溫離心10 min,收集血小板,用于提取miRNA。③白細(xì)胞miRNA提?。簩⑵渲? mL靜脈血以淋巴分離液Ficoll分離出單個核細(xì)胞,用于提取miRNA。

    1.3.2實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測不同標(biāo)本中miRNA的表達(dá) 常規(guī)配置反應(yīng)液,反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件如下:37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s,4 ℃ 5 min。各引物如下:內(nèi)參照U6正義鏈:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,反義鏈:5′-AACGCTTCACGAA-TTTGCGT-3′;miR-223正義鏈:5′-TGCGGCCGTGTATTTGACAA-3′,反義鏈:5′-CCAGTCTCAG-GGTCCGAGGTATTC-3′;miR-150正義鏈:5′-TG-CGGCCGTGTATTTGACAA-3′,反義鏈:5′-TGCG-GCTCTCCCAACCCTTGTA-3′;miR-126正義鏈:5′-TGCGGCCGTGTATTTGACAA-3′,反義鏈:5′-TGCGGCCATTATTACTTTT-3′;miR-21正義鏈:5′-TGCGGCCGTGTATTTGACAA-3′,反義鏈5′-TGCGGCTAGCTTATCAGACT-3′;miR-197正義鏈:5′-TGCGGCCGTGTATTTGACAA-3′,反義鏈:5′-TGCGGCTTCACCACCTTCTCCA-3′。點好樣的PCR板放置于Real time PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng),95 ℃預(yù)變性30 s;然后95 ℃ 5 s、60 ℃ 34 s,共進(jìn)行40個循環(huán);循環(huán)結(jié)束后進(jìn)行熔解曲線分析,通過檢測Ct值,定量分析樣本中miRNA的表達(dá)量。

    1.3.3流式細(xì)胞儀檢測外周血血小板活化水平以抗凝管采集CG和TG組兒童外周靜脈血5 mL,室溫下1 000 r/min離心10 min,上層淡黃色液體即為富血小板血漿(PRP)。緩慢吸出PRP置于新的離心管中,繼續(xù)室溫下4 000 r/min離心10 min后棄去上清液,所剩的部分為血小板沉淀。用含有1 g/L BSA和0.01 mol/L EDTA的PBS(0.01 mol/L)1 mL沖洗血小板沉淀,室溫下離心4 000 r/min離心10 min后再次棄去上清,重復(fù)3次,以此提純血小板沉淀。提純的血小板加入PBS 190 μL,混勻后均分成兩份,分別加入5 μL CD41a-PE抗體和5 μL CD62p-PE抗體,渦旋混勻;4 ℃孵育30 min;加入10倍體積的PBS,洗滌2次,流式細(xì)胞儀分選收集CD41a、CD62p陽性的細(xì)胞。

    1.3.4Western Blot檢測白細(xì)胞內(nèi)抑制miR-223表達(dá)對Iκb和p-p65及NF-κB蛋白的影響 采集TG組和CG組抗凝外周血,將插入miR-223轉(zhuǎn)錄抑制因子的慢病毒轉(zhuǎn)染各組的外周血白細(xì)胞,分為CG+病毒無轉(zhuǎn)錄抑制因子組(CC組),TG+病毒無轉(zhuǎn)錄抑制因子組(TC組),CG+病毒含轉(zhuǎn)錄抑制因子組(CI組)和TG+病毒含轉(zhuǎn)錄抑制因子組(TI組)。觀察當(dāng)miR-223表達(dá)抑制后,對白細(xì)胞NF-κB信號路徑中IKKb、Iκb以及NF-κB表達(dá)的影響。步驟如下。①蛋白收集:經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染72 h后收集各組細(xì)胞,2 000 r/min離心10 min,棄上清液;PBS洗滌;加入RIPA裂解液裂解,離心后取上清液;②Western Blot檢測:將含有蛋白質(zhì)樣品加入緩沖液,進(jìn)行垂直平板凝膠電泳,在電泳結(jié)束前,鋪PVCF膜,放入電轉(zhuǎn)儀中,加入轉(zhuǎn)膜緩沖液,轉(zhuǎn)膜1 h;取膜以后以10 g/L的BSA室溫封閉2 h;然后分別加入TBST稀釋的一抗IKKb(1∶2 000)、Iκb(1∶2 000)、NF-κB(1∶3 000)、p-p65(1∶2 000)以及β-actin(1∶5 000)4 ℃孵育過夜。HRP標(biāo)記的二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h;加入化學(xué)發(fā)光試劑,至出現(xiàn)顯影條帶,取出包好PVDF膜,于暗室中用X膠片感光、顯影、定影,然后用圖像顯影儀進(jìn)行分析,測平均灰度值。

