花藥培養(yǎng)技術(shù)在小麥種質(zhì)資源創(chuàng)制及育種中的應(yīng)用

王 煒 葉春雷 楊隨莊 陳 琛 羅俊杰

（1甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，蘭州 730070；2西南科技大學(xué)小麥研究所，綿陽 621010）

花藥培養(yǎng)是指將發(fā)育到特定階段的花藥給予一定的預(yù)處理，利用無菌操作技術(shù)將其接種至培養(yǎng)基上，在特定的溫度、光照等環(huán)境條件的誘導(dǎo)下，使其偏離正常的花粉發(fā)育途徑，不形成配子，而是如體細(xì)胞一樣分裂分化，最終形成單倍體植株的一種培養(yǎng)方法。單倍體植株可經(jīng)自然或人工加倍后形成純合材料，這使得雜交后代分離的時間得到縮短，因此這項(xiàng)技術(shù)自誕生以來，就受到了育種家的重視。1964年，印度學(xué)者Guha率先在曼陀羅上通過花藥培養(yǎng)獲得了單倍體植株。在此后的20多年間，該技術(shù)在多國科學(xué)家的努力下得到蓬勃發(fā)展，先后在200多種植物中獲得成功，獲得了一大批小麥、大麥、水稻、油菜、辣椒等重要農(nóng)作物的種質(zhì)資源，并育成若干在生產(chǎn)上大面積應(yīng)用的品種[1-2]。我國在小麥花藥培養(yǎng)技術(shù)的研究和應(yīng)用方面一直處于國際前列，目前在小麥花藥培養(yǎng)中應(yīng)用最廣泛的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基N6、C17、W14、癸等均為我國科學(xué)家所研制[3-5]。第一個在世界上大面積應(yīng)用種植的小麥花培品種京花1號則是在1984年由北京農(nóng)林科學(xué)院的胡道芬等[6]育成的；此后花培764、花培1號、京花3號等多個累計(jì)推廣超過百萬畝的花培品種的育成，彰顯了我國在花藥培養(yǎng)技術(shù)方面的卓越成就。目前以小麥、水稻等作物花藥培養(yǎng)為代表的花培育種技術(shù)已成為生物技術(shù)應(yīng)用于育種實(shí)踐的重要組成部分。

1 小麥花培育種的優(yōu)點(diǎn)

利用花藥培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行新品種選育的方法，一般簡稱為花培育種；利用該技術(shù)育成的品種，則簡稱為花培品種。與常規(guī)雜交育種技術(shù)相比，小麥花培育種由于省去了雜交后代群體分離的時間，因此至少縮短育種時間3年（表1）；同時相應(yīng)提高了選擇效率，研究表明經(jīng)花培育成審定品種的選擇效率是同期常規(guī)育種的3.22倍[7]。

表1 小麥花培育種與常規(guī)雜交育種進(jìn)程比較

2 花藥培養(yǎng)技術(shù)在小麥種質(zhì)資源創(chuàng)制中的應(yīng)用

種質(zhì)資源的創(chuàng)制是育種中的基礎(chǔ)性工作，豐富的種質(zhì)資源對于加快新品種選育具有良好的支撐和推動作用，因而許多育種家歷來都很重視這項(xiàng)工作?；ㄋ幣囵B(yǎng)一般情況下并不會產(chǎn)生變異，然而由于其能夠縮短變異后代的分離時間、減少檢測世代的數(shù)量，從而提高工作效率，因此花藥培養(yǎng)技術(shù)與種質(zhì)資源創(chuàng)制方法的有機(jī)結(jié)合，可快速獲得育種家所需的性狀變異材料。

2.1 與常規(guī)育種技術(shù)結(jié)合創(chuàng)制新種質(zhì)花藥培養(yǎng)技術(shù)與常規(guī)育種技術(shù)（雜交、回交、復(fù)交等）相結(jié)合，可快速獲得各類抗病、優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)的種質(zhì)材料。馬鴻翔等[8]采用多個抗源復(fù)合雜交與花藥培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合的方法，創(chuàng)制出了穩(wěn)定對赤霉病、白粉病和紋枯病3種病害兼抗的種質(zhì)材料；黃冰艷等[9]利用該技術(shù)在較短的時間內(nèi)創(chuàng)制出了一批具有矮稈、早熟、抗病、高蛋白以及綜合性狀優(yōu)良的小麥新種質(zhì)；王成社[10]則在1～2年的時間內(nèi)培育出了6個黑糯小麥和4個抗條銹病小麥材料；海燕等[11]相繼創(chuàng)制小麥新種質(zhì)1100余份，并應(yīng)用其中5份種質(zhì)培育出了4個小麥新品種。

