核酸檢測(cè)聯(lián)合酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)在獻(xiàn)血者血液感染性指標(biāo)篩查中的應(yīng)用

孫春玲

(周口市中心血站檢驗(yàn)科,河南 周口466000)

為保障臨床輸血安全,多年來(lái)我國(guó)采供血機(jī)構(gòu)采用兩種不同廠家酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑對(duì)獻(xiàn)血者血液標(biāo)本進(jìn)行乙型肝炎表面抗原(HBs Ag)、丙型肝炎抗體(抗-HCV)、人類(lèi)免疫缺陷病毒抗體(抗-HIV)等血清學(xué)項(xiàng)目檢測(cè),但由于窗口期感染、病毒核酸變異以及隱匿性感染等因素,使得部分獻(xiàn)血者血液雖經(jīng)血清學(xué)檢測(cè)合格后仍然存在感染乙型肝炎、丙型肝炎和艾滋病的風(fēng)險(xiǎn)[1]。依據(jù)《血站技術(shù)操作規(guī)程(2015)》(國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委關(guān)于印發(fā)血站技術(shù)操作規(guī)程(2015版)的通知.國(guó)衛(wèi)醫(yī)發(fā)〔2015〕95號(hào))要求,自2016年3月1日始我國(guó)采供血機(jī)構(gòu)對(duì)獻(xiàn)血者血液標(biāo)本全面實(shí)施ELISA和核酸檢測(cè)(NAT)兩種方法聯(lián)合檢測(cè),以降低經(jīng)輸血傳播乙型肝炎、丙型肝炎和艾滋病的風(fēng)險(xiǎn)。本文回顧分析64 420例獻(xiàn)血者的實(shí)驗(yàn)室篩查資料,為提高血液質(zhì)量及確保輸血安全提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇周口市中心血站2016年3月至2017年4月采集的無(wú)償獻(xiàn)血者血液標(biāo)本64 420例為研究對(duì)象,其中男30 790例,女33 630例,年齡18～60歲,中位年齡32歲；初次獻(xiàn)血39 940例,重復(fù)獻(xiàn)血24 480例。所有獻(xiàn)血者均符合獻(xiàn)血者健康檢查要求[2],均簽署自愿獻(xiàn)血協(xié)議書(shū)。

1.2 檢測(cè)試劑與儀器

檢測(cè)試劑：初檢HBs Ag、抗-HCV、梅毒螺旋體抗體(抗-TP)、抗-HIV ELISA試劑由珠海麗珠生物技術(shù)有限公司提供,復(fù)檢 HBs Ag、抗-HCV、抗-TP、抗-HIV ELISA試劑由廈門(mén)新創(chuàng)生物技術(shù)有限公司提供；初檢、復(fù)檢丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)檢測(cè)試劑盒分別由貝克曼庫(kù)爾特實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(蘇州)有限公司和上海科華生物工程股份有限公司提供；HBV/HCV/HIV三聯(lián)合核酸提取試劑和檢測(cè)試劑由上海浩源生物科技有限公司提供。ELISA法和NAT質(zhì)控品均由北京萬(wàn)泰生物科技有限公司提供。試劑和質(zhì)控品均批批檢合格并在有效期內(nèi)使用。主要血清學(xué)檢測(cè)儀器：初檢儀器主要是瑞士RSP 150加樣系統(tǒng)和德國(guó)BEPⅢ第三代全自動(dòng)酶免系統(tǒng),復(fù)檢儀器主要是MF-FA ME24/30全自動(dòng)酶免系統(tǒng),ALT檢測(cè)設(shè)備為貝克曼AU480型全自動(dòng)生化分析儀。NAT檢測(cè)儀器：Chi TaS BSS1200系統(tǒng)、HAMILTON-EZbead系統(tǒng)和ABI7500全自動(dòng)PCR擴(kuò)增分析儀。所有檢測(cè)設(shè)備均經(jīng)過(guò)廠家校驗(yàn),且均可良好運(yùn)行。

1.3 ELISA和NAT檢測(cè)方法

1.3.1 標(biāo)本留取

采集獻(xiàn)血者靜脈血于兩支試管(每管5 mL血樣),1支為EDTAK2抗凝管,用于 HBs Ag、抗-HCV、抗-TP、抗-HIV和ALT血清學(xué)檢測(cè)；另1支為含分離膠、無(wú)菌、無(wú)RNA酶和無(wú)DNA酶的真空采血管,用于HBV-DNA、HCV-RNA和HIV-RNA檢測(cè)。標(biāo)本留取后在2～8℃環(huán)境保存,核酸試管采集血樣后4 h內(nèi)完成離心、分離出血漿并在72 h內(nèi)完成HBV-DNA、HCV-RNA和HIV-RNA檢測(cè)。