    1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

    2 結(jié) 果

    2.1 兩組miRNA表達(dá)比較

    兩組miR-126、miR-223表達(dá)水平比較,差異有顯著性(t=3.22、3.45,P<0.05)。見表1。

    表1 兩組病人血清中miRNA表達(dá)水平比較(n=6,±s)

    表1 兩組病人血清中miRNA表達(dá)水平比較(n=6,±s)

    分組miR21miR126miR150miR197miR223CG組1.183±0.6181.055±0.3301.107±0.5301.097±0.4371.028±0.245TG組2.028±1.0640.507±0.2560.718±0.4060.727±0.2921.718±0.424

    2.2 兩組血小板活化情況比較

    實驗結(jié)果顯示,CG組CD62p、CD41a表達(dá)率分別為(4.6±1.2)%、(2.6±0.3)%,而TG組血小板中CD62p、CD41a的表達(dá)率分別為(12.3±1.8)%、(18.4±2.5)%,兩組比較,差異有顯著性(t=17.57、87.54,P<0.01)。

    2.3 qRT-PCR檢測外周血血小板和白細(xì)胞中miR-223表達(dá)水平

    以CG組外周血血小板或白細(xì)胞中miR-223相對表達(dá)水平為1,TG組外周血血小板中miR-223表達(dá)水平為6.2±0.52,而外周血白細(xì)胞中miR-223表達(dá)水平為5.4±0.56,兩組比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.62、4.32,P<0.05)。

    2.4 含miR-223抑制因子的慢病毒轉(zhuǎn)染正常人白細(xì)胞對miR-223表達(dá)的影響

    以CC組白細(xì)胞中miR-223相對表達(dá)水平為1,CI組白細(xì)胞中miR-223表達(dá)水平為0.36±0.04,兩組比較,差異有顯著性(t=45.30,P<0.01)。

    2.5 白細(xì)胞內(nèi)miR-223表達(dá)抑制后對Iκb和p-p65及NF-κB表達(dá)的影響

    與CC組比較,TC組白細(xì)胞中Iκb蛋白表達(dá)下調(diào),p-p65蛋白表達(dá)上調(diào),CI組白細(xì)胞中Iκb蛋白表達(dá)上調(diào),p-p65蛋白表達(dá)下調(diào);與CI組比較,TI組白細(xì)胞中Iκb蛋白表達(dá)下調(diào),p-p65蛋白表達(dá)上調(diào)。Ikkb和NF-κB蛋白表達(dá)在不同處理組間無明顯變化。見圖1。

    ①CC組;②TC組;③CI組;④TI組。

    3 討 論

    Fontan術(shù)后血栓栓塞是病兒重要的死亡原因之一,主要和血管內(nèi)皮受損、血管平滑肌增生和血小板活化等有關(guān)[3-5]。由于部分血栓栓塞無明顯臨床癥狀,故其真實發(fā)生率難以估計[6-7]。MONAGLE等[8]分析了多中心資料估測發(fā)生率為3%~16%,KHAIRY等[9]分析波士頓兒童醫(yī)院261例病例發(fā)現(xiàn),F(xiàn)ontan術(shù)后因血栓導(dǎo)致的死亡10年時為1%~3%,25年時則高達(dá)9%~12%。并發(fā)現(xiàn)術(shù)后未應(yīng)用抗凝或抗血小板治療是血栓栓塞性死亡的獨立危險因素。

    最近研究顯示,miRNA可作為血管損傷的標(biāo)志物,miRNA是高度保守的短鏈核糖核酸,廣泛參與調(diào)控基因表達(dá)[10-11],其中miR-126、miR-21、miR-663與血管內(nèi)皮損傷有關(guān)[12-13];miR-153、miR-145/143、miR-223等可反映血管內(nèi)皮增生的情況[14-15],在血管狹窄的過程中胰島素樣生長因子1受體(ILGF1R)使血管平滑肌細(xì)胞增生,此時miR-223以及miR-153表達(dá)下調(diào)[16]。LAFFONT等[17]發(fā)現(xiàn)miR-223在血小板活化過程中高表達(dá),可以作為凝血因子激活的指標(biāo)。

