乳源β-酪啡肽-7對(duì)老年小鼠腸黏膜氧化應(yīng)激的影響

印虹，劉冀婕，楊丹，彭景

（揚(yáng)州大學(xué)旅游烹飪學(xué)院，江蘇揚(yáng)州225127）

0 引 言

衰老是人類生活的一個(gè)自然生理過程，關(guān)于衰老的機(jī)理，以Harm an[1]提出的自由基學(xué)說最具有代表性。機(jī)體通過酶系統(tǒng)與非酶系統(tǒng)產(chǎn)生氧自由基，氧自由基通過生物膜中的多不飽和脂肪酸的過氧化引起細(xì)胞損傷，產(chǎn)生大量代謝產(chǎn)物丙二醛（m alondialdehyde，M DA），可引起細(xì)胞代謝及功能障礙，加速機(jī)體衰老。但機(jī)體存在直接清除自由基，抑制自由基的生成或是激活機(jī)體抗氧化體系的自由基清除劑。除此之外還有一些非酶抗氧化劑。

β-酪啡肽-7（β-Casom orphin-7，BCM-7）是一種來源于牛乳或人乳β-酪蛋白的小分子多肽，已有研究證實(shí)β-酪啡肽具有多種生物學(xué)功效[2,3]。在β-酪啡肽中，又以BCM-7和BCM-5的生物活性最強(qiáng)[4]。有研究表明糖尿病大鼠口服BCM-7可增加血漿胰島素水平，降低胰高血糖素水平，提高超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的活性[5]。本研究以老年小鼠為模型，觀察β-酪啡肽-7對(duì)老年小鼠小腸黏膜氧化應(yīng)激的影響，為其進(jìn)一步研究及開發(fā)利用乳源生物活性物質(zhì)提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料、動(dòng)物與試劑

β-酪啡肽-7，干粉，-20℃保存，實(shí)驗(yàn)時(shí)以生理鹽水配制成相應(yīng)濃度的溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

SPF級(jí)昆明小鼠，雄性，十一月齡40只（體質(zhì)量53～69 g），二月齡10只（體質(zhì)量39～50 g，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（滬）2013-0006）。

超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛（M DA）及過氧化氫酶（CAT）、蛋白定量測(cè)試試劑盒。

1.2 儀器與設(shè)備

755S紫外分光光度計(jì)，全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，A llegra X-22R臺(tái)式冷凍離心機(jī)，BSA 224S電子分析天平。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組與處理

40只老年雄性昆明小鼠、10只青年雄性昆明小鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，無不良反應(yīng)，飲食飲水正常，體質(zhì)量、體溫、被毛、大小便及活動(dòng)正常者納入實(shí)驗(yàn)。將36只老年雄性昆明小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為低劑量組、中劑量組、高劑量組、模型對(duì)照組，每組9只；9只青年雄性昆明小鼠設(shè)為空白對(duì)照組。低、中、高劑量組每只每天灌胃β-酪啡肽-7溶液0.5 m L，濃度分別為2×10-7，1×10-6，5×10-6mol/L；空白對(duì)照組和模型對(duì)照組按等體積質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的生理鹽水連續(xù)灌胃30 d，于末次用藥后，禁食不禁水12 h，頸椎脫臼處死，取小腸黏膜組織進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)。

1.3.2 樣品的采集與處理

小鼠頸椎脫臼處死，沿腹部正中線切開，取靠近十二指腸段空腸約2 cm腸段，刮取腸黏膜，用濃度為0.01 mm o l/L的PBS（pH值為7.4，含濃度為0.01 mm ol/L苯甲基磺酰氟（PM SF）漂洗后，-70℃保存。測(cè)定時(shí)，準(zhǔn)確稱取組織重量，加入9倍生理鹽水制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的勻漿，在轉(zhuǎn)速為3 500 r/min下離心10min，取上清液，-20℃保存，待測(cè)。

1.3.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

分光光度法測(cè)定CAT和MDA含量，W ST-1法測(cè)定SOD活性，具體步驟按試劑盒說明操作。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果用x±s表示，數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析，以P＜0.05判定為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 β-酪啡肽-7對(duì)老年小鼠腸黏膜抗氧化功能的影響

由表1可以看出，模型對(duì)照組小鼠腸黏膜SOD活性顯著低于空白對(duì)照組（P＜0.01）；劑量組與模型組相比，低劑量組與中劑量組SOD活性都顯著升高（P＜0.01），并且低劑量組比中劑量組升高較多，兩組之間也存在顯著性差異（P＜0.01），高劑量組SOD活性略低于模型對(duì)照組。

表1 β-酪啡肽-7對(duì)小鼠腸黏膜抗氧化功能的影響（n=9）

模型對(duì)照組小鼠腸黏膜M DA含量顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.01）；劑量組與模型組相比，低劑量組與中劑量組MDA含量都具有下降趨勢(shì)，并存在差異性（P＜0.05），高劑量組M DA含量顯著低于模型對(duì)照組（P＜0.01）。