2.2 小麥遠(yuǎn)緣雜交結(jié)合創(chuàng)制新種質(zhì)遠(yuǎn)緣雜交是引進(jìn)外源基因并進(jìn)行種質(zhì)創(chuàng)制的常用方法之一，但后代往往會瘋狂分離，且目前尚無對這種分離進(jìn)行有效人工控制的技術(shù)，因此大多數(shù)后代均需較長世代才可穩(wěn)定，而通過花藥培養(yǎng)技術(shù)可有效縮短后代分離的時間。翁躍進(jìn)等[12]對普通小麥與頂芒山羊草的雜交后代進(jìn)行了花藥培養(yǎng)，創(chuàng)制出了6份異源附加系；陸瑞菊等[13]通過花藥培養(yǎng)與遠(yuǎn)緣雜交相結(jié)合的方法選育出了1份雙重二體異附加系和2份代換-附加系；聶道泰等[14]通過花藥培養(yǎng)技術(shù)獲得了若干小麥抗條銹病和黃矮病新種質(zhì)；賈旭等[15]通過對普通小麥與中間偃麥草的雜交后代進(jìn)行花藥培養(yǎng)，相繼創(chuàng)制了103個抗病種質(zhì)，其中兼抗3種以上病害的有29份。

2.3 與誘變技術(shù)結(jié)合創(chuàng)制新種質(zhì)包含航天育種、輻射誘變、化學(xué)誘變等在內(nèi)的誘發(fā)突變技術(shù)是種質(zhì)資源創(chuàng)制中重要的方法，得到相關(guān)研究者的廣泛應(yīng)用。但突變體在早期世代經(jīng)常是以雜合狀態(tài)或呈嵌合體狀態(tài)出現(xiàn)，一般需要4～6代才能獲得穩(wěn)定純合的突變體，而采用花藥培養(yǎng)技術(shù)只需2～3代即可。宣樸等[16]利用Co-γ輻射誘變技術(shù)與花藥培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合的方法，創(chuàng)制出了6112、7419、H203等小麥新種質(zhì)；劉錄祥等[17]則將核輻射誘變技術(shù)與花藥培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合，創(chuàng)制了J33、YS1Z7、H89等多個耐鹽小麥新種質(zhì)；Zhao 等[18]通過該方法創(chuàng)制出了在農(nóng)藝性狀和花藥培養(yǎng)特性方面均表現(xiàn)良好的小麥新品系H307，該品系在千粒重、株高和綠苗產(chǎn)率等方面均超過國外相似研究所獲得的材料。

2.4 與轉(zhuǎn)基因技術(shù)結(jié)合創(chuàng)制新種質(zhì)近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，轉(zhuǎn)基因技術(shù)成為作物種質(zhì)資源創(chuàng)制及培育品種方面具有巨大開發(fā)應(yīng)用潛力的新技術(shù)。在小麥轉(zhuǎn)基因研究中，采用花藥培養(yǎng)技術(shù)將獲得的單倍體材料作為轉(zhuǎn)化受體，經(jīng)染色體加倍后，外源基因可迅速純合并能夠穩(wěn)定遺傳，該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是外源基因可免受等位基因干擾，且轉(zhuǎn)基因植株不存在顯隱性，因此引起了一些研究者的關(guān)注，并進(jìn)行了有益的探索[19-20]。在基于農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的轉(zhuǎn)基因研究中，結(jié)合花藥培養(yǎng)技術(shù)，張艷敏等[21]成功地獲得了攜帶甜菜堿醛脫氫酶和膽堿氧化物酶等外源基因的轉(zhuǎn)基因再生植株；Chauhan等[22]則獲得了可穩(wěn)定表達(dá)抗旱基因HVA1的轉(zhuǎn)化植株。在基于基因槍法和花藥培養(yǎng)相結(jié)合的小麥轉(zhuǎn)基因研究中，史勇[23]獲得了經(jīng)PCR檢測為陽性的3個轉(zhuǎn)基因植株；高潔等[24]則通過系統(tǒng)研究，獲得了基因槍轉(zhuǎn)化小麥花藥的最佳參數(shù)組合，同時獲得了在T0純合的轉(zhuǎn)基因植株。

3 花藥培養(yǎng)技術(shù)在小麥育種中的應(yīng)用

小麥花培育種經(jīng)過將近半個世紀(jì)的發(fā)展，目前已被認(rèn)為是常規(guī)育種的重要補(bǔ)充[25]，被多個研究單位應(yīng)用于育種實(shí)踐中，先后育成了京花1號[6]、Florin[26]、花培 764[27]、北京 8686[28]、生抗 2 號[29]、花培6 號[30]、Robijs[31]、隴春 31 號[32]、京花 11 號[33]等 50多個小麥品種，并在生產(chǎn)中應(yīng)用（表2），為小麥生產(chǎn)作出了一定的貢獻(xiàn)。可以看出，我國在小麥花培育種上最為突出，處于世界領(lǐng)先地位。在歐洲，Lantos等[34]以法國、德國和匈牙利等國的多個育種實(shí)驗(yàn)室冬小麥為供試材料，對花培育種效率進(jìn)行了評估，結(jié)果表明花培育種是一種較為有效且成本低廉的育種方法。此外，劉錄祥等[17，35]、宣樸等[36-37]在世界上率先將輻射育種、航天育種與花培育種進(jìn)行了有機(jī)結(jié)合，成功建立了誘變細(xì)胞工程育種技術(shù)體系，先后育成了航麥901、航麥247、川輻5號、H6756、YS217、H89等多個小麥新品種（系）。