1.3.2 ELISA 檢測(cè)

64 420例無(wú)償獻(xiàn)血者標(biāo)本均使用兩種不同廠家的試劑檢測(cè),每批實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照孔、陰性對(duì)照孔、陽(yáng)性對(duì)照孔、室內(nèi)質(zhì)控孔,完成HBs Ag初、復(fù)檢檢測(cè),初檢和復(fù)檢由不同人員操作。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：S/CO(樣本吸光度值/臨界值)≥1.0判為陽(yáng)性,0.7＜S/CO＜1.0判為灰區(qū),S/CO≤0.7判為陰性。抗-HIV檢測(cè)為陽(yáng)性標(biāo)本送至周口市疾病預(yù)防控制中心HIV確認(rèn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行確認(rèn)。

1.3.3 NAT 檢測(cè)

將ELISA檢測(cè)為陰性的無(wú)償獻(xiàn)血者標(biāo)本,每8個(gè)標(biāo)本混為一個(gè)混樣池,且均設(shè)定內(nèi)標(biāo)對(duì)照?；鞓訙y(cè)定無(wú)反應(yīng)判為陰性,混樣測(cè)定有反應(yīng)時(shí)予以拆分檢測(cè),拆分后無(wú)反應(yīng)者判為陰性,拆分后有反應(yīng)者判為陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件包分析數(shù)據(jù),比較采用χ2檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)a＝0.05,以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

在64 420例獻(xiàn)血者中ALT、HBs Ag、抗-HCV、抗-HIV和抗-TP血清學(xué)檢測(cè)共1362項(xiàng)不合格,其中ALT不合格220項(xiàng),在以上1362項(xiàng)不合格中,21例存在兩項(xiàng)指標(biāo)重疊感染,因而共計(jì)1341例獻(xiàn)血者血清學(xué)檢測(cè)不合格,63 079例獻(xiàn)血者血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果合格。64 420 例獻(xiàn)血者 HBs Ag、抗-HCV、抗-HIV和抗-TP檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 64 420例獻(xiàn)血者HBs Ag、抗-HCV、抗-HIV和抗-TP檢測(cè)結(jié)果

2.2 血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果合格獻(xiàn)血者NAT檢測(cè)情況

在血清學(xué)檢測(cè)均合格的63 079例獻(xiàn)血者中,檢出HBV-DNA陽(yáng)性57例(0.09%),HIV-RNA陽(yáng)性1例,未檢出HCV-RNA陽(yáng)性獻(xiàn)血者。

2.3 HBs Ag(－)/HBV-DNA(＋)獻(xiàn)血員分布情況

在血清學(xué)檢測(cè)均合格的63 079例獻(xiàn)血者中,HBV-DNA陽(yáng)性檢出率男性和女性比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；初次獻(xiàn)血與重復(fù)獻(xiàn)血者比較及不同年齡段獻(xiàn)血者比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05,P＜0.01)。見(jiàn)表2。

表2 63 079例獻(xiàn)血者中HBV-DNA檢測(cè)陽(yáng)性/HBs Ag陰性獻(xiàn)血員分布情況

3 討論

目前輸血及血液制品是臨床疾病治療不可替代的重要措施,多年來(lái),采供血機(jī)構(gòu)一直采用血清學(xué)技術(shù)檢測(cè)輸血相關(guān)病毒標(biāo)志物的抗原或抗體,極大地降低了經(jīng)輸血傳播乙型肝炎、丙型肝炎等感染性疾病,但由于試劑靈敏度、窗口期感染、病毒基因變異、免疫靜默、隱匿性感染等諸多因素存在[3],有極少部分獻(xiàn)血者血液雖經(jīng)ELISA法檢測(cè)合格,輸注患者后仍然可引起乙型肝炎、丙型肝炎、艾滋病等感染性疾病的傳播。雖然ELISA檢測(cè)試劑盒的靈敏度、特異性在不斷提高,但仍相繼有不同文獻(xiàn)報(bào)道經(jīng)輸血傳播肝炎、HIV的案例[4-6],給患者的健康造成極大危害。