模型對(duì)照組小鼠腸黏膜CAT活性顯著低于空白對(duì)照組（P＜0.01）；劑量組與模型組相比，低劑量組CAT活性顯著升高（P＜0.01），并且低劑量組比中劑量組升高較多，中、高劑量組CAT活性有升高趨勢(shì)，但差異不具有顯著性（P＞0.05）。

3 討論

腸道為機(jī)體提供了一道天然防御屏障[6],營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)并刺激腸黏膜上皮細(xì)胞，促進(jìn)腸黏膜上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)和修復(fù)，有助于維持腸黏膜上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的完整性，保護(hù)腸黏膜屏障功能[7]。酪蛋白在胃腸道消化酶的作用下,這些生物活性肽被釋放出來,在調(diào)節(jié)胃腸道運(yùn)動(dòng)、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、清除自由基等方面發(fā)揮著重要作用[8-10]。

正常情況下，機(jī)體產(chǎn)生和清除自由基的能力保持平衡。但是隨著年齡的增長(zhǎng)，新陳代謝異常，出現(xiàn)各種代謝綜合征[11]，使自由基大量產(chǎn)生，氧化和抗氧化平衡狀態(tài)受到破壞。

丙二醛（MDA）是脂質(zhì)過氧化作用而形成的的降解物[7]，測(cè)定其含量可反映機(jī)體組織氧化損傷的程度。由表1可知，老年小鼠腸黏膜M DA含量顯著高于青年小鼠（P＜0.01），說明老年機(jī)體腸黏膜處于氧化應(yīng)激的狀態(tài)。低劑量組與中劑量組MDA含量都具有下降趨勢(shì)（P＜0.05），高劑量組MDA含量顯著低于模型對(duì)照組（P＜0.01）。印虹[12]的研究表明β-CM-7可以顯著降低高血糖大鼠小腸黏膜M DA含量，緩解高血糖氧化應(yīng)激對(duì)小腸黏膜的損傷，且高劑量組效果更明顯，這與本研究結(jié)果一致。說明β-酪啡肽-7具有抑制MDA對(duì)機(jī)體組織造成損傷的作用，可以減輕老年機(jī)體氧化應(yīng)激的水平。

超氧化物歧化酶（SOD）是超氧陰離子的特異清除劑，SOD的含量可以間接反映清除氧自由基的能力[13]。由表1可知，老年小鼠小腸黏膜SOD活性顯著低于青年小鼠腸黏膜SOD活性（P＜0.01），顯示老年小鼠抗氧化能力減弱。低、中劑量組能顯著提高SOD活性（P＜0.01），說明β-酪啡肽-7能上調(diào)小腸黏膜SOD活力，增強(qiáng)其抗氧化應(yīng)激的能力。Yin[5]的研究表明β-CM-7可以通過上調(diào)高血糖大鼠小腸黏膜SOD活性，緩解高血糖氧化應(yīng)激對(duì)小腸黏膜的損傷，本研究也表明β-CM-7可以通過上調(diào)腸黏膜SOD活性。另外，低劑量組提高SOD活性效果比中、高劑量好，這與胡文琴[10]、趙亮[14]等人的研究結(jié)果不一致，其具體原因還需進(jìn)一步探究。

過氧化氫酶（CAT）可以緩解過氧化氫對(duì)機(jī)體的損傷，也可以代表機(jī)體的抗氧化能力。由表1可知，老年小鼠腸黏膜CAT活性顯著低于青年小鼠（P＜0.01）；低劑量組能顯著提升小腸黏膜CAT活性（P＜0.01），說明β-酪啡肽-7能提高小腸黏膜的CAT活性，增強(qiáng)其抗氧化應(yīng)激的能力。Y in[5]的研究表明β-CM-7可以通過上調(diào)高血糖大鼠小腸黏膜CAT活力，緩解高血糖引起的氧化應(yīng)激，而本研究也表明β-CM-7可以通過上調(diào)小腸黏膜CAT活力。但是低劑量組提升小腸黏膜CAT活性比高劑量組效果較好的具體原因尚未明確，還需進(jìn)一步探究。

4 結(jié) 論

機(jī)體衰老可以導(dǎo)致小腸黏膜處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，而β-CM-7可以通過顯著提高小腸黏膜SOD、CAT等抗氧化應(yīng)激酶的活性，降低小腸黏膜中MDA的含量，減少過氧化引起的細(xì)胞損傷，增強(qiáng)小腸黏膜抗氧化應(yīng)激的能力，提示β-CM-7對(duì)老年動(dòng)物小腸黏膜有一定的保護(hù)作用，為接下來研究β-CM-7對(duì)老年動(dòng)物小腸黏膜免疫的影響，探究黏膜免疫與自由基老化之間的關(guān)系提供了一定的基礎(chǔ)。