表2 利用花藥培養(yǎng)技術(shù)育成的小麥品種

4 小麥花培育種的主要影響因素

4.1 花培親本的選配親本選配在大部分植物的雜交育種中是決定育種工作成效的關(guān)鍵因素之一，因而育種工作者都非常重視這項(xiàng)工作。在小麥花培育種中，由于小麥花藥培養(yǎng)中存在較強(qiáng)的基因型依賴性[38]，因此除了需要考慮常規(guī)雜交育種中選配親本的一般原則之外，還需選擇雙親或雙親之一具有優(yōu)良的花藥培養(yǎng)特性，否則因產(chǎn)生的綠苗數(shù)量較少而使得育種后代群體偏小，導(dǎo)致品種選育成功的概率降低。

4.2 小麥花藥培養(yǎng)效率小麥花藥培養(yǎng)效率是影響小麥花培育種成效的必要條件之一。較低的花藥培養(yǎng)效率導(dǎo)致產(chǎn)生的綠苗數(shù)量不足，若要滿足育種需要，則需接種更多的花藥，因而會導(dǎo)致工作量增加，失去了花培育種的優(yōu)勢。國內(nèi)外的研究表明，供試材料的基因型[39-41]、預(yù)處理方式[42]、花藥中小孢子的發(fā)育時期[43]、接種密度[44]、培養(yǎng)基的組成及激素配比[44-46]、培養(yǎng)條件（光照、溫度）[2，47]等，均可對培養(yǎng)效率產(chǎn)生影響。因此，需要對這些影響小麥花藥培養(yǎng)效率的因素進(jìn)行系統(tǒng)研究，提高愈傷組織誘導(dǎo)率和綠苗生產(chǎn)率，優(yōu)化小麥花藥培養(yǎng)技術(shù)體系，不斷提高花藥培養(yǎng)效率。

4.3 田間鑒定選育小麥花培育種從工作程序上可分為花藥培養(yǎng)和田間鑒定選育兩個過程。田間鑒定選育的技術(shù)水平直接決定了能否最終選育出綜合性狀優(yōu)良的品種（系）[48]，因此花培育種者除了加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室花藥培養(yǎng)的工作外，還需特別重視觀察和鑒定花培后代材料在田間的農(nóng)藝、品質(zhì)和產(chǎn)量性狀，從中選育出符合育種目標(biāo)的材料。

5 結(jié)語

小麥花藥培養(yǎng)技術(shù)是最早應(yīng)用于育種實(shí)踐的生物技術(shù)之一，由于能夠縮短育種周期、提高育種效率，受到了育種家的廣泛注意。經(jīng)過幾代科學(xué)家的不懈努力，技術(shù)體系得到不斷優(yōu)化，培養(yǎng)效率日益提高，育成了一批品種在生產(chǎn)上推廣應(yīng)用，目前已成為生物技術(shù)應(yīng)用于育種實(shí)踐最為成功的方法，也成為常規(guī)雜交育種的重要補(bǔ)充。同時該技術(shù)還可與誘變育種、遠(yuǎn)緣雜交、分子標(biāo)記輔助選擇育種及轉(zhuǎn)基因育種等技術(shù)進(jìn)行有機(jī)結(jié)合，充分地顯示了其重要的應(yīng)用價值。然而，通過追蹤國內(nèi)外相關(guān)研究結(jié)果并結(jié)合筆者多年的研究發(fā)現(xiàn)，與常規(guī)育種相比，利用該技術(shù)育成的品種偏少。究其原因，一是從事相關(guān)研究的人員和科研單位較少，國內(nèi)外目前僅有七八家單位，從業(yè)人員不足百人；二是小麥花藥培養(yǎng)效率還較低，大部分研究中愈傷組織誘導(dǎo)率和綠苗生產(chǎn)率均在10%以下；三是與田間鑒定選育技術(shù)結(jié)合不緊密，花培育種者花了較多時間和精力放在實(shí)驗(yàn)室的花藥培養(yǎng)工作中，因而在品種選育的關(guān)鍵階段投入的精力不夠。因此，今后應(yīng)從以下方面著手，一是要不斷優(yōu)化小麥花藥培養(yǎng)技術(shù)體系，顯著提高花藥培養(yǎng)效率；二是要加強(qiáng)田間鑒定選育工作，在時間和精力不足的情況下積極與從事常規(guī)雜交育種工作的人員進(jìn)行聯(lián)合攻關(guān)；三是要加大技術(shù)骨干的培養(yǎng)力度，并加強(qiáng)技術(shù)及具有優(yōu)良花藥培養(yǎng)特性親本材料的交流。