ELISA法檢測(cè)是以抗原、抗體作為檢測(cè)對(duì)象,曾勁峰等[7]研究顯示,約70%的HCV和90%的HIV、HBV ELISA法漏檢是由窗口期感染引起,此時(shí)ELISA法常檢測(cè)不出來(lái)而造成漏檢,而NAT檢測(cè)可將HCV、HBV和HIV的窗口期分別縮短82%(59 d)、20%(9 d)和50%(11 d)。NAT 是一種具有較高特異性和敏感性的免疫學(xué)檢測(cè)方法,其通過(guò)核酸擴(kuò)增技術(shù)捕獲獻(xiàn)血者血液標(biāo)本中較早出現(xiàn)的病毒核酸,可檢出因病毒變異、窗口期感染ELISA法漏檢的標(biāo)本[8],并且具有操作過(guò)程簡(jiǎn)便、易于自動(dòng)化、核酸標(biāo)本回收率高等優(yōu)勢(shì),適于采供血機(jī)構(gòu)對(duì)獻(xiàn)血者標(biāo)本進(jìn)行大規(guī)模篩查。

本研究中,63 079例經(jīng)血清學(xué)檢測(cè)HBs Ag、抗-HCV、抗-HIV呈陰性獻(xiàn)血者中,應(yīng)用上海浩源Chi Tas 1200核酸檢測(cè)篩查出57份(0.09%)HBV-DNA陽(yáng)性,高于林紅等[9]報(bào)道的0.06%陽(yáng)性率,這可能與本地區(qū)是乙型肝炎的高流行病區(qū)域,自然人群中乙型肝炎的感染率較高有關(guān)。HBV血清轉(zhuǎn)換前窗口期與隱匿性乙肝病毒感染(OBI)獻(xiàn)血者是導(dǎo)致HBs Ag篩查后輸血傳播感染HBV殘余風(fēng)險(xiǎn)的主要原因[10]。HBV窗口期感染與隱匿性乙肝病毒感染的獻(xiàn)血者均為血清HBs Ag陰性、HBV-DNA陽(yáng)性,HBV窗口期感染獻(xiàn)血者HBs Ag會(huì)隨著時(shí)間推移由陰性轉(zhuǎn)換為陽(yáng)性,而OBI獻(xiàn)血者其HBs Ag一般不會(huì)轉(zhuǎn)換為陽(yáng)性,通常伴隨抗-HBc陽(yáng)性,但部分低滴度抗-HBs獻(xiàn)血者中也會(huì)存在[11]。河南省是HCV高發(fā)地區(qū),1～75歲自然人群中HCV陽(yáng)性率高于全國(guó)平均水平[12],但本文并未檢出HCV-RNA,這可能與HCV主要感染肝細(xì)胞,當(dāng)肝細(xì)胞壞死后方可釋放HCV進(jìn)入血液中有關(guān)?？贵w產(chǎn)生通常伴隨HCV感染且抗-HCV比較穩(wěn)定,而HCV-RNA在4℃或室溫易被環(huán)境中RNA酶降解,其只有在－20℃以下環(huán)境保存時(shí)比較穩(wěn)定,因此HCV-RNA檢測(cè)并不能完全代替以往的ELISA篩查,兩種方法互補(bǔ)檢測(cè)才能更好地提高血液質(zhì)量。

此外,本研究結(jié)果顯示,在63 079例血清學(xué)檢測(cè)合格獻(xiàn)血者中,不同性別獻(xiàn)血者HBV-DNA陽(yáng)性率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),而在不同年齡段分組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),≥49歲年齡段獻(xiàn)血者HBV-DNA陽(yáng)性率最高(0.26%),18～22歲年齡段獻(xiàn)血者陽(yáng)性率最低(0.03%),這可能與隨獻(xiàn)血者年齡增長(zhǎng)其機(jī)體免疫功能逐漸下降相關(guān)[11]；我國(guó)自20世紀(jì)90年代開(kāi)始將乙型肝炎疫苗納入新生兒計(jì)劃免疫,因而18～22歲年齡段獻(xiàn)血者乙肝疫苗接種率較高,此年齡段獻(xiàn)血者HBV-DNA陽(yáng)性率較低。重復(fù)獻(xiàn)血人群HBV-DNA陽(yáng)性率高于初次獻(xiàn)血人群,這可能與低病毒載量的重復(fù)獻(xiàn)血者經(jīng)過(guò)多次NAT檢測(cè),增加了HBV-DNA檢出的概率；另外,由于重復(fù)獻(xiàn)血人群長(zhǎng)期堅(jiān)持獻(xiàn)血,這部分獻(xiàn)血者年齡普遍較初次獻(xiàn)血者大,這也與表2中獻(xiàn)血者HBV-DNA陽(yáng)性檢出率與年齡相關(guān)相映襯。

綜上所述,ELISA篩查獻(xiàn)血者血液標(biāo)本存在一定的漏檢現(xiàn)象,NAT檢測(cè)可有效降低經(jīng)輸血傳播乙型肝炎、丙型肝炎、艾滋病的風(fēng)險(xiǎn),從而提高血液質(zhì)量和臨床輸血安全。