    本研究結(jié)果顯示,TG組病兒血清中miR-223表達(dá)水平較CG組明顯升高,當(dāng)其升高時,血小板活化率也同時增強(qiáng)。血小板活化后,可釋放一些凝血因子如ADP、血栓素等,可促進(jìn)血栓的形成[18]。此外,血小板中還含有豐富的miRNA[19],進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)TG組病兒血小板和白細(xì)胞中miR-223表達(dá)增多,此時白細(xì)胞中NF-κB信號途徑中的Iκb蛋白表達(dá)下調(diào),p-p65蛋白表達(dá)上調(diào),通過慢病毒轉(zhuǎn)染抑制白細(xì)胞中miR-223的表達(dá),CI組表現(xiàn)為Iκb蛋白表達(dá)上調(diào),p-p65蛋白表達(dá)下調(diào),但TI組與之相比,表現(xiàn)為Iκb蛋白表達(dá)下調(diào),p-p65蛋白表達(dá)上調(diào),說明白細(xì)胞中miR-223抑制后Iκb蛋白表達(dá)上調(diào),p-p65蛋白表達(dá)下調(diào)。因此推測單心室行Fontan術(shù)后病兒白細(xì)胞中miR-223高于正常人,可造成Iκb蛋白表達(dá)水平降低而p-p65蛋白表達(dá)水平升高,繼而激活NF-κB信號通路,導(dǎo)致進(jìn)一步病理生理改變。

    NF-κB蛋白家族是一種多效性的轉(zhuǎn)錄因子,可以與多種基因啟動子部位的κb位點發(fā)生特異性結(jié)合從而促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄表達(dá)。NF-κB為p50/p65異源二聚體,Iκbα和Iκbβ主要與含有p65和Rel的二聚體具有高親和力,是體內(nèi)NF-κB(p50-p65)的主要調(diào)控抑制蛋白。當(dāng)細(xì)胞受到各種內(nèi)外刺激后,Iκb激酶被激活,從而導(dǎo)致Iκb蛋白磷酸化、泛素化,然后Iκb蛋白被降解,使NF-κB二聚體得到釋放。釋放后的NF-κB二聚體通過各種翻譯后的修飾作用而被進(jìn)一步激活,并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中。在細(xì)胞核里與目的基因結(jié)合,促進(jìn)目的基因的轉(zhuǎn)錄[20-21]。Fontan術(shù)后病兒外周血白細(xì)胞中Iκb降低,使白細(xì)胞內(nèi)NF-κB活化,其活化后通過ICAM-1、VCAM-1與白細(xì)胞表面的配體相應(yīng)地結(jié)合,介導(dǎo)白細(xì)胞貼壁黏附、聚集、浸潤,導(dǎo)致局部炎癥發(fā)生,從而使微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷[22-23]。此外,NF-κB活化可促進(jìn)血管性血友病因子(vWF)的表達(dá)。vWF是Ⅷ因子的相關(guān)因子,與Ⅷ因子結(jié)合,能有效防止Ⅷ因子在血漿中迅速降解。vWF與Ⅷ因子結(jié)合,組成FⅧ/vWF,一端與血小板糖蛋白Ib結(jié)合,另一端與內(nèi)皮細(xì)胞下的膠原纖維連接,介導(dǎo)血小板黏附血管內(nèi)皮,促進(jìn)微血栓形成[24-25]。本實驗結(jié)果顯示,F(xiàn)ontan術(shù)后血流動力學(xué)改變可能激活I(lǐng)κb激酶,從而使Iκb蛋白被降解,繼發(fā)引起NF-κB活化,造成血管內(nèi)皮損傷和微血栓形成,這可能是Fontan術(shù)后血栓形成較重要的原因。

    但NF-κB活化后,如何調(diào)節(jié)細(xì)胞核基因的轉(zhuǎn)錄并對血栓形成造成影響,其具體機(jī)制本研究未涉及,未來尚需進(jìn)一步深入研究探討。

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